brukerin-vivoxtreme小动物活体成像系统标准操作规程(1)

Bruker In-Vivo Xtreme小动物活体成像系统标准操作规程
【目的】通过制定本操作规程，规范小动物活体成像系统使用。

【准备】
1、实验试剂（药物、染料、麻醉剂、水、脱毛膏等）；
2、实验对象（小鼠、大鼠、黑鼠、裸鼠等）；
3、如需要气体麻醉则要进行氧气准备，将麻醉剂倒入麻醉机中，并检
查麻醉机检查窗中液位位于“min”和“Max”之间；气体麻醉前根据室内温度情况酌情打开动物空气加热器。

【开机】
主机部分：
1、打开X-Ray光源，将开关钥匙打到“ON”的位置；
2、打开主机，将主机右后方的电源开关打到“ON”的位置。

接着打开电脑，等待网线图标出现一个黄色三角叹号后，将MI软件打开。

注意：仪器开机以后，需要大约20分钟的预冷时间。

附属部分：
1、如需要进行气体麻醉，则需要打开麻醉机，并对实验对象进行预麻
醉；
2、如果需要进行三维旋转拍摄，则需准备动物旋转系统（MARS），动物
旋转系统的准备需要在不开拍摄软件和MARS控制器按钮打到manual的情况下，先按要求将旋转器安装到暗箱中，然后将按钮打到auto，完成之后即可打开MI软件
【拍照】
1、将实验对象摆放到托盘中，拍照部位朝下，如拍摄腹部影像，需将实
验对象腹部朝下，并将四肢伸展开，然后将托盘放入暗箱拍摄位置，放置是托盘缺口朝右侧摆放；
2、双击桌面MI图标，打开MI软件，单击“Capture”按钮，打开拍摄参数设置界面；
1）：拍摄界面顶部显示仪器型号。

MI软件提供同时拍摄两张图像的功能，即第一张图像是Foreground，主图像，第二张图像是Background，背景图像。

点击Foreground和Background按钮进行切换，对两张图像的拍摄程序分别进行编辑。

2）：左边第一部分File里可以执行和创建、编辑修改一个Protocol，同时，Protocol还可以通过点击软件顶部的工具栏中Protocol按钮打开。

3）：第二部分是选择拍摄模式，共有5种，分别为Fluorescence荧光，Luminescence化学发光，Radioisotopix同位素，X-Ray X光，Reflectance 反射光，另外可以Custom定制程序。

点击Setting的下拉菜单，可以选择我们已经设定好的拍摄程序，或者选择Default Session默认设置，和Current Session来新建一个拍摄程序。

每个拍摄模式都有一个默认设置，具体拍摄条件如下（In Vivo Xtreme ENG，42页）：
右边的save保存程序，save as另存为和重命名，Delete删除程序。

点击Unlock和Lock键，可以对锁定的程序解锁或为锁定的程序设置密码锁定。

在Annotation框中输入文字，可以对该程序拍摄的图片进行至多48个字符的注释。

在Accumulation Path栏里选择图像的保存路径。

4）：第三部分是选择或者不选背景图像，Background Image的下拉菜单里可以不选背景图像或者选择某个拍摄程序生成背景图像。

软件预设了一个标准的X光拍摄程序，一个高分辨率的X光拍摄程序和一个反射光的拍摄程序，具体拍摄条件可以在Background中查看。

如果我们在Background中编辑保存了自己的程序，在这里也可以选用。

5）：第四部分中可以查看设备的IP地址，相机的序列号和CCD是否已经准备好，如果方块变成绿色就表示CCD已经降到预设温度，仪器已经可以正常使用。

6）：右边第一部分是光源设定，在光源的下拉菜单中，生物发光和同位素拍摄选择Luminescence，反射光拍摄选择Reflectance RGB，荧光和白光拍摄选择Muti-wavelength，X光拍摄选择X-ray。

在Apply Reference File中选择是否应用校正文件，None是不应用校正文件，Auto是当已经设置了合适的校正文件时，软件自动选择匹配的校正文件，选择Manual后先进行正常的图像拍摄，拍完后移除样品和托盘，再进行校正文件的拍摄。

为了保证图像质量，凡是涉及到运用光源的实验，例如荧光，白光，反射光和X光成像，都必须设置合适的校正文件。

荧光、白光和反射光的校正文件跟光圈大小、成像视野、焦距和激发发射波长相关；X光的校正文件跟
光圈大小、成像视野、焦距和铝膜相关；当改变拍摄程序中的以上参数时，必须重新拍摄和设置校正文件。

以下是校正文件的推荐参数设置：
当选择多重曝光时，应用Fina Accumulation最终只生成一张图片，All Accumulations 每次曝光的最终结果都是与之前的图片叠加后的结果，保存每次曝光所产生的图片，但在软件中只打开最后一张。

All Image是指保存每次叠加的图片以及单张图片。

Separate Images是指只保存单次曝光的结果图片。

7）右边的第二部分是选择滤光片，当进行X光拍摄时，可以选择不同厚度的铝膜，铝膜越厚，过滤掉低能量的X射线就越多，骨骼和肌肉软组织的对比度越高，图像越清晰。

因此大鼠X光成像，对骨骼清晰度要求高的图像，或者需要进行骨密度分析的图像，建议选择厚度的铝膜。

这里可以选择X光机的能量，有20、25、30、35、40、45几档可选，高清晰度的X光成像需要高能量，一般大鼠或小鼠的全身骨骼成像选择45KVP.
在荧光拍摄时需要选择激发和发射滤光片，荧光成像中根据荧光物质的特性来选择相应的滤光片，需要注意的是激发和发射滤光片之间波长间隔必须至少在50nm以上，否则会带来强烈的背景干扰。

白光、反射光、生物发光、同位素和X光成像，滤光片都选择0和0。

8）：右边的第三部分是相机设置。

包括Exposure Type曝光方式，这里可选Standard标准曝光，Time Lapse间隔曝光和做校正文件时应用的Illumination Reference曝光模式。

曝光时间可以以秒和分钟为单位任意选择，X光的最小曝光时间是秒，其它拍摄模式的曝光时间最小是秒（Xtreme FI是秒），最长是10分钟。

曝光次数最大可选择32次，但过多的曝光次数是不合适的，可
随机调整。

当在曝光方式中选择Time Lapse时，这里可以选择拍摄间隔和在多长时间或者几帧以后拍摄停止。

Mode（选择CCD在采集图像时的读取速度）里有High Speed 和High Sensitivity两个选项，建议荧光、反射光和X光选择High Speed，化学发光和同位素选择High Sensitivity。

Predict Exposure Time是预测曝光按钮，用此按钮可以估计生物发光和同位素的曝光时间。

选中以后弹出对话框，输入曝光所需的灰度级，点击计算按钮，Xtreme会自动计算所需要的最佳曝光时间。

Binning是指像素合并，Xtreme BI最高到32x32，Xtreme FI最高到64x64，像素合并是指将CCD的相邻几个像素合并成一个像素在图像中呈现，提高CCD 的拍摄灵敏度和响应速度。

当拍摄弱信号比如化学发光或者同位素时，可能需要用到4x4以上的像素合并。

Instant DCR是指CCD的即时暗电荷修正设置，对大多数的图像来说，之间的值比较合适。

当用到小样品台进行小视野的X光成像时，必须勾上Mag Stage这个选项，小样品台提供放大倍数为倍的X光成像，特别适合拍摄爪子、关节、头颅等部位。

FOV中调节成像面积，Xtreme BI分别有，10x10cm，12x12cm，15x15cm，18x18cm和19x19cm的6个成像视野可选择。

fStop是选择光圈的大小，光圈数值越小通光量越大，成像的信号强度越高。

Focal Plane是选择成像的焦距，荧光、白光和反射光等所有在托盘上的成像选择Tray，X光和同位素等在磷屏上的成像选择X-Ray。

9）：右边的最下方可以切换拍摄界面的Standard和Advanced模式。

Preferences按钮可对仪器硬件进行设置和调试。

点击Preview进入预览界面，预览界面中可以调节拍摄时间和焦距，打开反射和白光光源等。

点击Capture按钮直接进行拍摄。

3、新建不同模式的拍摄程序
1）：以新建一个荧光拍摄程序为例，首先在Modality中选择Fluorescence，Setting中选择Current Sesion，Apply Refernce File中选择None，然后设置合适的激发和发射滤光片，这里以绿色荧光蛋白GFP的激发和发射光480,535为例，Exposure Type选择Standard，曝光时间、Bin、FOV、fStop和Focal Plane根据需要选择，下面是不同拍摄模式的推荐拍摄程序：
选好之后点击Save as为程序命名并保存程序。

由于荧光、白光、反射光和X光需要做背景校正，所以接下来我们做一个背景校正文件，在Exposure Type中选择Illumination Reference，把动物仓中的样品和样品托盘取出，正确放置EPI屏（做X光背景校正文件需正确安装X光磷屏，做反射光校正文件需放置Backdrop屏），关闭仓门点击Capture按钮，软件进行校正文件的拍摄。

拍完之后校正文件自动在MI软件中打开，此时将拍摄模式改回Standard，校正文件应用中选择Auto，点击Save保存程序，这样一个完整的荧光拍摄程序就建好了。

2）：设置Background
在拍摄界面上方点击Background按钮切换到背景图像编辑界面。

与Foreground的设置相似，Background也可以选择荧光、生物发光、同位素、X光和反射光的拍摄模式，具体程序的设置请参考Foreground的设置，需要注意的是，软件设置了2个X光和一个反射光的默认程序供用户选择，用户可根据具体需求设置。

当一个设置了Background的程序点击Capture拍摄时，软件会要求提供保存路径，拍完之后两张图像直接存储且在MI软件中打开，Background叠加Foreground后显示，Foreground图像除了以拍摄日期、时间、拍摄模式、激发和发射滤光片的标准方式命名外，后缀还会加上Frgrnd 的字样，而Background图像的后缀会加上Bckgrnd字样。

大家可以看到这种图片的文件名最后还带有一个星号，这表示经过调节之后的图像还未被保存，将图像保存后，星号消失。

【图像调整】
1、MI软件简介
双击桌面图标Bruker MI SE打开MI软件，最上方的菜单栏中有File、Edit、Mode、Shou、Window和Help几个选项。

File可以打开，搜索，关闭，保存和输出图像、数据等。

Help中可以找到各个软件和硬件的说明
书。

Navigation里的工具可以对图像进行编辑，打开Image Display菜单栏对图像进行调节，Protocol按钮用于打开Protocol。

Multiplex打开以后，可以对最多4色图像，或者4个不同模式成像的图像进行叠加。

Intansity Scale用于打开或收起Scale。

2、图像的打开与编辑
打开一张图像，点击Image Display按钮，按加号打开功能菜单，对图像进行编辑。

【图像保存】
1、单击左侧菜单栏“file”——“save”/“save as”进行保存，保
存为MI软件默认格式*.bip；
2、图像导出：单击菜单栏“file”——“export data”——“Image…”
导出图像为相应格式，如*.BMP，*.JPG等。

【关机】
原则上小动物活体成像不建议关机，只需要在不使用时将仪器计算机关闭即可，仪器自动进入待机状态；若连续2个月以上不进行实验，则根据情况关机，关机顺序和开机顺序相反。