植物花药培养及单倍体植株鉴定-2015资料

一、实验目的与原理
目的： 掌握植物花药离体培养技术； 掌握单倍体植株鉴定的方法； 了解单倍体育种的意义。 原理： 利用组织培养技术对植物花药进行离体 培养，诱导产生再生植株。通过形态观察 和染色体分析鉴定单倍体植株，作为新的 遗传资源和选择材料。
花药培养基本流程：
选择合适的供体植株
预处理花药（物理或生理逆境） 收集具有胚性小孢子的花药 培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体

一般而言，单核期（第一次有丝 分裂前）对诱导反应最敏感，为 最佳培养期。
形成双核后，在合适的条件下， 主要由营养细胞分裂产生胚状体 。
营养细胞
生殖细胞
精子
花粉的发育
花药切片显微观察
单核靠边期
四分体时期
烟草花粉发育时期的检测： 一般将植物的花药置于载玻片上压碎，加1-2滴1% 醋酸洋红染色，再进行镜检，以确定花粉发育时期。
植物花药培养及单倍体植株鉴定
20学时
高俊山
安徽农业大学生命科学学院
花药培养：是指将未成熟的花药接种 在人工培养基上分化成为植株的过程。 属于器官培养。
供体植株 小孢子（n）
花培
雄核发育
花粉植株 （ n）
自然加倍 人工加倍
纯合植株DH （2n）
一年内获得纯系
常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。
花药培养过程
消毒
预处理 取花药 培养 接种
取花蕾（镜检）
愈伤组织发生
① 预处理
• 预处理是小孢子培养成功的前提条件。
• 预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能
多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径
（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理 能使绿苗产量大量增加。 • 预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理， 包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。
处于不同发育阶段的烟草花芽
不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期 发育时期 减数分裂期 四分孢子期 单核早中期 草莓、番茄 葡萄 石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯 物种
单核晚期
单核早期至晚期 单核早期至双核期
荔枝、茄子、青椒、小麦
烟草 梨、水稻、甘蓝
四分孢子期至双核期 玉米
2.花药离体培养
（1）取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适 宜的花蕾。（考虑供体植物基因型、生理状态） （2）消毒 70％酒精擦洗花蕾表面，70％酒精浸泡1530s后，在1％次氯酸钠溶液中浸泡8-10min或在0.1％的 氯化汞溶液中消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次。 （3）接种 剥去萼片和花瓣，将花药取出。去除花丝， 但不应使花药受到损伤。 （4）培养 先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形 成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3 周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。
烟草花药培养，4℃低温预处理2-3天。
② 培养基
主要为MS、H、N6、B5和Nitsch培养基，在此 基础上发展出一些其它的培养基。 H培养基（基本成分+ 6-BA/KT 2mg/L+ NAA/2,4-D 0.2mg/L+ 30g/L蔗糖+ 7g/L琼脂+ 1g/L活性炭，pH值 5.5-5.8）上诱导愈伤组织；愈伤组织形成后转移到H培 养基（ 基本成分+ NAA 2mg/L+ 6-BA 0.2mg/L+ 20g/L 蔗糖+ 7g/L琼脂）上分化成苗。 1/2 MS培养基+ 激素+ 蔗糖+ 琼脂+ 活性炭
类别
大 量 元 素 化合物 KNO3 NH4NO3 MgSO4· 7H2O CaCl2 · 2H2O KH2 PO4 MnSO4· 4H2O ZnSO4· 7H2O H3BO3 Na2MoO4· 2H2O CuSO4· 5H2O Na2· EDTA FeSO4· 7H2O 盐酸硫胺素(B1) 盐酸吡哆素(B6) 甘氨酸 叶酸 烟酸 生物素(维生素H) 培养基浓度 (mg/L) 950 720 185 166 68 25 10 10 0.25 0.025 37.3 27.8 0.5 0.5 2 0.5 5 0.05 母液扩大 500mL 母 液 每 升 培 养 基 取 倍数 中药品量(g) 母液的量(ml) 9.5 7.2 50 20倍 1.85 1.66 0.68 2.5 1.0 5 200倍 1.0 0.025 0.0025 3.73 5 200倍 2.78 0.05 0.05 5 200倍 0.2 0.05 0.5 0.005
胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株
单倍体植株鉴定
二、实验内容
1、镜检花粉发育时期
2、花药离体培养 2.1 取样 2.2 消毒 2.3 接种 2.4 培养
3、单倍体植株的鉴定
三、实验器材
材料：烟草花药。 试剂：MS培养基、N6培养基、B5培养基、 酒精、2,4-D、NAA、KT、蔗糖、醋酸洋红、 蒸馏水。 仪器：电子天平、磁力加热搅拌器、普 通光学显微镜、微波炉、pH计、培养箱、 超净工作台、高压灭菌锅、镊子、剪刀、 解剖针、烧杯、试剂瓶、三角瓶、封口膜、 橡皮筋、低温冰箱。
四分体: 醋酸洋红染色
单核期
双核期
四分体: Alexander’s 染色
成熟花粉粒
液泡
单核晚期
第一次有丝分裂后期
生殖核
营养核 生殖核 双核早期 双核中期
烟草花粉发育时期的确定
烟草花粉培养，选择单核靠边期的花药，培养效果最好。
从烟草花的外部形态变化来看，
Fra Baidu bibliotek
当花蕾的花冠长度与花萼的长
度相等时，花药里面的多数花 粉粒正处于单核靠边的阶段。
四、实验步骤
1.适期花药的选择
花药中的花粉是由生殖细胞
（体细胞）经过减数分裂而来，
其染色体只是体细胞中的一半， 如果通过一定的途径将花粉培 养成植株，获得单倍体植株。 再经过染色体加倍，得到纯合
的二倍体，大大缩短育种进程。
花粉发育时期： 被子植物的花粉发育可分为四分体期、单核期（小孢子期）、 二核期和三核期（雄配子期）4个时期。
高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织形成。
铁盐对花粉胚状体发育很重要。
活性炭促进胚状体发育。
较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织；
较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。
细胞分裂素可促进胚状体形成；
生长素可诱导愈伤组织形成。
细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗。
氨基酸 有机附加物
H培养基的配制