生态毒理学：第三章 生态毒理学常用实验方法GB格式
3章-生态毒理学研究方法
种或多种污染物单独或联合存在条件下，所导致的影
响或危害。
所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个
体、种群、群落-生态系统各级水平上的反映。
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（二）毒性试验的方式 1.毒性试验的分类 根据毒性试验所经历的时间长短：短期毒性试验，中 期毒性试验和长期毒性试验。 根据试验溶液或试验气体的给予方式：静止式毒性试 验和流动式毒性试验。
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(二)荧光原位技术的基本过程
1.制备和探针标记：
常用的探针信号标记方法有两种： ①直接标记法。将荧光分子直接标记于探针DNA/RNA 上，杂交后可直接在荧光显微镜下检测。 ②间接法。采用一中间分子标记探针，杂交后再用荧 光分子标记的中间分子的亲和物或抗体进行检测。
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2.染色体原位杂交 杂交前变性处理染色体标本，使染色体DNA变为部 分单链，并去掉附着的RNA及蛋白质，变性处理生
八、RAPD技术在DNA损伤检测中的作用
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一、PCR—SSCP技术
(一)PCR—SSCP的基本原理 单链DNA由于有链内碱基配对而具有一定的空间 结构，当DNA链上的碱基(即使是一个碱基)发生 改变时，单链DNA会形成不同的构象，称为单链 构象多态性(single strand conformation
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二、荧光原位杂交技术
(一)荧光原位杂交的原理及特点
荧光原位杂交(fluorescene in situ hybridization， FISH)是20世纪80年代在原位杂交基础上建立起来的 一种高度灵敏、特异性好以及分辨率强的染色体和 基因分析技术，它通过荧光标记的各类DNA和RNA 探针与细胞或组织在玻片上进行杂交，在不改变其 结构的情况下，进行细胞内DNA、RNA某特定序列 的测定，可用于染色体识别、基因定位和基因诊断、 染色体结构畸变和数目改变分析。
环境毒理学常用实验方法
<1 1～ 50～ 500～ 50000～
<10 10～ 100～ 1000～ 10000～
兔经皮 LD50 （mg/kg）
<5 5～ 44～ 350～ 2180～
对人可能致死的估剂量
⑴g/kg 体重 ⑵g/60kg 体重
<0.05 0.05～ 0.5～ 5.0～
<0.1 3.0 30.0 250.0
計算公式
LogLD50=Xm-i(∑P-0.5)
式中Xm—最大劑量的對數值 i—相鄰劑量比值的對數 ∑P—各組死亡率的總和（以小數
表示）
急性毒性分級
為了粗略表示外源化學物急性毒性的強弱 和其對人的潛在危害程度，國際上提出了 外源化學物的急性毒性分級（acute toxicity classification）。但分級標準並 未完全統一
>15.0 >1000.0
LD50影響因素
試驗動物的內外環境各種因素的影響 試驗人員操作熟練程度 受試化學物的濃度或稀釋倍數的影響 同一外源化學物在同一品系動物和同樣
接觸途徑所測定的LD50值也會有一定差 異，甚至可有2～3倍的波動範圍
急性毒作用帶(acute effect zone，Zac)
Zac =
描述性動物實驗研究採用的體外試驗研究的模 型標本包括某些離體臟器、組織切片、原代細 胞、傳代培養細胞、組織勻漿、亞細胞組分， 甚至昆蟲、細菌等
染毒途徑和方式
經口染毒 經呼吸道染毒 經皮膚染毒 其他途徑染毒
經口染毒
➢灌胃 ➢喂飼 ➢吞咽膠囊
灌胃
❖人工給實驗動物灌入外源化學物是經常使用 的經口染毒方法。此時外源化學物直接灌入 胃內，而不與口腔及食道接觸，故而給予的 化學物劑量準確。但是，當待測化學物為氣 態或固體時均需用某種溶劑溶解，液態化學 物往往也需用溶劑溶解
生态毒理学实验
生态毒理学(大三)试验一叶绿素a和叶绿素b含量的测定 20110422一、实验目的掌握叶绿素a和叶绿素b含量的测定的方法。
二、实验原理因叶绿素a和叶绿素b溶于二甲基亚砜（DMSO），叶绿素a和叶绿素b在663nm、645nm处具特有吸收峰，测其光密度值。
根据朗伯比尔定律计算叶绿素a和叶绿素b的浓度。
三、材料用品新鲜植物叶片 721nm分光光度计 DMSO 25ml容量瓶 80%丙酮量筒四、实验步骤1称取100mg绿叶撕碎放入25ml容量瓶中，并向其加入5mlDMSO2然后将其放入65℃恒温柜中保温0.5-4h。
3待到一定时间取出后，向其加入80%丙酮溶液定容至25ml。
4取溶液于663nm、645nm条件下测定光密度值，记下实验数据。
五、实验数据处理将测得的光密度值带入下列公式中计算叶绿素a和叶绿素b的含量Ca=12.7*A663-2.69*A645Cb=22.9*A945-4.68*A663Ct=Ca+CbC(mg/g鲜重)=mg/L*总体积(L)/鲜重(g)试验三重金属铜离子对种子萌发的毒性效应一、实验原理植物种子在适宜的条件（水分、温度和氧气等）下，吸水膨胀萌发，在各种酶的催化作用下，发生一系列的生理、生化反应。
但是，当大量重金属离子存在时会抑制一些酶的活性，从而使种子萌发受到影响，破坏发芽过程，因此通过测定种子发芽情况，就可以预测和评价重金属离子对植物的潜在毒性。
二、实验目的1. 学习掌握植物种子毒性试验的方法2. 确定种子发芽率和伸长率的EC50三、材料，试剂及仪器材料：荞麦，小麦，黄豆试剂：CuSO4 ·5H2O、蒸馏水仪器：培养皿、移液管、滤纸、镊子四、实验步骤1、溶液配制硫酸铜溶液的配置：将硫酸铜按浓度梯度0（对照）、100 mg/L 1000 mg/L、5000mg/L、10000mg/L配置不同浓度的硫酸铜溶液2、种子处理种子经挑选后按每培养皿每种10粒置于垫有两层滤纸直径为6cm的玻璃培养皿,每培养皿加入10mL不同浓度的硫酸铜处理液,处理液浸透滤纸并完全浸润种子, 将培养皿盖好放入室温阳光下进行发芽试验3、观察记录每日向不同处理组添加5mL硫酸铜溶液以保持湿润。
环境毒理学常用实验方法
方法
通常将动物长期暴露于毒物，观察肿 瘤发生情况、类型和恶性程度等指标。
03
细胞培养实验方法
细胞毒性实验
01
02
03
MTT法
通过检测活细胞线粒体中 的琥珀酸脱氢酶来反映细 胞活性，评估毒物对细胞 的毒性作用。
LDH释放法
检测细胞损伤时释放的乳 酸脱氢酶，用于评估毒物 对细胞膜的损伤程度。
中性红摄取法
06
数据分析和结果解读
数据统计和分析方法
描述性统计
对数据进行整理、分类、汇总，通过图表展示数据的分布、中心 趋势和离散程度。
推论性统计
通过假设检验、方差分析等方法，推断样本数据所代表的总体特征， 评估不同处理组之间的差异显著性。
多元统计分析
运用主成分分析、聚类分析、判别分析等方法，挖掘数据间的内在 联系和规律，简化数据结构。
研究动物在长时间内暴露于低 剂量毒物后的毒性反应和潜在 危害。
方法
通常将动物长期暴露于低剂量 毒物，观察生长、发育、繁殖 和器官损害等指标。
应用
用于评估毒物的慢性毒性，了 解毒物对机体的长期影响，如 致癌、致畸、致突变等。
致癌性实验
目的
应用
研究动物在长时间内暴露于毒物后是 否诱发肿瘤。
用于评估毒物的致癌性，为环境毒理 学和公共卫生领域提供重要依据。
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分子生物学实验方法
基因毒性实验
02
01
03
单细胞凝胶电泳（彗星实验）
检测DNA链断裂，评估遗传物质损伤。
基因突变实验
通过观察基因突变频率，评估化学物质的致突变性。
报告基因实验
利用报告基因的表达变化，间接反映目标基因毒性。
蛋白表达实验
生态毒理学
生态毒理学实验实验一动物试验的一般操作技术一、目的与要求毒理学的许多试验研究，主要通过动物实验来进行。
而实验过程中技术及生物材料的收集是否恰当，直接影响实验结果的质量。
因此，毒理学实验工作者必须正确地掌握动物实验中的一般操作技术，这是保证试验工作成功的基本条件之一。
本实验要求掌握动物的捉拿、固定、麻醉、编号、采血、处死方法和解剖检查。
二、实验内容和方法（一）实验动物的捉拿和固定方法1、小鼠：捉拿时先用右手将鼠尾抓住提起，放在较粗糙的台面或鼠笼上，在其向前爬行时，右手向后拉尾，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和头颈部皮肤，将其固定于左手手心中，拉直四肢并用左手无名指压紧尾和后肢，右手即可作注射或其他实验操作。
取尾血及尾静脉注射时，可将小鼠固定在金属或木制的固定器上。
2、大鼠：大鼠抓取方法基本同小鼠，抓大鼠时若操作者不熟练，或者大鼠特别凶猛，操作者最好戴上防护手套(帆布或硬皮质均可)。
如若是灌胃、腹腔注射、肌肉和皮下注射时，可采用与小鼠相同的手法，即拇、食指捏住鼠的耳朵及头颈皮肤，余下三指紧捏住背部皮肤，置于掌心中，调整大鼠在手中的姿势后即可操作。
3、豚鼠：豚鼠性情温和，胆小易惊，一般不易伤人，抓取时，先用手掌扣住豚鼠背部，抓住其肩胛上方，拇、食指环握颈部，另一只手托住臀部。
如果在实验时豚鼠频繁挣扎，不宜采用此方法，因为操作者的拇、食指会随动物的挣扎越抓越紧而引起豚鼠窒息。
另外，有时可用纱布将豚鼠头部轻轻盖住，操作人员轻扶住其背部或者让其头部钻到实验人员的臂下，然后进行实验操作。
4、家兔：一手抓住兔颈部的被毛与皮肤，另一手托其臀部或腹部，使其躯干的重量大部分集中在手上。
(二)实验动物的编号、标记和去毛方法1、编号和标记方法：在动物实验中，为了使实验动物个体间或组间区别开来，便于对每个实验动物的反应情况进行观察，必须对实验动物进行编号、标记。
标记的方法很多，但基本原则是：号码清楚、耐久、简便、易认和适用。
生态毒理学实验
生态毒理学实验实验一血清乳酸脱氢酶活性的测定一、实验目的熟悉小鼠的采血方法，学会乳酸脱氢酶活性的测定，理解该酶含量变化的意义。
二、实验原理乳酸脱氢酶(LDH，EC．l．1．27)在以辅酶Ⅰ（NAD+）为氢受体的情况下，催化L一乳酸氧化成丙酮酸（对D一乳酸不起作用）。
LDH存在于各种组织的细胞浆中，其活力约为血清的500倍。
组织细胞膜经损伤，血清LDH即见增高，因此可以用LDH作为衡量细胞膜通透性的指标。
本实验采用比色测定法：以NAD＋为氢受体，LDH催化乳酸脱氢生成丙酮酸，丙酮酸与2，4一二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，该物质在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度呈正比，据此计算LDH活性单位。
三、材料及试剂1．实验动物体重18－20 g的健康小鼠40只，随机分为5组，每组8只，1组为阴性对照，一组为阳性对照组，另3组为不同剂量染毒组。
2．器材注射器、手术剪、镊子、移液管、吸耳球、试管、试管架、恒温水浴锅等。
3．试剂（1）乳酸钠底物缓冲液（pH 10.0）：取乳酸钠溶液（65％－75％）10mL，加入0．lmol ／L甘氨酸溶液125mL、0.l mo/L氢氧化钠溶液75mL，混合。
0.1mol/L甘氨酸溶液：称取甘氨酸1.501g，氯化钠二1.17 g，用双蒸水溶解并定容到200 mL。
（2）辅酶Ⅰ溶液(11.3mmol/L)：称取氧化型辅酶Ⅰ15mg（如含量为70％，则称取2I．4 mg），溶于2 mL双蒸水中，4℃保存，至少可用2周。
（3）2，4一二硝基苯肼溶液（1mmol/L）：称取2，4一二硝基苯肼200mg，加4 mol ／L盐酸250 mL，加水约600 mL，加热助溶，冷却后加水至1000 mL。
（4）0.4mol／L氢氧化钠溶液100mL。
（5）丙酮酸标准液（1mmol/L）：准确称取AR级丙酮酸钠11mg，以乳酸钠底物缓冲液溶解并定容到100 mL，临用前现配。
（6）受试化合物溶液：由指导教师根据本实验室情况自定。
生态毒理学 第3章
(1)绝对致死剂量（LD100） 指能引起所观察个体
全部死亡的最低剂量， 或在实验中可引起实 验动物全部死亡的最 低剂量。
最大耐受剂量（MTD）
绝对致死剂量（LD100） 半数致死剂量（LD50） 最小致死剂量（MLD） 最大耐受剂量（MTD）
(2)半数致死剂量和半数致死浓度
半数致死剂量（LD50）又称致 死中量，指引起一群个体50%死亡 所需剂量。
半数致死浓度（LC50），即引 起一群个体50%死亡所需的浓度。 一般以mg/m3空气和mg/L水来表示。
绝对致死剂量（LD100） 半数致死剂量（LD50） 最小致死剂量（MLD）
(3)最小致死剂量
最小致死剂量（MLD,LDmin 或LD01）指在一群个体中仅引起 个别死亡的最低剂量。低于此 剂量即不能使个体死亡。
危害性(hazard)的意义与危险度相似，但缺乏定 量概念，未考虑机体可能接触的剂量和损害程度，一 般指化学物对机体产生危害的可能性。
（五）剂量
剂量（dose）是指给予机体的或机体接触的外源化 学物的数量。
剂量的单位通常是以单位体质量接触的外源化学物 数量[mg/kg （体质量）]或机体生存环境中的浓度 [mg/m3 （空气） ，mg/L(水)]表示。
3．最小有作用剂量（MEL） 4．最大无作用剂量（MNEL） 5．急性毒作用带(Zac)
半数效应剂量(ED50) 指外 源化学物在一定的时间内按 一定的方式与机体接触，引 起机体某项生物效应发生50% 改变所需的剂量。
半数致死浓度（LC50）， 即引起一群个体50%死亡所 需的浓度。一般以mg/m3 (空 气)和mg/L(水)来表示。
4．最大无作用剂量
1．致死剂量（Lethal dose，LD） 2．半数效应剂量（ED50） 3．最小有作用剂量（MEL）
《生态毒理学》课件
生态风险评估包括问题识别、风险特征描述、暴露评估、效应评估和风险决策等 步骤。
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生态风险评估的案例分析
实际案例分析将帮助我们理解和应用生态风险评估方法。
第六部分：环境毒理学应用
生物监测
生物监测通过对生物体的 观察和测量，评估环境中 化学物质的存在和生物暴 露的潜在危害。
生态毒理学对环境保 护的重要性
污染物的生物转化
污染物在生物体内发生代谢和 转化，可能产生更有毒的代谢 产物。
污染物的生物毒性
污染物对生物体产生有害的生 理和行为效应，可能导致生物 的生存和繁殖能力受损。
第五部分：生态风定活动或污染物对生态系统和生物体造成的潜在危害程度。
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生态风险评估的步骤
生态质量评价的方 法
生态质量评价通常通过监测 和评估生态系统的结构、功 能和物质的状态来进行。
生态风险评价
生态风险评价是一种评估特 定化学物质对生态系统和生 物体的潜在危害程度的方法。
第四部分：污染物的生物学效应
污染物的生物累积
污染物在生物体内积累，可能 导致生态系统的不稳定和生物 多样性的下降。
《生态毒理学》PPT课件
欢迎来到《生态毒理学》PPT课件！本课程将带你深入了解生态毒理学的基 本概念、毒性评价方法、生态风险评估以及生态毒理学在环境保护中的应用。
第一部分：概述
什么是生态毒理学
生态毒理学研究生物与环境之间相互作用的 科学领域，关注物质对生态系统和生物体的 影响。
生态毒理学的重要性
生态毒理学有助于评估和管理环境中的化学 物质对生物体和生态系统的潜在危害。
第二部分：毒理学基础知识
1 毒性的定义
毒性是指化学物质对生 物体产生的有害效应。
环境毒理学常用实验方法
• 急性毒性进行评定：与同系物或其他毒物比较，与毒性分
级比较分析。
环境毒理学常用实验方法
急性毒性试验
四、哺乳动物的急性毒性实验 （二）急性阈剂量的测定
急性阈剂量指毒物经一次染毒后对机体产生不良作用的最小 剂量，是用于评价毒物非致死性损害的参数。
环境毒理学常用实验方法
变)
环境毒理学常用实验方法
实验动物的选择
个体选择
• 年龄
除特殊要求外，动物年龄一般选用初成年者。
• 性别
根据目的，若对动物性别无特殊要求，宜选用雌雄各半。
• 生理状态——怀孕、哺乳
通常实验均不宜采用处于特殊生理状态的动物进行，为了 某种特定的实验目的除外。
• 健康状况
所用动物进入实验室后，于实验开始前应观察一周以上， 以删除不健康的动物，并使实验动物适应环境。
作病理组织学观察时，则应有对照组。
环境毒理学常用实验方法
急性毒性试验
四、哺乳动物的急性毒性实验 （一）半数致死量(LD50、LC50)的测定 4.症状观察
• 染毒开始后应观察并记录实验动物的中毒表现、生理状况
变化和死亡情况。
• 观察时间可确定为几小时、几天、一周或两周，但一般不
超过二周（二周内）。
环境毒理学常用实验方法
急性毒性试验
系统和器官
中枢神经系统与神经肌肉系统
植物神经系统 呼吸系统 皮肤和被毛 眼睛
表 8-3 啮齿类动物中毒常见症状及发生部位 中毒后常见的表现
体位异常，叫声异常，活动增多和呆卧少动，肌颤，痉挛，麻痹，后肢无力， 运动失调，管状尾，对外界刺激反应过敏或迟钝 瞳孔扩大，流涎，流泪，出汗 鼻孔溢液，鼻翼扇动，呼吸深缓，呼吸过速，张口和腹式呼吸 皮肤充血，紫绀，被毛蓬松、污秽 眼球突出，充血，角膜混浊，血性分泌物
生态毒理学研究方法及其应用
生态毒理学研究方法及其应用生态毒理学指的是研究生态系统中生物与环境污染物之间相互作用关系的学科，是环境科学领域中的一个重要分支。
为了更好地了解毒物对环境与生物的危害程度以及评估生态系统健康状况，需要采用一系列科学的研究方法。
本文将介绍生态毒理学研究方法及其应用。
一、生态毒理学研究方法1. 毒性试验毒性试验是研究物质对生物的毒性程度的基本方法之一。
常用的毒性试验方法包括急性毒性试验、亚急性毒性试验和慢性毒性试验。
急性毒性试验可以评估在短时间内暴露下物质对生物的毒性；亚急性毒性试验可以评估生物长期暴露在某种物质下的损害程度；慢性毒性试验则可以评估毒物长时间低剂量暴露情况下对生物体造成的潜在风险。
2. 生物标志物生物标志物是使用生物体内的某些物质或生理指标来反映环境污染程度和毒物暴露水平的方法。
常用的生物标志物包括酶活性、代谢产物、DNA损伤指标等。
生物标志物可以作为一种可靠的检测和监测手段，评估生态系统中污染物对生物体的影响。
3. 生态毒理学模型生态毒理学模型是通过对生态系统中污染物在生物体内、水、土壤和大气等不同介质中的迁移、转化和作用进行数学模型化，预测生态系统中污染物的存在和可能发生的效应的方法。
生态毒理学模型广泛应用于污染地区环境风险评估、环境管理和规划及生态安全评估等方面。
二、生态毒理学的应用1. 环境污染评估生态毒理学可以通过评估环境样品中的毒性及生物学影响，了解污染物对环境的影响，为环境保护和生态修复提供科学依据。
生态毒理学方法可以预测环境中有毒或危险物质的成分、来源以及后果，有助于做好环境保护工作。
2. 生态系统管理生态毒理学可以为生态系统管理提供科学依据。
生态毒理学模型可以预测生态系统中物质的迁移，提供生态系统的维护与改善方案。
同时，生物标志物可以监测生态系统中物质的暴露和损伤程度，为环境污染和生态失衡预警提供数据支持。
3. 毒物风险评估生态毒理学方法可以帮助评估毒物对整个生态系统的影响，对于评估毒物安全性、毒性水平及可能的毒害机制有很大帮助。
生态毒理学1 (3)
第一节常规毒性试验一、急性毒性试验急性毒性试验是研究化学物质大剂量一次染毒或24h内多次染毒生物所引起的毒性试验。
其目的是确定化学物质的毒性程度以及剂量—反应关系，确定此化学物质与其他化学物质的相对毒性，确定具体的急性毒作用以及提供毒作用模式方面资料，并为进一步开展其他毒性试验提供理论依据。
一项设计合理的急性毒性试验，可以得到用以计算LD50的资料。
(一)水生生物急性毒性试验1．鱼类毒性试验鱼类急性毒性试验，是水生生态毒理学的重要内容之一，并广泛应用于水域环境污染监测工作中，对控制工业废水的排放，保护水域环境，发展渔业生产，制定渔业水质指标，具有重要意义。
(1) 试验用鱼的选择应具有代表性，便于在实验室条件下饲养的当地经济鱼类，对毒物敏感，个体健康。
短期试验多采用我国的青鱼、草鱼、鲢鱼及鳙鱼四大养殖淡水鱼，一般体长在7cm以下为宜。
也可采用金鱼，一般在3cm以下。
选择行动活泼、体色光泽、鱼鳍舒展完整、逆水性强和食欲好的当年鱼种，在实验室内驯化培养7—10天使用(2) 试验条件试验容器采用玻璃缸或白搪瓷桶，其盛水量以每条鱼2—3L为宜，水的PH值为6.5—8.0，冷水温度为12—18℃，温水温度为20—28℃，一次试验中水温变化范围为±2℃。
水中溶解氧不能低于4mg/L，可用清洁的河水、湖水或放置3天以上的自来水。
（3）半数致死浓度（LC50）的测定先做预备试验，确定100％致死浓度和不引起死亡的最大浓度，然后以此浓度范围，按等对数间距确定5-6个浓度组，另加一空白对照组，每组10-20尾鱼，染毒48-96h。
染毒刚开始8h内经常观察，以后可作24h、48h、72h、96h的定期观察，记录中毒反应及死亡时间。
死亡鱼立即取出剖检。
试验期间保持溶解氧、pH值、水温等条件的稳定。
根据24h、48h、96h各组鱼的死亡数，按LC50计算方法，求出相应时间的LC50 。
一般采用直线内插法或对数-概率模式法。
《生态毒理学报》引文标注及参考文献格式要求
《生态毒理学报》引文标注及参考文献格式要求l92生态毒理第1卷《生态毒理》引文标注及参考文献格式要求1.本刊采用"着者一出版年"制标注引文及着录参考文献.根据GB7714—87(《文后参考文献着录规则》)的规定,参考文献中引文必须是已公开发表的文献.未公开发表的文献不能引用,只能用文内页下注的形式注明出处.已被录用但尚未出版的论文亦不能引用.2.在正文中,引文用括号内标注着者,出版年份的形式标注,且不排引文序号,不能与"顺序编码制"混用(即以上角标的形式,在方括号内标注引文序号).对于多个作者,要一一列出,不要在第一作者后加"等".如有多于1条的引文,则各引文项之间用分号分隔.3.参考文献中各着录条目应内容规范,齐全.具体要求为:a)着者项作者必须全部列出,不能仅列1人后即加"等","eto1.".作者姓名之间用逗号分隔.作者姓名无论中文和外文,其书写格式一律为"姓前名后".对于外文,名可缩写,但须以空格代替缩写点.除翻译以外,一般不着录文献责任者的具体责任,如"主编","编"等.b)题名项题名前用句点引导,题名后加方括号标注文献类型,如[J],[M]等.C)期刊刊名用句点引导,不必用斜体,字体亦不必加粗,缩写点用空格代替.期刊出版年份,卷号用逗号引导;期号接卷号用圆括号括起;页码用冒号引导,页码范围用半字线表示,不同页码段间用分号分隔;对于期刊无卷号时可在年份标示后紧接着标示期号,如"1999(8)"表示1999年第8期,而"1999,8"则表示1998年第8卷(无期号);引文条目最后不加任何标点.d)如引用了同一作者在同一年度的多篇文献,则可在出版年后加字母a,b,c,d等区别.4.为便于国际交流,本刊要求分别着录英文参考文献表和中文参考文献表.其中,中文参考文献表仅着录原始文种为中文的文献;英文参考文献表除着录原始文种为英文的文献外,还应将原始文种为中文的文献条目译成英文(对于期刊或文集,英译以原文献的英文摘要为准).5.各文献条目按着者姓名的字母顺序(对于英文)或着者汉语拼音的字母顺序(对于中文)排列,着录的具体格式为:期刊:作者.出版年.题名[J].刊名,卷号(期号):起止页码专着:作者.出版年.题名[M].书名.出版地:出版者,起止页码文集:作者.出版年.题名[A]//编者.文集名[C],出版地:出版者.页码报告:作者.出版年.题名[R].报告编号.所在地:机构名称.起止页码专利:专利申请者.出版年.专利题名[P].专利国别,专利文献种类,专利号.出版日期(用标准日期书写格式)标准:起草责任者.出版年.标准代号标准名称[s].出版地:出版者会议论文:作者.出版年.文题[C].会议名称,会址:起止页码学位论文:作者.出版年.论文题目[D].保存地:保存单位.起止页码磁盘文献:作者.出版年.题名:其它题名信息[DK](引用日期).出版地:出版者(更新日期)光盘文献:作者.出版年.题名:其它题名信息[CD](引用日期).出版地:出版者(更新日期)联机文档:作者.出版年.题名[OL].出版地(如果有的话):出版者(如果有的话),用标准格式书写的引用日期,网页地址(以http://www开头)尚未定义类型的文献:主要责任者.出版年.题名[z].出版地:出版者.起止页码以上提到的"引用日期"不是指参考文献表着录者的引文日期,而是指相关文献(通常是二次文献)转引原始文献(即一次文献)时的日期.该日期一般在二次文献中指明.。
生态毒理学研究方法
固相
1M/0.5M MgCl2 (pH=7, W/V=1:20, 2h, 25C) 1M NaOAc (pH=5.1, W/V=1:20, 2h, 25C) 0.04M NH2OHHCl (在25%HOAc中, W/V=1:20, 2h, 96C)
液相：离子交换态
固相
液相：碳酸盐结合态
固相
液相：中等可还原态
毒性的影响因素
(6) 溶解有机碳(DOC) 溶解有机分子，分子量跨度从低于1000高至100000以上。作为金属离子的络 合剂。 (7) 脂水分配系数(化合物的毒性除与其在脂水相的相对溶解度有关，还与其 体液绝对溶解度有关) (8) 电离度(弱酸或弱碱型有机物在体内pH条件下，电离度低，非离子行比例 高，容易被吸收发挥毒性) (9) 挥发度和蒸气压(暴露接触的机率) (10) 分散度(粉尘、烟雾等固态物质毒性与分散度即颗粒粒径大小有关) (11) 纯度(杂质：剩余原料、合成副产品、添加剂、赋形剂) (12) 湿度(伴随高温时，化学物经皮肤吸收速率加快) (13) 气压 颗粒物的作用：食物的重要性 气态污染物除去呼吸吸入和气孔/表皮进入植物外，还有两条基本进入途径： 以溶解态形式直接通过生物膜传输；摄取污染颗粒物质(仅对异养生物)。 有机污染物孔隙水相和沉积物相之间分配：Cw/Cs=Kocfoc，Koc，foc分别为有 机相分配系数和沉积物有机碳分数。沉积物－水，土壤－水分配系数可以由 辛醇－水分配系数近似：logKoc=a Kow+b。
有毒混合物模型：条目定义 化学物A：96小时LC50＝1mg/L 化学物B：96小时LC50=10mg/L 两者分别按1mg/L和10mg/L加入
96小时死亡描述 50%死亡 定义
化学物A
无相互作用，各自反应
《生态毒理学》PPT课件_OK
钙 Ca 钾K 钠 Na 镁 Mg 铁 Fe 锌 Zn 铜 Cu 钒V 硒 Se 锰 Mn 碘I 镍 Ni 钼 Mo 铬 Cr 钴 Co 铅 Pb 镉 Cd 汞 Hg 锑 Sb 铍 Be 砷 As 碲 Te 锡 Sn 铋 Bi 铀U 钨W 锗 Ge
成人体内数量 (mg)
1000000 140000 100000 19000 4200 2300 72 18 13 12 11 10 9 1.5 1.5 121 50 13 8 0.04 18 8 6 0.2 0.29 + +
14
(3) 经皮肤吸收 主要是脂溶性金属化合物。 其影响因素 a) 脂水分配系数接近于1的化合物易于吸收； b) 分子比离子易于吸收； c) 不同部位皮肤的穿透能力不同(头、面部易穿透)； d) 气温； e) 湿度。
15
金属的代谢(续)
转运 金属与血浆成份的结合主要分为三类： (1)与血浆中低分子成份结合，是金属转运、分布和排
(1) 金属形态测定的技术进展
a) 平 衡 模 型 和 计 算 程 序 ： MINEQL, MINTEQA2, GEOCHEM, WHAM；
b) 分析化学方法测定金属不同的化学形态，例如各种 前处理技术、利用离子选择性电极ISE进行电化学模 拟测定(阳极溶出伏安法ASV或电位法)；
c) 使用逐渐强化的提取剂进行固相顺序提取方法，按 操作定义划分；
DGT)
鸟类、动物)
2－3，野外土壤和沉积物 可利用但需搬运。野外可 能使用SPME、SPMD和 DGT。
3，原位测试
3，直接用于固相或泥浆
2，集成各种介质的暴露， 包括固相
单一与集总过程
3，唯一适于鉴定结合机理 1，操作测试需集成多个过 2，整体生物富集方法集成
生态毒理学3
农药
拟除虫菊酯为神经毒化合物 结果：使cell内游离钙浓度增高 机制：可能与其抑制Ca2+，Mg2+-
ATPase、CaM和磷酸二酯酶(PEE)的
活性。
四氯化碳
可抑制肝细胞微粒体Ca2+ - ATPase 表现：肝内质网酶活性改变及钙的蓄积。 机制；可产生自由基，攻击Ca2+ -ATPase上 的巯基，使酶活性下降；
基因表达的调节障碍
细胞分裂异常：形成肿瘤，畸胎 细胞凋亡：组织退化，或畸胎 蛋白质合成受损
细胞瞬息活动的调节障碍
特定细胞正常运行的控制是通过作用于膜受体的
信号分子来实现的。
如：Ca2+
，细胞钙稳态失调学说
1.2.1 细胞内钙稳态
在毒理学中，发现细胞损伤和死亡与胞内钙
1.1.3 羟基和氨基
芳香族化合物中引入羟基，分子极性增强，毒性增 强。如苯引入羟基成苯酚后具弱酸性，易与蛋白质 分子的碱性基团结合，与酶蛋白有较强的亲和力， 毒性增大。多羟基的芳香化合物毒性更强。 脂肪烃引入羟基成为醇类，麻醉作用增强，并可损 伤肝脏。 胺具有碱性，易与核酸和蛋白质的酸性基团反应， 易与酶发生作用。胺类化合物活性强弱依次为伯胺 （RNH2）＞ 仲胺（RNHR’）＞叔胺（RNR’R’’）。
1.自由基的来源
最主要的是氧中心自由基 活性氧(reactive
oxygen species,ROS)
包括氧中心自由基(如O2-•，· OH)，和某些 氧的非自由基衍生物，如H2O2、次氯酸， 甚至还包括过氧化物、氢过氧化物和内 源性脂质及外来化合物的环氧代谢物。
自由基的来源与类型
1.自由基来源
生态毒理学：第三章 生态毒理学常用实验方法GB格式
表2 IPCS专家组推荐的统计学分析方法
数据类别和统计学要求 1．“有或无”数据： 动物间的比较
个物间的比较 动物内部的比较
3．连续数据： 动物间的比较 动物内部比较 变量间的相关性
非均匀性 与剂量相关的趋势 个别组的比较 非均匀性 变量问的相关性
四、实验和观察
1.实验准备和预备实验 2.实验及其结果的观察记录 (1)按照预备实验确定的步骤进行实验； (2)熟练掌握实验方法，用量准确，严肃认真地操 作； (3)经分析属于错误操作或不合理的结果应重做实 验； (4)仔细、耐心地观察实验过程中出现的现象（结 果），并进行思考。
通常实验记录的项目和内容为：
急性毒性(acute toxicity)是指机体(人或试 验动物)一次接触或24小时内多次接触化学 物后在短期(最长到14天)内所发生的毒性效 应，包括一般行为、外观改变、大体形态变 化以及死亡效应。
目的
①测试和求出化学毒物对一种或几种试验动物的致死量(以 LD50表示)以及其它的急性毒性参数，了解急性毒作用强 度。 ②并通过观察动物中毒表现和死亡的情况，了解急性毒作 用性质、可能的靶器官和致死原因，提供化学毒物的急性 中毒资料、初步评价对人体产生损害的危险性。 ③探求化学毒物急性毒性的剂量—反应关系与中毒特征。 ④为亚慢性、慢性毒性作用试验的染毒剂量设计提供参考 依据。 ⑤研究化学毒物急性中毒的预防和急救治疗措施。 ⑥为毒理学机制研究提供线索 。
3. 实验观察指标选择：
实验指标（观测指标）是指在实验观察中用于反 映研究对象中某些可被检测仪器或研究者感知的 特征或现象标志。 实验指标选择的基本条件： （1）特异性 （2）客观性 （3）灵敏度 （4）精确度 （5）可行性 （6）认可性
生态毒理学第三章毒物的分子效应与毒理学机制
§3.1毒物生物转化机制
§3.2毒物的分子效应 §3.3生物标记物与毒物分子的作用 机制
生物转化：在生物调节下一种化
学物质被转化成另一种化学物质,
有酶的催化参与,可以加速毒物的
消除、解毒、隔离、重新分布或
者活化
生物活化
生物转化
生物钝化
生物活化作用：是污染物的有害 作用加强或者使一种惰性的化合 物被转化成具有高生物活性的有 害物质
生物标记物性质
①生物标记物应该在生物组织的 高层次发生有害的显著效应之前 能够被检测,具预警工具的价值
②理想生物标记物的检测应该是 快速、经济、简单,适合广泛应用
③这种检测应该服从于标准的质 量控制/质量保证的实行
④ 理想生物标记物应该对单一毒 物或者一组毒物具特异性
⑤毒物与生物标记物之间必须存 在清晰的浓度-效应关系
金属可以与MT或 相似功能的分子 结合并且被隔离开来
植物金属螯合蛋白
常见致癌物的代谢活化
①多环和 杂环芳烃 （PAH）
②有机卤化物（PCB、PBB、TCP、 PCP、二垩英类
③有机氯杀虫剂
随着DDE的蓄积，加强了对酶活性的抑制 DDD可抑制肾上腺皮质分泌激素，产生性 别畸变
④有机磷杀虫剂
金属硫蛋白 细胞色素P450单加氧酶
应激蛋白或热冲击蛋白 结合酶(转移酶谷胱甘肽)
亚铁血红素和卟啉 氧化应激酶和抗氧化酶
§3.3生物标记物与毒物分 子的作用机制
金属硫蛋白（MT）
定义：是一组低分子量、可以与金 属结合的蛋白质
作用：是吸收、内部区域化、隔离、 排泄必需（Cu、Zn）和非必需（Ag、 Cd、Hg）金属。参与必需金属正常 的代谢活动,在无有毒金属暴露时以 基本水平存在,可以被多种物质以及 物理化学条件所诱导
第三章 复习生态毒理学基本研究方法2 (1)
一、PCR-SSCP技术
(一)PCR-SSCP的基本原理
单链DNA由于有链内碱基配对而具有一定的空间结 构，当DNA链上的碱基 (即使是一个碱基)发生改变 时，单链DNA会形成不同的构象，称为单链构象多 态性(single strand conformation polymorphism， SSCP)。 PCR-SSCP是PCR技术与SSCP的结合，是将被检 出的DNA事先经有标志物的引物或参与PCR反应， PCR扩增产物经加热变性后，单链产物经中性聚丙 烯酰胺电泳，靶DNA中如有突变存在(如单碱基置 换、碱基插入或缺失等)，它们因迁移率变化而出现 泳动变位。
(四)PCR—SSCP技术在毒理学研究中的应用
如Maino等在1992年将该项技术引入化学致
癌分子机制的研究领域，在化学制癌剂诱变 的小鼠鳞状癌细胞中检出了特异性H-ras基因 第13位密码子的点突变。 谭明家等于1997年以甲基丙烯酸环氧丙酰 (GMA)体外诱导人胚肺成纤维细胞，分离转 化细胞克隆，应用PCR扩增P53基因第5和第 8外显子的DNA片段，银染单链构型多态分 析，发现经三次GMA处理后，p53基因第8外 显子发生突变。
每个受损伤细胞在电泳时，其DNA从核
中向阳极伸展，形成一个亮光头部和尾 部，形似彗星．故又名彗星试验(comet assay) 如果细胞末受损伤，电泳时细胞核DNA 因其相对分于质量大停留在细胞核基质 中，荧光染色后呈现圆形的荧光团，无 拖尾现象。
若细胞受损，在中性电泳液中(PH＝8)中，
(二)PCR—SSCP的基本过程
1.
PCR扩增 2. PCR产物单链凝胶电泳 3. 结果分析
PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性
第三章环境毒理学的基本研究方法.pptx
毒理学试验 调查研究
毒理学 实验基础
毒理学研究方法的优缺点
研究方法 流行病体外试验
优点 于控
的研
少
· 真实的暴露条件
· 规定的限定暴露条 · 易于控制暴露条件
· 影响因素少，易
· 在各化学物之间发生相 · 在人群中测定反应 · 能测定多种效应
毒理学试验设计的统计学要求 随机、重复、对照原则
对常规毒理学试验资料的统计学方法 计量资料：一般用t检验或ANOVA 记数资料：卡方检验
实验结果的判断
1 处理组与对照组比较差别有无显著性 2 有无剂量-反应关系 3 是否伴有其他相关参数的改变 4 是否在 “正常”值范围
第一节 急性毒性试验
一、急性毒性试验的目的：
· 动物暴露与人暴露相关 · 不能全面反映毒
· 多为回顾性，无健康 · 较低浓度和较短时 的不确定性
不能作为毒性评价
保护
间的暴露
· 受控的饲养条件与人的 危险性评价的最后依
· 难以确定暴露，有混杂 · 限于较少量的人群 实际情况不一致
据
暴露问题
(一般<50)
· 暴露的浓度和时间的模 · 难以观察慢性毒作
1.40 3.35 5.50 7.32 11.60 14.75 15.60 16.10 18.16
1.46 3.50 5.60 7.40 12.45 16.10 17.40 18.65 20.25
系
C57BL/6
615
雌性 雄性 雌性 雄性
1.40 1.44 1.58 3.42 3.50 4.64 5.55 5.60 7.96 6.40 6.90 9.83 12.20 12.57 15.75 16.90 18.10 20.75 18.40 20.50 21.88 19.00 21.60 23.12 20.25 22.40 24.16
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③人体观察（临床观察）中毒、事故、意外 等 ④流行病学研究：研究疾病的分布，探讨病 因，采取措施。
不同阶段的毒理学试验项目
第一阶段----急性毒性试验和局部毒性试 验
第二阶段----重复剂量毒性试验、遗传毒 性试验与发育毒性试验
3. 实验观察指标选择：
实验指标（观测指标）是指在实验观察中用于反 映研究对象中某些可被检测仪器或研究者感知的 特征或现象标志。 实验指标选择的基本条件： （1）特异性 （2）客观性 （3）灵敏度 （4）精确度 （5）可行性 （6）认可性
实验指标选择依据通常有： （1）根据实验的目的、任务和内容选择指标。 （2）根据化学物的种类和用途来选择国家标准、 部委和各级政府发布的法规、规定和行业规范 中相应的程序中的实验方法要求来选择指标。
3.成年的健康实验动物和人可能的暴露途径是 基本的选择
(1)成年的健康（雄性和雌性未孕）实验动物作 为一般人群的代表性实验模型。
幼年和老年动物、妊娠的雌性动物、疾病状态作 为特殊情况另作研究。
(2)毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模 拟人接触该受试物的方式。
科研设计遵循的三原则
1.对照原则
➢对照的意义在于通过对照鉴别处理因素与非处理因 素的差异及处理因素的效应大小,消除和减少随机化 原则所不能控制的抽样误差及实验者操作熟练程度等 所造成的差异。 ➢在动物实验中，要求相比较的各组间动物的种类、 性别、年龄、体重等尽可能地一致。对照组与实验组 同等重要，两组的动物数应相等。 ➢毒理学实验中常用的对照形式有以下几种：
2.剂量-反应(效应)研究
Biological Response
FEL: Frank Effect Level
有直接显著影响值
最低可见有害作用水平
LOAEL: Lowest Observable Adverse Effect Level
最低可见作用水平
NOAEL:No Observable Adverse Effect Level
毒理学动物实验设计
外推
2.实验动物必须暴露于高剂量 是发现对人潜在危害的必需的和可靠的方法。
一般要设3个或3个以上剂量组，以观察剂 量-反应（效应）关系，确定受试化学物引起毒 效应及其毒性参数。
(1)毒性试验的设计并不是为了证明化学品的安 全性，而是为了表征化学品可能产生的毒作用。 (2)毒理学试验中实验模型所需的动物总是远少 于处于危险中的人群。为了在少量动物得到有 统计学意义的可靠的结果，需要应用相对较高 的剂量，以使效应发生的频率足以被检测。
未观察到损害作用水平
LOEL: Lowest Observable Effect Level
NOEL: No Observable Effect Level
Log[Dose] 无可见作用剂量水平
3.确定毒作用的靶器官
4.确定损害的可逆性 5.其它 ➢毒作用的敏感检测指标和生物学标志 ➢毒作用机制研究 ➢受试物的毒物动力学和代谢研究 ➢中毒的解救措施
个别组的比较 非均匀性 与剂量相关的趋势 个别组的比较 非均匀性 与剂量相关的趋势 变量间的相关性
三、毒理学动物实验设计内容
1.实验动物选择：原则： A.对化合物毒性反应与人接近的动物 B.易于饲养管理 C.操作方便 D.易于获得，品系纯化，价格低廉
2. 实验动物分组与剂量选择、实验期限：
Biological Response
高剂量组 中剂量组：LOAEL 低剂量组：NOAEL
Log[Dose]
(4)自身对照：对照与实验在同一受试者身上进行，如同一个体左 右部位的对比，给药前后的对比，先给甲药后给乙药的对比等 方式。若采用给药前后的对比，总是将用药前作为对照，这实 质上也是一种空白对照。 严格地说，还需要单独设立一个对照 组， 比较实验组与对照组处理前后的效应差值 。
2.重复原则
(1)足够的实验样本数： (2)实验结果的可重复性。
3
第三章
毒理学试验
一、毒理学毒性评价试验的原则
毒理学实验通常是毒性评价或安全性评价试验， 通常由权威机构规定评价程序。
在描述毒理学的试验中，有三个基本的原则: 1.外来化学物在实验动物产生的作用，可以 外推于人。 基本假设为： ①人是最敏感的动物物种； ②人和实验动物的生物学过程包括化学物的 代谢，与体重（或体表面积）相关。
3.随机原则
为了减少个体差异这种非处理因素的干拢，应 于实验前将实验动物依统计学原则进行随机分组， 以此达到尽可能降低非处理因素的混杂效应，从 而提高每组动物间均衡性的目的。 随机分组方法： ①随机数字表法； ②计算机软件（如SPSS、SAS、Excel等）方法 。
毒理学的研究方法
①体内试验 也称为整体动物实验，整体研 究动物外推到人
4. 统计学处理方法：
表2 IPCS专家组推荐的统计学分析方法
数据类别和统计学要求 1．“有或无”数据： 动物间的比较
个别组的比较
动物内部比较 2．分级数据： 动物间的比较 动物内部的比较
3．连续数据： 动物间的比较 动物内部比较 变量间的相关性
非均匀性 与剂量相关的趋势 个别组的比较 非均匀性 变量问的相关性
第三阶段----亚慢性毒性试验、生殖毒性 试验和毒动学试验
第四阶段-目的
1.受试物毒作用的表现和性质 在急性和慢性毒性试验中，观察受试物对 机体的有害作用，对有害作用的观察应该是对 每个实验动物进行全面的、逐项的观察和记录。 发现有害作用是进行剂量-反应(效应)研究的前 提。
(1)空白对照：又称正常对照对照组不加任何处理因素，即处理因 素完全空白。
(2)标准对照：指在所谓标准条件下进行观察的对照。如抗结核病 的新药试验，应以链霉素和异烟肼为标准对照药物，且不可用 降低标准对照的办法来提高试验效应 。
(3)阳性对照：毒理学研究中的三致试验( 致突变试验、致癌试验 和致畸试验)，除常规设立空白对照 (阴性对照)外尚需同时设 立阳性对照，即使用必定出现阳性结果阳性受试物(如环磷酰 胺)，以判断该试验方法是否成功。若阳性对照没有出现阳性 结果，则说明该试验是失败的。