植物花药培养及单倍体植株鉴定-2015资料
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花药培养
基础知识 （三）影响花药培养的因素
一、材料的选择：
1.月季的花药培养时间选在月季的 初花期 。 2.选择合适的花粉发育时期: 单核期 ，细胞核由中央移向 细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。 为了挑选到此时期的花药，通常选择完全未开放的 花蕾。 二 培养基 激素：KT：激动素
（一）材料的选取
选择花药时，一般通过镜检来确定其 中的花粉是否处于适宜的发育期。 最常用的方法有 醋酸洋红法 。但是，某 些植物的花粉细胞核不易着色，需采 用 焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染 成 蓝黑色。
凡是种子有果皮包被着， 胚珠有子房壁包被着的植物， 就叫做被子植物。
被子植物：种类繁多，占地球上所有植物种类的2/3。
被 子 植 物
双子叶植物
种子的胚具有 两片子叶
单子叶植物
种子的胚具有一片子叶
花的结构
被子植物的双受精作用
精 子 （1个） 卵细胞（1个） 精子（1个）
受精作 用
受精卵
发育
胚 胚乳
专题三 植物组织培养
课题2 花药培养
课题背景
• 实验证明：植物的生殖细胞也可以和体 细胞一样，在离体条下，具有发育成 完整植株的潜能。 • 目前，已有250多种高等植物的花药培养 获得成功。 • 花药培养在育种上有特殊的意义：单倍 体育种。
一、基础知识
（一）、被子植物花粉的发育 被子植物： 花的结构： 种子与果实的发育过程 花粉的形成过程
基础知识 （二）产生花粉植株的两条途径
脱分化
分化 胚状体 丛芽 再分化 诱 导
丛芽
花粉
脱分化
生根
移栽
花粉
愈伤组织
取决于培养基中激素的种类及其浓度配比
第7章_花药培养及单倍体育种
第一节 单倍体及单倍体育种
一、单倍体的概念及其来源
1、概念 单倍体(haploid)：是指具有配子体染色体数（n） 的孢子体(植物个体)。 单倍体有一元单倍体和多元单倍体。
南瓜的单倍体和二倍体 的雄花和雌花
单倍体植物的特点：
体细胞染色体数减半； 生长发育弱，体形小、各器
官明显减小； 雌、雄配子严重败育，有的
生根培养：将分化出的芽苗转入含NAA的生根培 养基中，一般2周左右可形成根。
烟草花粉植株的生根培养基： 1/2 MS + 2%蔗 糖 + 0.5%琼脂。
壮苗培养：在生根培养基或基本培养基中添加 多效唑（1-3mg/L），提高蔗糖浓度（5-8%）。
培养条件： 25 ℃，光照下。
花粉植株的驯化移植
② 激素选择
烟草和毛曼陀罗：仅含蔗糖的琼脂板 茄子花药培养中： MS＋2,4-D 0.5 mg/L＋KT 1mg/L
n 93.8% 2n 6.2% MS＋2,4-D 2 mg/L ＋ KT 1mg/L
n 64,1% 2n 35.9%
③ 蔗糖：一般为3％～15％
烟草和油菜：2～3％诱导花粉胚； 水稻：3～6％诱导愈伤，分化时2～3％； 小麦：8～11％麦芽糖诱导愈伤，分化时5～8％蔗 糖； 玉米：12～15％诱导愈伤； 甘蔗：高达20％。
➢ 二，认为小孢子发育过程中花药内源激素平衡在 不断改变，随花药的成熟，激素平衡变得不适合 小孢子的生长和分裂，或脱分化必须的一些物质 被消耗尽，从而引起培养效果不佳。
花粉发育时期的确定
•鉴定花粉发育时期的方法可用涂片法来进行。 •为方便起见，可找出与花粉发育时期相对应的形 态学指标。
（3） 花药预处理
体细胞干扰 生殖细胞的自发加倍 培养过程的各种影响因素
一、单倍体的概念及其来源
1、概念 单倍体(haploid)：是指具有配子体染色体数（n） 的孢子体(植物个体)。 单倍体有一元单倍体和多元单倍体。
南瓜的单倍体和二倍体 的雄花和雌花
单倍体植物的特点：
体细胞染色体数减半； 生长发育弱，体形小、各器
官明显减小； 雌、雄配子严重败育，有的
生根培养：将分化出的芽苗转入含NAA的生根培 养基中，一般2周左右可形成根。
烟草花粉植株的生根培养基： 1/2 MS + 2%蔗 糖 + 0.5%琼脂。
壮苗培养：在生根培养基或基本培养基中添加 多效唑（1-3mg/L），提高蔗糖浓度（5-8%）。
培养条件： 25 ℃，光照下。
花粉植株的驯化移植
② 激素选择
烟草和毛曼陀罗：仅含蔗糖的琼脂板 茄子花药培养中： MS＋2,4-D 0.5 mg/L＋KT 1mg/L
n 93.8% 2n 6.2% MS＋2,4-D 2 mg/L ＋ KT 1mg/L
n 64,1% 2n 35.9%
③ 蔗糖：一般为3％～15％
烟草和油菜：2～3％诱导花粉胚； 水稻：3～6％诱导愈伤，分化时2～3％； 小麦：8～11％麦芽糖诱导愈伤，分化时5～8％蔗 糖； 玉米：12～15％诱导愈伤； 甘蔗：高达20％。
➢ 二，认为小孢子发育过程中花药内源激素平衡在 不断改变，随花药的成熟，激素平衡变得不适合 小孢子的生长和分裂，或脱分化必须的一些物质 被消耗尽，从而引起培养效果不佳。
花粉发育时期的确定
•鉴定花粉发育时期的方法可用涂片法来进行。 •为方便起见，可找出与花粉发育时期相对应的形 态学指标。
（3） 花药预处理
体细胞干扰 生殖细胞的自发加倍 培养过程的各种影响因素
第4章 花粉培养和单倍体育种
花药培养和单倍体育种
5
第一节
相关知识基础三、花药培养的简和概况• 第一个被发现的单倍体植物是1921年Bergner在蔓陀罗植物 群体中发现的。发现单倍体植物后不久，1924 Blakeslee和 Belling就提出了在植物育种中利用单倍体减少杂交后代分离， 加速性状稳定，缩短育种年限的设想。 • 由于自然条件下出现的单倍体很少，此后育种学家和植物学 家的工作主要集中在对单倍体植株的人为诱导方面。由于当 时组织培养技术的水平还很低，直到 1964年才由Guha和 Maheshwari利用花药培养的方法在毛叶蔓陀罗这个植物种上 取得成功。
花药培养和单倍体育种
15
第二节
花药培养技术
二、选材
• 有研究结果表明，发育落后的花粉在培养条件下有发 育成愈伤组织或胚的更大可能，并将这部分花粉称为 胚性花粉。 • 在大麦中，花药下半部的异常花粉的比例比花药上半 部的比例高，因此，由花药下半部的花粉形成的愈伤 组织也比上半部要多。 • 异常花粉并不是愈伤组织的唯一起源，正常的花粉也 是可以形成愈伤组织或胚的，不过两者在对培养基的 反应程度有不同。
花药培养和单倍体育种
9
第一节
相关知识基础
四、花粉的发育过程
• 减数分裂 有丝分裂 胼胝质壁溶解 • 小孢子母细胞 2个小孢子 4个小孢子 单个小孢子
• 形成大液泡，分裂 积累储藏物质 • 单个小孢子 营养细胞…………在花粉管伸长过程中退化 • + 分裂 • 生殖细胞 2个精子……（双受精）
花药培养和单倍体育种
花药培养和单倍体育种
13
第二节
花药培养技术
二、选材
• 花粉发育时期的确定一般采用对花药进行染色压片后在显 微镜下观察的方法。染色的染料一般是醋酸洋红，也叫醋 酸卡红（acetocarmine）。通过染色可以简单地辨别减数分 裂前期的花粉母细胞，减数分裂后的四分体初期和后期， 单核期和双核期等。 • 在染色镜检后，通过建立花粉适当时期和植株某些器官的 发育阶段特征的联系就可以进行准确有效的选材。例如， 水稻采样的合适时期是剑叶完全抽出后剑叶叶片基部距离 前一片叶的叶片基部2-10厘米左右时；矮牵牛是花瓣开始 显色的时候。
植物花药培养
3.外植体的预处理 3.外植体的预处理
在花药接种之前，先对其进行预处理往往可以提高诱导 率。适宜的温度和时间处理可改善小抱子代谢活动，并 利于小抱子适应离体后的培养环境，促使大部分的小抱 子得以正常生长。处理时间过长，超过小抱子耐受力， 导致小抱子受伤，细胞核解体，反而降低了材料的出愈 率，影响绿苗分化% 处理时间过短，由于母体与离体培 养条件相差悬殊，小抱子在生理上不适应，同样也会造 成小抱子死亡或发育迟缓。
二、预处理与消毒
1.材料的预处理：最常用的是低温预处理，将
采取的新鲜花药用湿纱布包裹后再用塑料袋套 起，放在冰箱中预处理。不同材料所需的温度 和时间不同。 低温预处理是草莓花培养中的一个重要步骤， 其作用主要是改善花粉的生理状态， 延缓花粉 退化，提高内源激素的水平，启动雄核发育， 能显著提高花药诱导率。
75﹪酒精溶液的制备：
倒取150mL无水乙醇于500mL中，加入50mL的 蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀。
MS培养基（单位：mg/L）
NH4NO3 KNO3 KH2PO4 MgSO4·H2O CaCl2·2H2O FeSO4·7H2O Na2-EDTA MnSO4·4H2O 1650 1900 170 370 440 27.85 37.25 22.3 ZnSO4·7H20 H3BO3 KI Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H20 甘氨酸 盐酸硫胺素 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 2 0.4 盐酸吡哆醇 盐酸 肌醇 蔗糖 琼脂 PH 0.5 0.5 100 30000 1000 5.8
2.培养
通常每瓶接种花药7-10个，温度控制在25℃左右，不需 要光照。幼小植株形成后才需要光照。 一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤 组织或释放出胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养 基上，以便进一步分化出再生植株。
(第七章)第八章植物花药(花粉)培养
第四节
花药培养
（2）材料生理状态 花药供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导 率有直接影响。 对水稻、小麦和大麦等禾本科植物而言，大田植株 比温室植株、主茎穗比分蘖穗花粉愈伤组织的诱导率都 明显的要高。不同季节接种的花药愈伤组织诱导率也有 显著变化，例如：水稻，早造比晚造接种的愈伤组织诱 导率要高；烟草，开花早期比开花晚期的花药可产生更 多的花粉植株；小麦，早期接种比晚期接种的材料愈伤 组织诱导率可提高2～3倍。说明供体植株的生态环境， 特别是温度和光周期可能对花粉发育及其对离体培养的 反应有重要影响。
第二节
花药和小孢子的发育
（以烟草花粉发育过程为例，说明被子植物花粉发 育过程，P222） 第一期：小孢子母细胞经减数分裂形成孢子四 分体，随胼胝质分解，4个小孢子分离。 第二期：小孢子为球形细胞，核大，有液泡， 挤核靠边（单核靠边期），期末细胞明显增大，细 胞壁特化，小孢子进行第一次花粉细胞有丝分裂 （不对称），形成2个不均等的细胞。 第三期：小孢子细胞中有2个核。 在离体培养条件下，花粉发育偏离正常发育途 径，第一次花粉细胞有丝分裂是对称的，结果形成 两个形态和体积相等的细胞，把此作为B型。
第四节
花药培养
2、材料预处理 对所取用的穗子或花蕾，进行低温、激素（生长 素）或其他方法预处理，能有效提高愈伤组织诱导 率和苗分化率。 （1）低温预处理： 一般是将材料置于冰箱5～10℃下冷藏一定时 间再接种。处理时间视不同植物而定，水稻在5～ 10℃时为5～8天，烟草在7～9℃时为7～14天。 同种植物不同品种的要求也有差异，需作试验比较 才能确定。
第四节
花药培养
3、材料灭菌： 取回的材料，在接种前必须进行表面灭菌。一 般方法是先用70～75%酒精擦洗穗子和花蕾的外 部苞叶，然后用0.1%升汞浸泡7～10分钟（水稻、 玉米等需剥取穗子浸入消毒液）或用饱和漂白粉溶 液浸泡10～20分钟以灭菌，最后用无菌水冲洗3～ 5次，供接种用。 材料灭菌是花药培养成功与否的一个重要环节， 此关不过，谈不上什么培养。
花药离体培养获得单倍体的原理
花药离体培养获得单倍体的原理花药离体培养获得单倍体是一种常用的植物遗传学技术，其原理是利用花药中的生殖细胞在合适的培养条件下分裂分化，最终得到单倍体植株。
花药是花的雄性生殖器官，包括花粉和花丝。
花药离体培养一般以花期结束后的花药为材料，经过消毒处理后，将其放置在含有适当濃度植物生长调节剂的培养基中，控制温度、光照和湿度等条件，使其逐渐分裂分化生成胚胎或胚愈伤组织。
在特定培养基配方和培养环境的作用下，胚胎或胚愈伤组织可以继续发育，分化出合适的植株。
这种技术的优点在于可以在短时间内大批量地获得同源性强、单倍体的植株，有助于植物育种、品种改良等研究工作的开展。
同时，这种方法适用于不同种类的花卉，包括樱花、玫瑰、百合、茉莉等，可以充分利用植物遗传资源，提高植物的遗传多样性。
此技术同样适用于果树、蔬菜等植物的研究。
然而，花药离体培养也存在着一些缺点和限制。
例如由于植物细胞易被污染所致的不稳定性大、培养环境的影响等，植株的发育率和质量难以保证，需要经过精心的操作和长期的观察和培养。
此外，还要考虑到减数分裂过程中的染色体異變且难以控制，可能导致基因结构改变和表达的不正常，影响植株的生长和遗传稳定性。
总之，花药离体培养是一种有效的植物遗传学技术，可以使植物在较短时间内分化出单倍体的植株，具有重要的科研和实践价值。
但
同时也需要充分了解各种因素的影响，切实提高技术操作水平，才能达到理想的效果。
植物花药培养及单倍体植株鉴定-
四、实验步骤
1.适期花药的选择
花药中的花粉是由生殖细胞 （体细胞）经过减数分裂而来， 其染色体只是体细胞中的一半， 如果通过一定的途径将花粉培 养成植株，获得单倍体植株。 再经过染色体加倍，得到纯合 的二倍体，大大缩短育种进程。
花粉发育时期： 被子植物的花粉发育可分为四分体期、单核期（小孢子期）、
白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。
（二）白化苗的控制 通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行 调控。
3.单倍体植株的鉴定 通过花药培养获得的再生植株的染色体数目也常
发生变异，其后代常是混倍体，所以必须对其后代进 行鉴定。
鉴定方法既可以根据形态特征进行间接鉴定，也 可以镜检体细胞中的染色体数或花粉母细胞中染色体 数以及染色体配对的情况进行直接鉴定。此外还可以 根据花粉的育性或利用遗传标记性状进行鉴定。
0.5
0.05
0.5 2
200倍
0.05 0.2
5
0.5
0.05
5
0.5
0.05
0.005
类别 化合物
大 KNO3 量 NH4NO3 元 MgSO4·7H2O 素 CaCl2 ·2H2O
KH2 PO4 MnSO4·4H2O 微 ZnSO4·7H2O 量 H3BO3 元 KI 素 Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2.6H2O 铁 Na2·EDTA 盐 FeSO4·7H2O 盐酸硫胺素(B1) 有 盐酸吡哆素(B6) 机 甘氨酸 物 烟酸
醋酸洋红染色，再进行镜检，以确定花粉发育时期。
四分体: 醋酸洋红染色
单核期
双核期
四分体: Alexander’s 染 色
成熟花粉粒
液泡
植物花药培养和单倍体育种
植物花药培养和单倍体育种
----------生技3091
单倍体育种
• 单倍体：是指具有配子染色体组成的 细胞或个体
获得单倍体的途径
• 1，花药培养：把整个花药接种到培养基上， 花药培养：把整个花药接种到培养基上， 在离体培养条件下， 在离体培养条件下，使其小孢子诱导形成 单倍体的孢子体。 单倍体的孢子体。 • 2，花粉培养：是把花粉从花药中分离出来 花粉培养： 接种到培养基上，在离体培养条件下， 接种到培养基上，在离体培养条件下，诱 导形成单倍体的孢子体。 导形成单倍体的孢子体。 • 3，远缘杂交授粉：利用远缘杂交不亲和， 远缘杂交授粉：利用远缘杂交不亲和， 刺激卵细胞单性发育的特点， 刺激卵细胞单性发育的特点，通过亲缘关 系较远的种间或属间杂交， 系较远的种间或属间杂交，有时可获得少 量的单倍体。 量的单倍体。
2
拜拜
hui
• 4，延迟授粉：去雄后延迟授粉，可以提高 延迟授粉：去雄后延迟授粉， 孤雌生殖的发生频率. 孤雌生殖的发生频率.
• 5，照射花粉授粉：花粉经X射线处理后， 照射花粉授粉：花粉经X射线处理后， 给去雄的母体授粉，可诱发单倍体的产生。 给去雄的母体授粉，可诱发单倍体的产生。
• 6，化学处理：用一些化学药剂处理花柱， 化学处理：用一些化学药剂处理花柱， 柱头或子房可诱导单倍体的产生。 柱头或子房可诱导单倍体的产生。
fmvkls
• 3，接种 • 在超净工作台上用镊子剥去部分花冠，露 在超净工作台上用镊子剥去部分花冠， 出花药，夹住花丝取出花药置于培养皿中， 出花药，夹住花丝取出花药置于培养皿中， 或用接种环蘸取花药接种于培养基上。接 或用接种环蘸取花药接种于培养基上。 种密度宜高，以促进“集体效应”的发挥， 种密度宜高，以促进“集体效应”的发挥， 有利于提高诱导率。 有利于提高诱导率。 • 注意： 注意： • 1,尽量避免损伤花药，以免从受伤处产生 1,尽量避免损伤花药 尽量避免损伤花药， 药壁愈伤组织。 药壁愈伤组织。 • 2，注意彻底去除花丝部分，因为接种与花 注意彻底去除花丝部分， 丝相连的花药时， 丝相连的花药时，往往不利于花药内小孢 子的启动，以及愈伤组织或胚状体的形成。 子的启动，以及愈伤组织或胚状体的形成。
----------生技3091
单倍体育种
• 单倍体：是指具有配子染色体组成的 细胞或个体
获得单倍体的途径
• 1，花药培养：把整个花药接种到培养基上， 花药培养：把整个花药接种到培养基上， 在离体培养条件下， 在离体培养条件下，使其小孢子诱导形成 单倍体的孢子体。 单倍体的孢子体。 • 2，花粉培养：是把花粉从花药中分离出来 花粉培养： 接种到培养基上，在离体培养条件下， 接种到培养基上，在离体培养条件下，诱 导形成单倍体的孢子体。 导形成单倍体的孢子体。 • 3，远缘杂交授粉：利用远缘杂交不亲和， 远缘杂交授粉：利用远缘杂交不亲和， 刺激卵细胞单性发育的特点， 刺激卵细胞单性发育的特点，通过亲缘关 系较远的种间或属间杂交， 系较远的种间或属间杂交，有时可获得少 量的单倍体。 量的单倍体。
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• 4，延迟授粉：去雄后延迟授粉，可以提高 延迟授粉：去雄后延迟授粉， 孤雌生殖的发生频率. 孤雌生殖的发生频率.
• 5，照射花粉授粉：花粉经X射线处理后， 照射花粉授粉：花粉经X射线处理后， 给去雄的母体授粉，可诱发单倍体的产生。 给去雄的母体授粉，可诱发单倍体的产生。
• 6，化学处理：用一些化学药剂处理花柱， 化学处理：用一些化学药剂处理花柱， 柱头或子房可诱导单倍体的产生。 柱头或子房可诱导单倍体的产生。
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• 3，接种 • 在超净工作台上用镊子剥去部分花冠，露 在超净工作台上用镊子剥去部分花冠， 出花药，夹住花丝取出花药置于培养皿中， 出花药，夹住花丝取出花药置于培养皿中， 或用接种环蘸取花药接种于培养基上。接 或用接种环蘸取花药接种于培养基上。 种密度宜高，以促进“集体效应”的发挥， 种密度宜高，以促进“集体效应”的发挥， 有利于提高诱导率。 有利于提高诱导率。 • 注意： 注意： • 1,尽量避免损伤花药，以免从受伤处产生 1,尽量避免损伤花药 尽量避免损伤花药， 药壁愈伤组织。 药壁愈伤组织。 • 2，注意彻底去除花丝部分，因为接种与花 注意彻底去除花丝部分， 丝相连的花药时， 丝相连的花药时，往往不利于花药内小孢 子的启动，以及愈伤组织或胚状体的形成。 子的启动，以及愈伤组织或胚状体的形成。
植物花药培养及单倍体植株鉴定 PPT课件
收集具有胚性小孢子的花药 培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体
胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株 单倍体植株鉴定
二、实验内容
1、镜检花粉发育时期
2、花药离体培养 2.1 取样 2.2 消毒 2.3 接种 2.4 培养
3、单倍体植株的鉴定
三、实验器材
➢材料：烟草花药。 ➢试剂：MS培养基、N6培养基、B5培养基、 酒精、2,4-D、NAA、KT、蔗糖、醋酸洋红、 蒸馏水。 ➢仪器：电子天平、磁力加热搅拌器、普 通光学显微镜、微波炉、pH计、培养箱、 超净工作台、高压灭菌锅、镊子、剪刀、 解剖针、烧杯、试剂瓶、三角瓶、封口膜、 橡皮筋、低温冰箱。
培养基浓度 母液扩大 500mL 母 液 每 升 培 养 基 取
(mg/L)
倍数
中药品量(g) 母液的量(ml)
950
9.5
720 185
20倍
7.2 1.85
50
166
1.66
68
0.68
25
2.5
10 10
200倍
1.0 1.0
5
0.25
0.025
0.025
0.0025
37.3
200倍 3.73
⑤ 白化苗现象
（一）白化苗产生的影响因素及机理 1、内因 供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、
花粉发育时期。 2、外因 预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养
条件和方法、愈伤组织转分化时间等。 3、机理 核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生
白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。
（二）白化苗的控制 通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行 调控。
5
胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株 单倍体植株鉴定
二、实验内容
1、镜检花粉发育时期
2、花药离体培养 2.1 取样 2.2 消毒 2.3 接种 2.4 培养
3、单倍体植株的鉴定
三、实验器材
➢材料：烟草花药。 ➢试剂：MS培养基、N6培养基、B5培养基、 酒精、2,4-D、NAA、KT、蔗糖、醋酸洋红、 蒸馏水。 ➢仪器：电子天平、磁力加热搅拌器、普 通光学显微镜、微波炉、pH计、培养箱、 超净工作台、高压灭菌锅、镊子、剪刀、 解剖针、烧杯、试剂瓶、三角瓶、封口膜、 橡皮筋、低温冰箱。
培养基浓度 母液扩大 500mL 母 液 每 升 培 养 基 取
(mg/L)
倍数
中药品量(g) 母液的量(ml)
950
9.5
720 185
20倍
7.2 1.85
50
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1.66
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0.68
25
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0.025
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200倍 3.73
⑤ 白化苗现象
（一）白化苗产生的影响因素及机理 1、内因 供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、
花粉发育时期。 2、外因 预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养
条件和方法、愈伤组织转分化时间等。 3、机理 核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生
白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。
（二）白化苗的控制 通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行 调控。
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植物单倍体植株的倍性鉴定
有更大的应用 价值 可见 ， 流式细胞分析仪 的特 点是快 速、 便 、 利用 方 准
方法 。
定法 、 染色中心直径和异 染 色质数 目以及植株 形态观察 等 间接 鉴定法的应 用进展 ， 并对各 自的优缺 点作 了简要
的评述。
总之 ， 多文献都表明染色体 计数法 是可靠 性最 高 许
的植株倍性鉴定的直接方法， 但操作复杂， 需要装备 良 好的实验室条件和熟练的细胞学操作技术， 鉴定速度 慢 ， 费力 ， 且 当染 色 体数 目太 多 时 也 可 能 造 成 费时 而
定法 。
１ 直接鉴 定法
直接鉴定法 即染色体计 数法 ， 这是 确定倍性 最基本
和最可靠 的方法 。通 常以根尖 、 茎尖 、 幼叶 、 叶片愈伤组 织或卷须为 材料 ， 采用压片法和去壁低 渗法 进行染色体 标本制备 ， 卡宝 品红 、 酸洋红 或铁矾 一苏 木精等 需用 醋
染色液进行 染色 、 镜检和计数 。
单倍体花粉粒在开花前即败育双单倍体花粉粒发育正常三倍体的花粉粒绝大多数败育仅有少量正常花粉粒大多数单倍体生长势明显弱于双单倍体和三倍体黄瓜单倍体植株较二倍体植株具有长势较弱叶片较小花瓣裂片深等特点单倍体不能正常结子雄花败育雌雄花花冠明显深裂等特征这些特征可作为区分黄瓜单倍体和二倍体植株的形态指标1副
误差。
关键词 ： 再生植 株； 体 ； 单倍 倍性鉴定 ； 作物育种
中图分类号 ： ４ ． 文献标 识码 ： Ｑ ９４６ Ｂ 文章编号 ：０１ ００ 【０ ７０ －０４ － ０ １０ － ０ ９２０ ）１ ０９ ３
２ 间接鉴定 法
单倍体育种是 ２ 世 纪 ７ 年 代发展起 来 的一 项新 Ｏ Ｏ 与染色体计数 法相 比， 间接 鉴定方 法简便 易 行 ， 但
方法 。
定法 、 染色中心直径和异 染 色质数 目以及植株 形态观察 等 间接 鉴定法的应 用进展 ， 并对各 自的优缺 点作 了简要
的评述。
总之 ， 多文献都表明染色体 计数法 是可靠 性最 高 许
的植株倍性鉴定的直接方法， 但操作复杂， 需要装备 良 好的实验室条件和熟练的细胞学操作技术， 鉴定速度 慢 ， 费力 ， 且 当染 色 体数 目太 多 时 也 可 能 造 成 费时 而
定法 。
１ 直接鉴 定法
直接鉴定法 即染色体计 数法 ， 这是 确定倍性 最基本
和最可靠 的方法 。通 常以根尖 、 茎尖 、 幼叶 、 叶片愈伤组 织或卷须为 材料 ， 采用压片法和去壁低 渗法 进行染色体 标本制备 ， 卡宝 品红 、 酸洋红 或铁矾 一苏 木精等 需用 醋
染色液进行 染色 、 镜检和计数 。
单倍体花粉粒在开花前即败育双单倍体花粉粒发育正常三倍体的花粉粒绝大多数败育仅有少量正常花粉粒大多数单倍体生长势明显弱于双单倍体和三倍体黄瓜单倍体植株较二倍体植株具有长势较弱叶片较小花瓣裂片深等特点单倍体不能正常结子雄花败育雌雄花花冠明显深裂等特征这些特征可作为区分黄瓜单倍体和二倍体植株的形态指标1副
误差。
关键词 ： 再生植 株； 体 ； 单倍 倍性鉴定 ； 作物育种
中图分类号 ： ４ ． 文献标 识码 ： Ｑ ９４６ Ｂ 文章编号 ：０１ ００ 【０ ７０ －０４ － ０ １０ － ０ ９２０ ）１ ０９ ３
２ 间接鉴定 法
单倍体育种是 ２ 世 纪 ７ 年 代发展起 来 的一 项新 Ｏ Ｏ 与染色体计数 法相 比， 间接 鉴定方 法简便 易 行 ， 但
植物花药培养及单倍体植株鉴定-资料(1)
植物花药培养及单倍体植株鉴定-资料(1)植物花药培养及单倍体植株鉴定-资料
植物花药培养及单倍体植株鉴定是植物遗传育种研究中非常重要的技术手段。
以下是关于植物花药培养及单倍体植株鉴定的资料，包含其原理、方法及注意事项等。
一、原理
植物花药培养技术是指将花药培养于含有特定培养基的离体培养条件下，形成胚性提取物，用于植物单倍体生产。
其原理是利用培养基的物质成分和生理调节剂，诱导形成胚发育及再生。
二、方法
植物花药培养技术步骤如下：
1. 取新鲜的花药，去除其外围结构，留下中央柱头及花丝；
2. 将花药放入培养基中进行培养；
3. 根据培养基的配方及生理调节剂的添加，诱导花药发育为胚性提取物；
4. 将胚性提取物进行移植再生，得到单倍体植株。
三、注意事项
1. 选择适当的花期，并且花药必须新鲜。
2. 具体培养基和生理调节剂的含量和种类应根据不同植物种类适当调整。
3. 培养过程中需要注意无菌操作，要防止细菌污染。
4. 胚性提取物的移植再生需要根据种类采用不同的方法，比如通过显微植物学技术或化学诱导等方式。
5. 培养过程中还需注意环境条件，如温度、光照等，以促进胚发育。
四、结论
植物花药培养及单倍体植株鉴定是重要的遗传育种技术，在植物新品种的筛选和育种繁殖方面具有广泛的应用前景。
其技术步骤依次为花药采集、培养、胚性提取物的形成及再生和单倍体植株的鉴定。
操作时要选择适当的花期并进行无菌操作，注意物质配比和环境条件的调节，以保证培养成功率。
农学第七章植物花药和花粉培养及单倍体育种
一、花药与花粉培养
一、花药与花粉培养
单倍体植株倍性鉴定 (为什么要进行倍性鉴定？)
诱导效率低，且获得的花粉植株是混合群体! 1)直接鉴定：也叫染色体直接计数法，通常取根尖、茎尖 等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。
一、花药与花粉培养
单倍体植株倍性鉴定 2)间接鉴定
扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）：主要测定叶片单个 细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到 1cm2。 细胞形态学鉴定法：叶片保卫细胞大小、单位面积上的气 孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的 相关性。
一、花药与花粉培养
植物花药与花粉培养的意义 获得纯系材料进行单倍体育种，提高育种效率 利用获得的纯合二倍体材料进行植物遗传规律研究，为 遗传育种提供依据，减少育种的盲目性； 克服远缘杂种的不育性，获得具有双亲优良特性的可育 远缘杂种 利用在远缘杂交F1代花药培养中出现的混倍体和丰富的 染色体变异材料进行基础性研究
一、花药与花粉培养
常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。
供体植株小
花培
花粉植
孢子（n） 雄核发育 株（n）
自然加倍 人工加倍
纯合植株DH （2n）
一年内获得纯系
一、花药与花粉培养
一、花药与花粉培养
表皮------破损
雄 蕊 原 基
花 药 原 始 体
孢原 细胞 (4组)
初生壁细
外层为药室内壁---纤维层 花 粉
二、单倍体育种
二、单倍体育种
1)自发单倍体的发生方式 孤雄生殖途径产生自发单倍体 孤雌生殖途径产生自发单倍体 无配子生殖(无融合生殖)途径产生自发单倍体 体细胞减数分裂途径产生自发单倍体
2)人工诱发单倍体发生 孤雄生殖途径诱导单倍体发生 孤雌生殖途径诱导单倍体发生
第7章 植物单倍体培养
27
四、花药培养 （一）概述
花药培养属于器官培养范畴，一定发育时期的花药在 适当条件下可通过两种途径发育成单倍体植株。 1. 胚发生途径 花粉---原胚---胚状体---单倍体植株 例如：甜椒、茄子、大白菜、油菜 2. 不定器官发生途径 花粉---单倍体愈伤组织---诱导器官分化---单倍体植株 花药培养存在的问题：培养过程中可能受到药壁组织干 扰，可能存在二倍体再生植株，需要进行倍性鉴定。
3 小孢子的培养 （1）液体培养 花粉悬浮液（104/ml）在培养皿中形成约 1mm后的薄层，用封口膜密封后进行培养。 （2）固体平板培养 用液体培养基溶解低熔点琼脂或琼脂糖保 温在40℃条件下使其保持液体状态，将含有花 粉粒的液体培养基与琼脂（糖）培养基混合， 使花粉粒均匀分布在培养基中，在培养皿中铺 一个薄层，凝固后用封口膜密封进行培养。
四、花药培养
（二）花药培养基本程序 2. 灭菌及预处理
未开放的花蕾，常规灭菌后直接取出花药在4~5℃条件 下冷处理2~4d，易产生胚状体。
适宜培养的花药，花蕾尚未开放花药处在严密包被之中， 本身处于无菌状态。通常只要用70％的酒精喷洒获擦拭花 器即可。
适当的预处理可显著提高花药的愈伤组织的诱导率。
25
（二）花粉培养技术
3 小孢子的培养
（3）夹层培养
固体培养基+花粉悬浮液+未凝固培养液
（4）看护培养
Sharp（1972），将番茄完整的花药置于固体培养基上，
在花药上覆盖一张滤纸圆片，用吸管吸取一滴花粉悬浮液滴
在滤纸上进行培养，利用了花药中游离成分，提高雄核发育
诱导率。
26
本章内容
一、单倍体的概念及发生 二、离体小孢子发育 三、小孢子培养 四、花药培养 五、未受精子房及胚珠培养 六、单倍体植株鉴定及染色体加倍 七、单倍体培养的应用
四、花药培养 （一）概述
花药培养属于器官培养范畴，一定发育时期的花药在 适当条件下可通过两种途径发育成单倍体植株。 1. 胚发生途径 花粉---原胚---胚状体---单倍体植株 例如：甜椒、茄子、大白菜、油菜 2. 不定器官发生途径 花粉---单倍体愈伤组织---诱导器官分化---单倍体植株 花药培养存在的问题：培养过程中可能受到药壁组织干 扰，可能存在二倍体再生植株，需要进行倍性鉴定。
3 小孢子的培养 （1）液体培养 花粉悬浮液（104/ml）在培养皿中形成约 1mm后的薄层，用封口膜密封后进行培养。 （2）固体平板培养 用液体培养基溶解低熔点琼脂或琼脂糖保 温在40℃条件下使其保持液体状态，将含有花 粉粒的液体培养基与琼脂（糖）培养基混合， 使花粉粒均匀分布在培养基中，在培养皿中铺 一个薄层，凝固后用封口膜密封进行培养。
四、花药培养
（二）花药培养基本程序 2. 灭菌及预处理
未开放的花蕾，常规灭菌后直接取出花药在4~5℃条件 下冷处理2~4d，易产生胚状体。
适宜培养的花药，花蕾尚未开放花药处在严密包被之中， 本身处于无菌状态。通常只要用70％的酒精喷洒获擦拭花 器即可。
适当的预处理可显著提高花药的愈伤组织的诱导率。
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（二）花粉培养技术
3 小孢子的培养
（3）夹层培养
固体培养基+花粉悬浮液+未凝固培养液
（4）看护培养
Sharp（1972），将番茄完整的花药置于固体培养基上，
在花药上覆盖一张滤纸圆片，用吸管吸取一滴花粉悬浮液滴
在滤纸上进行培养，利用了花药中游离成分，提高雄核发育
诱导率。
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本章内容
一、单倍体的概念及发生 二、离体小孢子发育 三、小孢子培养 四、花药培养 五、未受精子房及胚珠培养 六、单倍体植株鉴定及染色体加倍 七、单倍体培养的应用
植物花粉和花药培养
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4、看护培养
利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。用一 块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使
其生长和增殖。这个愈伤组织块称为看护愈伤组织
此时您正浏览在第36页，共77页。
2.
此时您正浏览在第37页，共77页。
1）在一个培养瓶中加入一定量厚
Guha和Maheshwari （1964） 曼陀罗花药培养 Nitsch 和 Norreel (1973) 烟草花粉培养（游离小孢子培养） Chu（1973）
小麦花粉培养
（早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自发 形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低）
80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子培养已经成 功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。
5、用于遗传转化
能直接表达外源基因，不受显隐性影响
此时您正浏览在第18页，共77页。
第二节 花粉孢子体发育途径
概念：花粉孢子体发育途径（雄核发育途径）
花粉是产生花粉植株的原始细胞，其第一次有丝分裂， 在本质上与合子的第一次孢子体分裂相似，把花粉形成植株
的途径称为花粉孢子体发育途径，也叫雄核发育途径
例子：
二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合
单株
常规方法： AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb
区分开。
AB
AB AABB aB aABB Ab AabB ab aAbB
aB
Ab
ab
AaBB aaBB AabB aabB
AABb aABb AAbb aAbb
AaBb aaBb Aabb aabb此时您正浏览在第Fra bibliotek2页，共77页。
4、看护培养
利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。用一 块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使
其生长和增殖。这个愈伤组织块称为看护愈伤组织
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2.
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1）在一个培养瓶中加入一定量厚
Guha和Maheshwari （1964） 曼陀罗花药培养 Nitsch 和 Norreel (1973) 烟草花粉培养（游离小孢子培养） Chu（1973）
小麦花粉培养
（早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自发 形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低）
80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子培养已经成 功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。
5、用于遗传转化
能直接表达外源基因，不受显隐性影响
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第二节 花粉孢子体发育途径
概念：花粉孢子体发育途径（雄核发育途径）
花粉是产生花粉植株的原始细胞，其第一次有丝分裂， 在本质上与合子的第一次孢子体分裂相似，把花粉形成植株
的途径称为花粉孢子体发育途径，也叫雄核发育途径
例子：
二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合
单株
常规方法： AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb
区分开。
AB
AB AABB aB aABB Ab AabB ab aAbB
aB
Ab
ab
AaBB aaBB AabB aabB
AABb aABb AAbb aAbb
AaBb aaBb Aabb aabb此时您正浏览在第Fra bibliotek2页，共77页。
3种苜蓿花粉组织培养与单倍体鉴定
3种苜蓿花粉组织培养与单倍体鉴定通过苜蓿花药或花粉培养获得单倍体,进一步利用纯系材料杂交育种,可充分发挥杂种优势,缩短育种年限并提高育种效率。
本研究以花药为材料对草原1号杂花苜蓿、呼伦贝尔黄花苜蓿和新疆大叶紫花苜蓿进行花粉组织培养,通过固体与液体悬浮培养基、不同激素配比进行正交试验诱导花药愈伤组织,分化和生根培养后获得再生植株,建立适宜的花药组培再生体系;再生植株经气孔数初选、根尖染色体和流式细胞仪鉴定,确定染色体倍性。
主要研究结果如下:(1)花药愈伤组织的诱导,草原1号杂花苜蓿固体培养基优于液体悬浮培养基,而呼伦贝尔黄花苜蓿与新疆大叶紫花苜蓿液体悬浮培养基优于固体培养基,出愈率最高值分别为83.33%、70.00%、83.33%。
根据正交试验出愈率极差的分析,草原1号杂花苜蓿适宜的固体培养基为B5 +0.4 mg/L NAA+ 0.75 mg/L 2,4-D + 1.0 mg/L KT + 0.75 mg/L 6-BA;呼伦贝尔黄花苜蓿适宜的液体悬浮培养基为B5 + 0.4 mg/LNAA + 0.50 mg/L 2,4-D +3.0 mg/L KT +0.25 mg/L 6-BA;新疆大叶紫花苜蓿适宜的液体悬浮培养基为 MS + 0.2 mg/L NAA+ 2.0 mg/L 2,4-D + 3.0 mg/LKT+ 0.5mg/L 6-BA。
(2)影响3种苜蓿花药愈伤组织形成的主要激素种类不同。
在固体培养过程中花药愈伤形成主要因素,草原1号杂花苜蓿为KT、呼伦贝尔黄花苜蓿及新疆大叶紫花苜蓿为2,4-D;在液体悬浮培养过程中花药愈伤形成主要因素,草原1号杂花苜蓿雄性不育株为KT、雄性可育植株为6-BA、呼伦贝尔黄花苜蓿及新疆大叶紫花苜蓿为2,4-D。
(3)3种苜蓿花药愈伤分化培养的适宜培养基为MS + 1.0 mg/L KT +0.2 mg/L NAA,分化率 58.33%-73.33%。
(4)草原1号杂花苜蓿雄性不育植株、呼伦贝尔黄花苜蓿及新疆大叶紫花苜蓿花药培育再生植株中单倍体植株分别为4株、1株、7株,分别占各自总株数的8.51%、20%、14%。
S10实验十 植物花药培养(理论)
实验十植物花药培养（理论）一、花药与花粉培养的概念指离体培养花药和花粉，使小孢子改变原有的配子体发育途径，转向孢子体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，并从中鉴定出单倍体植株并使之二倍化的技术。
二、单倍体1、单倍体：指具有配子体染色体数的孢子体。
（植物个体）2、单倍体植物的特点与其二倍体相比较，有三个明显的特点：A、体细胞染色体数减半B、生长发育弱，体形小，器官明显减小C、雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代3、单倍体应用潜力A、迅速获得纯合型材料，缩短育种年限B、获得育种中间材料C、与诱变育种相结合可以提高诱变频率D、与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义E、作为遗传工程受体更为有效三、花粉和花药培养的基本程序外植体、花蕾预处理、外植体消毒、剥取花药、接种、诱导培养、分化培养四、培养材料的选取与制备（一）材料的选取基因型、小孢子发育时期及生理状态等对花药和花粉培养效果具有极大的影响，因而是材料选择所要考虑的主要因素。
1、基因型供体植株遗传背景对花药和花粉培养成败至关重要。
在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培养成功的材料来做。
2、花粉发育时期的选择一般情况下，对大多数植物来说，在单核时期（包括单核早期、中期、晚期）的花粉比较容易培养成功。
确定花粉发育时期的方法可用涂片法来进行。
A、花粉发育时期四分体小孢子单核花粉双核花粉B、花药和花粉培养的取材时期四分体单核早期单核晚期双核早期双核晚期三核期Sunderland（1971）对烟草不同花粉发育时期培养反应进行了观察：花粉发育时期胚状体诱导率（%）减数分裂期0单核时期14单核晚期44双核时期55烟草小孢子发育时期对胚状体诱导率的影响一些植物花药和花粉培养适宜的小孢子发育时期3、生理状态的选择花药和花粉供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导率也有直接的影响。
不同季节接种的花药愈伤组织诱导率也有显著变化。
如小麦早期接种的材料比晚期接种的材料愈伤组织诱导率可提高2—3倍。
15 植物单倍体培养
低温处理的作用：
可以激发花粉母细胞产生两个相等的核
保持高比例的强生活力花粉，同时延缓 体细胞组织的衰老； 激发花粉产生原胚；
促使细胞同步分裂。
3．培养基及培养条件 培养基 花药培养常用的基本培养基：MS ； N6；B5。 附加成分：蔗糖；激素。
蔗糖浓度对花粉的诱导生长有一定作用。•
番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应
Sunderland (1971)对烟草不同花粉发育时期的 培养反应作了观察： 花粉发育时期 胚状体诱导频率（%） 减数分裂期 0 单核早期 14 单核晚期 40 双核早期 55
2、花药预处理 花药培养前给予一定的低温处理。 烟草、茄子 3～5°C 72小时 水稻 10°C 10～14天 柑橘 3°C 5～10天 马铃薯 4°C 48小时
花药培养
首先报道是在1964年，目前已有250多种植物 花药培养成功。 花药培养获得单倍体的技术已在禾本科作物、 茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。 基本程序： 外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消 毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养
1．外植体的选择： 供试材料的遗传背景 供试材料的生理状态 花粉的发育时期 一般选择单核期
用尼龙筛过滤掉药壁，滤液再低 速离心（100～160rpm ） 再加入新 鲜培养基 连续进行两次过滤，至每 毫升含103～104个花粉的浓度
花粉培养方法 ： 微室培养法 看护培养法
花药和花粉培养
花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部 分，属于器官培养的范畴。 花粉培养的精确定义是：将处于一定发育阶段 的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养。 有时花粉培养也称为小孢子培养。从培养方法 和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。 都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后 发育成单倍体植株。
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四、实验步骤
1.适期花药的选择
花药中的花粉是由生殖细胞
（体细胞）经过减数分裂而来，
其染色体只是体细胞中的一半， 如果通过一定的途径将花粉培 养成植株，获得单倍体植株。 再经过染色体加倍，得到纯合
的二倍体，大大缩短育种进程。
花粉发育时期： 被子植物的花粉发育可分为四分体期、单核期（小孢子期）、 二核期和三核期（雄配子期）4个时期。
处于不同发育阶段的烟草花芽
不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期 发育时期 减数分裂期 四分孢子期 单核早中期 草莓、番茄 葡萄 石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯 物种
单核晚期
单核早期至晚期 单核早期至双核期
荔枝、茄子、青椒、小麦
烟草 梨、水稻、甘蓝
四分孢子期至双核期 玉米
2.花药离体培养
（1）取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适 宜的花蕾。（考虑供体植物基因型、生理状态） （2）消毒 70％酒精擦洗花蕾表面，70％酒精浸泡1530s后，在1％次氯酸钠溶液中浸泡8-10min或在0.1％的 氯化汞溶液中消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次。 （3）接种 剥去萼片和花瓣，将花药取出。去除花丝， 但不应使花药受到损伤。 （4）培养 先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形 成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3 周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。
一、实验目的与原理
目的： 掌握植物花药离体培养技术； 掌握单倍体植株鉴定的方法； 了解单倍体育种的意义。 原理： 利用组织培养技术对植物花药进行离体 培养，诱导产生再生植株。通过形态观察 和染色体分析鉴定单倍体植株，作为新的 遗传资源和选择材料。
花药培养基本流程：
选择合适的供体植株
预处理花药（物理或生理逆境） 收集具有胚性小孢子的花药 培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体
烟草花药培养，4℃低温预处理2-3天。
② 培养基
主要为MS、H、N6、B5和Nitsch培养基，在此 基础上发展出一些其它的培养基。 H培养基（基本成分+ 6-BA/KT 2mg/L+ NAA/2,4-D 0.2mg/L+ 30g/L蔗糖+ 7g/L琼脂+ 1g/L活性炭，pH值 5.5-5.8）上诱导愈伤组织；愈伤组织形成后转移到H培 养基（ 基本成分+ NAA 2mg/L+ 6-BA 0.2mg/L+ 20g/L 蔗糖+ 7g/L琼脂）上分化成苗。 1/2 MS培养基+ 激素+ 蔗糖+ 琼脂+ 活性炭
高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织形成。
铁盐对花粉胚状体发育很重要。
活性炭促进胚状体发育。
较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织；
较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。
细胞分裂素可促进胚状体形成；
生长素可诱导愈伤组织形成。
细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗。
氨基酸 有机附加物
H培养基的配制
胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株
单倍体植株鉴定
二、实验内容
1、镜检花粉发育时期
2、花药离体培养 2.1 取样 2.2 消毒 2.3 接种 2.4 培养
3、单倍体植株的鉴定
三、实验器材
材料：烟草花药。 试剂：MS培养基、N6培养基、B5培养基、 酒精、2,4-D、NAA、KT、蔗糖、醋酸洋红、 蒸馏水。 仪器：电子天平、磁力加热搅拌器、普 通光学显微镜、微波炉、pH计、培养箱、 超净工作台、高压灭菌锅、镊子、剪刀、 解剖针、烧杯、试剂瓶、三角瓶、封口膜、 橡皮筋、低温冰箱。
植物花药培养及单倍体植株鉴定
20学时
高俊山
安徽农业大学生命科学学院
花药培养：是指将未成熟的花药接种 在人工培养基上分化成为植株的过程。 属于器官培养。
供体植株 小孢子（n）
பைடு நூலகம்
花培
雄核发育
花粉植株 （ n）
自然加倍 人工加倍
纯合植株DH （2n）
一年内获得纯系
常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。
一般而言，单核期（第一次有丝 分裂前）对诱导反应最敏感，为 最佳培养期。
形成双核后，在合适的条件下， 主要由营养细胞分裂产生胚状体 。
营养细胞
生殖细胞
精子
花粉的发育
花药切片显微观察
单核靠边期
四分体时期
烟草花粉发育时期的检测： 一般将植物的花药置于载玻片上压碎，加1-2滴1% 醋酸洋红染色，再进行镜检，以确定花粉发育时期。
类别
大 量 元 素 化合物 KNO3 NH4NO3 MgSO4· 7H2O CaCl2 · 2H2O KH2 PO4 MnSO4· 4H2O ZnSO4· 7H2O H3BO3 Na2MoO4· 2H2O CuSO4· 5H2O Na2· EDTA FeSO4· 7H2O 盐酸硫胺素(B1) 盐酸吡哆素(B6) 甘氨酸 叶酸 烟酸 生物素(维生素H) 培养基浓度 (mg/L) 950 720 185 166 68 25 10 10 0.25 0.025 37.3 27.8 0.5 0.5 2 0.5 5 0.05 母液扩大 500mL 母 液 每 升 培 养 基 取 倍数 中药品量(g) 母液的量(ml) 9.5 7.2 50 20倍 1.85 1.66 0.68 2.5 1.0 5 200倍 1.0 0.025 0.0025 3.73 5 200倍 2.78 0.05 0.05 5 200倍 0.2 0.05 0.5 0.005
花药培养过程
消毒
预处理 取花药 培养 接种
取花蕾（镜检）
愈伤组织发生
① 预处理
• 预处理是小孢子培养成功的前提条件。
• 预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能
多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径
（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理 能使绿苗产量大量增加。 • 预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理， 包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。
四分体: 醋酸洋红染色
单核期
双核期
四分体: Alexander’s 染色
成熟花粉粒
液泡
单核晚期
第一次有丝分裂后期
生殖核
营养核 生殖核 双核早期 双核中期
烟草花粉发育时期的确定
烟草花粉培养，选择单核靠边期的花药，培养效果最好。
从烟草花的外部形态变化来看，
当花蕾的花冠长度与花萼的长
度相等时，花药里面的多数花 粉粒正处于单核靠边的阶段。