维生素A和维生素E的测定方法
18维生素的测定
（三）液相色谱分析 色谱推荐条件： 预柱：ODS 10μm,4mm×4.5cm 分析柱：ODS 5μm,4.6mm×25cm 流动相：甲醇：水＝98：2，混匀，临用
前脱气。
紫外检测器波长：300nm,量程0.02 进样量：20μL 流速：1.65～1.70mL/min
生物鉴定法：费时、费力、需要动物饲养场地 微生物法：仅限于水溶性维生素的测定 荧光法：用于硫胺素的测定 仪器法：快速、灵敏、有较好的选择性 HPLC：用于大多数维生素的测定，费用高
二、脂溶性维生素的测定
脂溶性维生素的理化性质
溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于苯、 乙 醚、 丙酮、三氯甲烷、乙醇等有机溶剂。
做空白试验
重复上述操作，将20ml维生素B1标准使用液加入 盐基交换管以代替试样提取液，即得到标准净化液。
4.氧化
将5ml试样 净化液分别加 入A、B两个 反应瓶；
同时将5ml 标准净化液分 别加入A1、B 1两个反应瓶 中。
Maizel-Gerson 反应瓶
氧化流程
A、A1瓶 15%NaO H (3 ml)溶液振摇
（一）原理
样品中维生素A 及维生素E 经皂化提取 处理后，将其从不可皂化部分提取至有 机溶剂中。用高效液相色谱法C18 反相 柱将维生素A 和维生素E 分离，经紫外 检测器，用内标法定量测定
（二）样品处理
1.皂化称取适量样品（含维生素A 约3μg， 维生素E 各异构体约40μg）于三角瓶中， 加30mL 无水乙醇，振摇使样品分散。加 入5mL100g/L 抗坏血酸溶液和2.00mL 苯 并[e]芘溶液（5μg/L，内标用），混匀， 加10mL 氢氧化钾溶液（50％浓度），混 匀，于沸水浴上回流30min，使皂化完全， 皂化后立即放入冰水中冷却。
液相色谱串联质谱法测定血清维生素A、E含量
５７４
Ｌａｂｅｌｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ Ｃｌｉｒｔ Ｍｅｄ Ａｏｒ．２０１８．Ｖｏ１．２５．Ｎｏ．４ ，
维生素类药物含量测定2021精选PPT
❖若（A328校正-A328）*100%/A328 所得的数值 在-15.0%到-3.0%，则应用A328校正代入E=A/C.L
❖若（A328校正-A325%或大于+3% ，则不能用本法测定，应使用第二法。
A 2 = A3 =6/7A 1 1= 325nm， 2=310nm， 3 =334nm Ch.P用于测定维生素A醇
一、维生素A含量测定及方法
3. 杂质的吸收 • 对V.A有影响的杂质主要有以下几种： • (1) V.A2 和V.A3 • (2)维生素A的氧化产物 • (3) 维生素A在光照下产生的无活性的聚合物 • (4)维生素A的异构体等。
② 物质对光的吸收具有加和性。
一、维生素A含量测定及方法
2.波长的选择：最大吸收波长，及两侧各选一波长 ① 第一法（等波长差法） 1 =328nm，
2 =316nm， 3 =340nm，△ =12nm VitA的max（328nm） Ch.P用于测定维生素A醋酸酯
一、维生素A含量测定及方法
② 第二法（等吸收比法） 分别在1的两侧各选一点
一、维生素A含量测定及方法
立体异构体 氧化产物及光照产物 合成中间体 去氢维生素A（ VitA2） 去水维生素A（ VitA3）
均对测定有干扰 ，故采用三点校 正法
一、维生素A含量测定及方法
1：测定原理，三个波长的吸收度，公式计算校正吸收度， 再计算含量。故得名。该法的依据：
① 杂质的吸收在310~340nm波长范围内呈一条直线，且 随波长的增大吸收度减小；
一、维生素A含量测定及方法
维生素的检测方法
《维生素的检测》一、维生素E取样品0.18g，置于100mL的量瓶中，加无水乙醇稀释到刻度，摇30s，用干滤纸滤过，弃取初滤液，吸取50mL，置于回流瓶中，加硫酸3mL，摇匀，加热回流3小时放冷，移至于100mL量瓶中，用无水乙醇洗条容器，洗液并加入量瓶中，再加入无水乙醇稀释至刻度，摇匀，吸取25mL/L，加乙醇(95%)20mL，水10mL/L，二苯胺硫酸溶液2滴(10g/L)，用0.01mol/L 硫酸铈标准液滴定结果用空白试验校正。
计算公式：(试样滴定数—空白滴定数)×标准液浓度×0.002364×8÷质量÷维生素E的标示量<如:50/100 33/100 25/100 20/100 等>×100二、维生素K3(亚硫酸氢钠甲苯酯含量测定)标准溶液配制：取甲萘醌对照品约0.05g，置于250mL的量瓶中，用三氯甲烷溶解，并稀释到刻度，摇匀。
吸取2mL置于100mL量瓶中，用无水乙醇稀释到刻度，摇匀。
样品溶液的配制：取样品1.3g，置于250mL量瓶中，用水稀释到刻度，摇匀。
吸取25mL 至于分液漏斗中，加三氯甲烷40mL/L，碳酸钠溶液5mL(1/100)，剧烈振摇30s，静止分层，分出的三氯甲烷层通过预先用三氯甲烷湿润的棉花过滤到250mL的量瓶中，再加三氯甲烷40mL迅速洗条滤器，洗液并加入量瓶中，水层用三氯甲烷萃取2次，每次约20mL，萃取液过滤，并用三氯甲烷20mL洗条滤器，洗液和全部滤并到量瓶中，用三氯甲烷稀释到刻度,摇匀.吸取2mL至于100mL量瓶中,用无水乙醇稀释到刻度,摇匀.(用分光光度计在250nm波长处平行测定吸收度,用2%三氯甲烷的无水乙醇溶液做空白).计算公式：样品溶液的吸光度×标准溶液的吸光度÷标准溶液的吸光度÷样品溶液的浓度×191.82三、维生素B1 (硝酸硫胺含量的测定)取样0.1g,加水50mL溶解后,加盐酸2mL,煮沸,立即滴加硅钨酸溶液10mL,继续煮沸2nim,用在80℃干燥至恒重有4号垂溶坩埚滤过,沉淀先用煮沸的盐酸溶液洗条2次,每次10mL,再用水10mL洗条一次,最后用丙酮洗条2次,每次5mL,沉淀物在80℃干燥至恒重.计算公式：干燥后沉淀的重量×0.1882÷样品重量÷(1－样品干燥失重,重量百分数)×100四、烟酸取样0.3g,加新沸过的冷水50mL溶解,加酚酞指示剂3滴(1g/L),用0.1monl/L氢氧化钠标准液滴定至粉红色.计算公式：滴定数×标准液的浓度×0.01231÷质量×100五、维生素B6取样0.15g,加冰乙酸20mL与乙酸贡溶液(5g乙酸贡研细加温热的冰乙酸溶解为100mL)5mL,温热溶解,放冷,加(5g/L)结晶紫指示剂1滴,用0.1monl/L高氯酸标准液滴定,至溶液显蓝紫色,并将滴定结果用空白实验校正.计算公式：(样品滴定数－空白滴定数)×高氯酸标准液的浓度×0.02056÷质量×100六、维生素B12(氰钴胺)粉剂外观及颜色：浅红色至棕色细微粒粉末状,具有吸潮性.取样品维生素B12 0.002克,置于100毫升的量瓶中.加水80毫升,充分振摇混合后稀释至刻度,摇匀,用干滤纸过滤(必要时离心),弃去初滤液作为样品测量溶液.取维生素B12(氰钴胺)对照品(干燥品)0.2克,置于1000毫升的量瓶中用水稀释至刻度,摇匀,作为对照品测定液,用水做空白对照,于1cm比色皿内,用分光光度计于361nm波长处测定样品溶液和标准液的吸收度。
高效液相色谱法测定血清中维生素A、E、β-胡萝卜素
血清样品在采血后立即离心，分离 血清； 置5ml塑料试管中，充氮、密封，于 -40℃保存备用。
在5ml棕色具塞玻璃离心管中，加入 0.25ml血清、1ml 10％邻苯三酚乙醇溶 液、0.5ml 60％KOH，用氮气将管内空 气置换，37℃水浴1h。
冷水浴3min后加入5％NaCl 1ml，己烷 /乙酸乙酯(9:1)3ml，用氮气将管内空 气置换，盖紧塞子，水平振荡器上振 荡5min(40次/min)；
β-胡萝卜素遇光和氧会被迅速破坏， 所以应临用新配，并注意避光保存。 样品的提取液比较稳定，可以隔夜 后进行分析。
五、思考题
1. 维生素A族维生素与能量代谢有关？
四、质量控制
1. 配制标准液时：
若有条件应对配制好的标准稀释液 维生素A、维生素E、β-胡萝卜素 200～600nm扫描，观察最大吸收峰 的波长。
如果所用HPLC仪能作波长变换，则 在测定组分的最大吸收波长下测定 可取得较高的灵敏度。
2. 吸取上清液时：
注意不可触及界面；
否则： 一方面会吸入水，影响分析和柱 的分离能力； 另一方面，界面上的脂肪层可能 会影响分析结果。
β-胡萝卜素以氯仿配制成不同浓 度的标准液，同样品一样处理。
分别以标准应用液浓度为横坐标， 峰面积为纵坐标，绘制工作曲线。
三、数据处理
将样品中三种待测组分平行测定的峰面 积均值分别代入各自的工作曲线，求得 测定样液中各自的含量。
再乘以样品处理时的稀释倍数，即得 到血清样品中维生素A、维生素 E及β胡萝卜素的含量。
高效液相色谱法测定血清中 维生素A、E、β-胡萝卜素
测定饲料中维生素A和维生素E含量方法的研究
测定饲料中维生素A和维生素E含量方法的研究裘丞军;任玉琴【摘要】本文旨在建立一种能同时准确测定饲料中维生素A和维生素E含量的方法,试验将样品在碱性条件下65℃水浴超声皂化提取,冰乙酸调pH至中性,乙醇稀释后直接用高效液相色谱法(HPLC)进行测定.结果表明:维生素A在0.036～108 IU/mL线性关系良好,相关系数为1.00000,检出限1000 IU/kg,方法回收率为95.8％～98.8％,RSD为0.8％～4.4％(n=5);维生素E在0.6～125 μg/mL线性关系良好,相关系数为0.99998,检出限15 mg/kg,方法回收率为95.3％～102.2％,RSD为0.8％～ 4.2％(n=5).本方法快速简便,适用于配合料、浓缩料、维生素预混料和复合预混料中同时准确测定维生素A和维生素E的含量,相对于国标法节省了大量的时间和试剂,可应用于日常大批量饲料检测中.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2019(000)011【总页数】5页(P56-60)【关键词】高效液相色谱;维生素A;维生素E;饲料;皂化【作者】裘丞军;任玉琴【作者单位】浙江省兽药饲料监察所,浙江杭州311199;浙江省兽药饲料监察所,浙江杭州311199【正文语种】中文【中图分类】S816.17维生素A和维生素E是维持动物体正常代谢所必需的脂溶性维生素，具有促进生长，提高免疫力等作用，已经广泛应用于大规模畜禽养殖中。
在饲料添加剂中主要以维生素A乙酸酯和dl-α-生育酚乙酸酯的形式存在，并且通过各种壁材包被保护（杨优敏，2016）。
目前测定饲料中维生素A和维生素E的方法已有国家标准GB/T 17812-2008和GB/T 17817-2010，主要是皂化萃取法和甲醇直接提取法，还有碱性蛋白酶水解法（赵晓华等，2010）。
皂化萃取法操作步骤繁琐，时间长，消耗试剂多；甲醇直接提取法和酶解法结果不稳定，有些包被产品未能被有效提取。
冷皂化_HPLC测定强化食品中的维生素A_E的方法研究
—344—中国食品卫生杂志CHINESE JOURNAL OF FOOD HYGIENE2010年第22卷第4期实验技术与方法冷皂化-HPLC测定强化食品中的维生素A、E的方法研究赵海燕赵榕杨永红罗仁才（北京市疾病预防控制中心，北京100013）摘要：目的建立测定强化食品中的维生素A、E的冷皂化-HPLC方法。
方法试样经过夜冷皂化后，醋酸调pH值至6.0 7.5，定容离心后高效液相色谱法测定；色谱条件：色谱柱SUPERIOREX ODS（4.6mmˑ250mm，5μm），流动相：甲醇+水=94+6。
结果方法的线性范围：维生素A：0.25 3.00μg/ml；γ-、δ-、α-维生素E：10.0 150μg/ml。
相关系数（r）为0.9997 0.9999；方法的定性检出限维生素A、γ-、δ-、α-维生素E分别为：0.40、5.0、5.0、8.0μg/g；定量检出限：1.30、16.7、16.7、26.7μg/g。
高低两个浓度水平加标回收率77.1% 105.0%；相对标准偏差（RSD）均<5%。
结论本方法简便、快速、准确、重现性好，适用于强化食品中维生素A、E的测定。
关键词：维生素A；维生素E；高效液相色谱法；冷皂化维生素A（retinol）和维生素E（tocopherol）是机体维持正常代谢和机能必需的脂溶性维生素。
维生素A又称为视黄醇，主要用来提高视力并且增强免疫系统功能，过量摄入会引起食欲减退、过敏、疲劳、失眠、头痛及肌肉老化；维生素E又称为生育酚，生育酚结构复杂，异构体种类多，其生物活性也千差万别，主要包括α-、β-、γ-、δ-生育酚，其中α-生育酚的生物活性最高，生育酚具有促进生育、延缓衰老、辅助抑制肿瘤的作用，并对糖尿病并发症、动脉粥样硬化起到预防作用，增补过量时会出现头痛、疲劳和视力异常现象。
文献报道测定维生素A、E的方法有分光光度法、荧光分析法、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）、双波电压法、示波极谱法等［1］。
HPLC法测定饲料中维生素A_维生素D_3和维生素E
HP LC 法测定饲料中维生素A 、维生素D 3和维生素E摘 要:建立了以w (C 2H 5OH )=95%乙醇直接提取,高效液相色谱仪在波长280n m 和254n m 处连续测定饲料中维生素A 、维生素D 3和维生素E 的方法。
色谱柱为大连依利特Hypersil ODS C 18(25c m ×416mm ×5μm ),流动相为甲醇水,流速为112mL /m in 。
维生素A 、维生素D 3、维生素E 的质量浓度分别在110mg/L ～2010mg/L 、015mg/L ～15.0mg/L 、215mg/L ～5010mg/L 范围内与峰面积呈良好的线性关系,检测限分别为013×10-6μg 、0104×10-6μg 、510×10-6μg,相对标准偏差分别为116%、217%、214%,平均回收率分别为99%、102%、98%。
关键词:高效液相色谱法;维生素A;维生素D 3;维生素E;饲料中图分类号:O65717+2 文献标识码:B 文章编号:10062009(2005)02003302To D etect V itam i n A,V it am i n D 3and V it am i n E i n Feed w ith HPLC(Changsha Environm ental P rotection Technology Institute,Changsha,Hunan 410004,China )Abstract:To detect V ita m in A,V ita m in D 3and V ita m in E in feed,which t o directly extract withw (C 2H 5OH )=95%glycollic,with HP LC in 280n m and 254n m.Chr o mat ographic colu mn was Hy persil ODSC 18(25c m ×4.6mm ×5μm ),mobile phase was methanol -water,vel ocity of fl ow was 1.2mL /m in .W hen the mass concentrati on of V ita m in A,V ita m in D 3and V ita m in E was 1.0mg/L ～20.0mg/L 、0.5mg/L ～15.0mg/L 、2.5mg/L ～50.0mg/L,there had a well lineal relati onshi p.Detecti on li m it was 0.3×10-6μg 、0.04×10-6μg 、5.0×10-6μg.Relative standard deviati on was 1.6%、2.7%、2.4%,recovery rate was 99%、102%、98%.Key words:HP LC;V ita m in A;V ita m in D 3;V ita m in E;Feed收稿日期:20040323;修订日期:20050130作者简介:王安群(1962—),女,江西吉安人,高级工程师,学士,从事环境监测教学工作。
景泰县妇女血清维生素A、E含量测定
图 Ｉ 混合标准色谱
１ 。雏生素 Ａ，．苯并（ ） ３ 一雏生素 Ｅ，． 一维生素 Ｅ ２ Ｅ 芘，。 ４
２
（ ３ ℃）作为测定维生素 Ａ Ｅ用的样品。 一０ ， 、
１２ 方 法 ．
所用试 剂需 经纯 化处理 。 甲醇 、 己烷 ， 馏 正 重蒸 后使 用 ， 乙醇需经 脱醛蒸 馏后使 用 。 视 黄 醇 和生 育 酚均 不稳 定 ， 故需 于 临用 前重 新 标定 浓 度。用 紫 外 分 光 光 度 计 于 波 长 ３５ｍ、 ２ｎ ２４ ｍ、９ ｎ ９ ｎ ２ ８ｍ测 定 各维生 素 的 吸光度 值 ， 再按 其 消 光 系数 １３ 、１０及 ９ ． 别计 算 出 各种 维 生 素 ８５ ７ ． ２８分
Ｅ均 数 水平 进行 统 计 处理 ， 果 表 明 ， 妇 血 清 Ｖ 结 孕 Ａ
水平与非孕妇女相 比没有显著性 ， 孕妇血清 Ｖ Ｅ水 平与非孕妇女相 比具有高度 的显著性。这可能与胎 盘催乳激素刺激母体脂肪分解 ， 提高母血游离脂肪 酸和甘油的浓度 ， 使得分布于血液脂蛋 白中的维生
［ ］ Ｇ ０ １ ２ ０ ， ２ Ｂ５０ ０－ ０２ 混凝土结构设计规 范 ．北京 ： 中国建
筑工业出版社 ，０２ ２０ ．
［ ］ 中国建筑 科学 研究 院 ， 筑工 程 软 件研 究所 ． Ｋ Ｍ ３ 建 ＰＰ
素 Ｅ类 的脂 溶性 维 生素 吸收增 加所 致 ， 由于维生 素
２ 测 定 结果
２ １育龄期 妇女 血清维 生素 测定 结 果 （ 表 ２ ． 见 ）
表 ２ 育 龄 期 妇 女 血 清 维 生 素 Ａ、 Ｅ含 量 ｇ ／ ． ｍＬ ｇ
Ａ主要 储 存 于人 体 的肝 脏 中 ， 此 受 此 影 响 较 小 。 因 同时孕妇 维 生 素 Ｅ 的 升 高 与 母 体 、 儿 需 氧 量 增 胎 大， 氧化 反应增 强 而 导致 的抗 氧 化保 护 机 制也 代 偿
维生素A和维生素E的测定方法
维生素A和维生素E的测定方法（HPLC）杨月欣教授等高效液相色谱法最小检出量分别为VA：0。
8ng；α—E：91。
8ng；γ—E：36。
6ng;δ—E：20。
6ng。
1。
原理食物中的维生素A及维生素E经皂化提取以后，将其不可皂化的部分提取到有机溶剂中。
用HPLC法测定维生素A及维生素E的含量。
2. 适用范围GB12388-90 本法适用于各种食物和饲料的测定3. 仪器(1）高压液相色谱仪(带紫外检测器）（2）六孔恒温水浴锅(3) 旋转蒸发器(4）高纯氮气（5）高速离心机4。
试剂本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水4。
1 无水乙醇:重蒸，不含有醛类物质检查方法:取2ml银氨溶液于试管中，加入少量乙醇,摇匀,再加入10%氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛.脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中。
取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。
将两者倾入1L乙醇中，振摇后，放置暗处两天（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶蒸馏，弃去初蒸出的50ml。
当乙醇中：4。
2 10％抗坏血酸溶液（Vc）W/V 临用前配制4。
3 50％氢氧化钾溶液（KOH) W/V4.4 无水乙醚重蒸，不含过氧化物4.4。
1 过氧化物检查方法：用5ml乙醚加1ml10%碘化钾溶液,振摇1min,如有过氧化物则放出游离碘,水层呈黄色或加4滴0.5％淀粉液，水层呈蓝色。
该乙醚需处理后使用。
4.4。
2 去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时，瓶中放入铁丝或铁末少许。
弃去10%初馏液和10％残馏液。
4。
5 pH 1—14试纸4.6 无水硫酸钠Na2SO44。
7 甲醇色谱纯或分析纯重蒸后使用4。
8 重蒸水蒸馏水中加入少量高锰酸钾重蒸后使用4。
9 苯并〔e〕芘标准液称取苯并〔e〕芘(纯度98%),用脱醛乙醇配制成1ml相当于5μg苯并〔e〕芘的内标溶液。
4.10 维生素A标准液视黄醇（纯度85％Sigma公司）用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg视黄醇。
用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒及检测方法[发明专利]
![用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒及检测方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/3b1e0b782f3f5727a5e9856a561252d380eb200d.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010147018.X(22)申请日 2020.03.05(71)申请人 美康生物科技股份有限公司地址 315104 浙江省宁波市鄞州区下应街道启明南路269号(72)发明人 邹继华 沈敏 潘清清 杨晓东 屠敏敏 邹炳德 (74)专利代理机构 宁波甬致专利代理有限公司33228代理人 沈春红(51)Int.Cl.G01N 30/06(2006.01)G01N 30/74(2006.01)(54)发明名称用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒及检测方法(57)摘要一种用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒及检测方法，包括：校准品母液：含2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚无水乙醇为稀释液，2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚浓度为0.1‑1.0mg/mL，配6个浓度点的校准品母液；内标：内标溶液为视黄醇乙酸酯和维生素E醋酸酯的混合溶液；质控品：包括质控品1和质控品2；稀释液：为牛蛋白血清的空白基质溶液，牛蛋白血清的质量百分比含量为1‑10％；萃取液：萃取液为含2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚的正己烷溶液；复溶液：复溶液为体积百分比为93％‑100％的甲醇水溶液；流动相：流动相A为水溶液，流动相B为甲醇溶液，且流动相A和流动相B中含有体积百分比浓度为0‑0.2％的甲酸。
准确率高、检测时间短、试剂耗用量少、操作方便和成本低廉的优点。
权利要求书3页 说明书9页 附图2页CN 111929391 A 2020.11.13C N 111929391A1.一种用于准确测定人血清中维生素A和E浓度的试剂盒，其特征在于，主要包括：(1)校准品母液：使用含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的无水乙醇为稀释液，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚在稀释液中的浓度为0.1-1.0mg/mL，配制包括6个浓度点的校准品母液，校准品母液的6个浓度点依次为：视黄醇：0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.50μg/mL、7.50μg/mL、15.00μg/mL；±α-生育酚：5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、50.00μg/mL、150.00μg/mL、300.00μg/mL；上述校准品母液均为视黄醇和±α-生育酚的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；校准品工作液的浓度＝校准品母液浓度×20/100；(2)内标：内标溶液为视黄醇乙酸酯和维生素E醋酸酯的混合溶液，使用含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的无水乙醇为稀释液，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.1-1.0mg/mL，且视黄醇乙酸酯在内标溶液中的浓度范围为0.05-1.25μg/mL，维生素E醋酸酯在内标溶液中的浓度范围为5-75μg/mL；(3)质控品：包括质控品1和质控品2，其中质控品1的浓度范围和成分包括：视黄醇：0.3-0.7μg/mL；±α-生育酚：7-13μg/mL；质控品2的浓度范围和成分包括：视黄醇：1.0-1.5μg/mL；±α-生育酚：15-25μg/mL；质控品1和质控品2均为视黄醇和±α-生育酚的混合物；各个成分的浓度为在混合物中各自浓度；(4)稀释液：稀释液为牛蛋白血清的空白基质溶液，牛蛋白血清的质量百分比含量为1-10％；(5)萃取液：萃取液为含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.1-1.5mg/mL；(6)复溶液：复溶液为体积百分比为93％-100％的甲醇水溶液；(7)流动相：流动相A为水溶液，流动相B为甲醇溶液，且流动相A和流动相B中含有体积百分比浓度为0-0.2％的甲酸。
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xxA和xxE的测定方法
（HPLC）xx教授等
高效液相色谱法
最小检出量分别为VA：0.8ng；α-E：91.8ng；γ-E：36.6ng；δ-E：20.6ng。
1.原理
食物中的维生素A及维生素E经皂化提取以后，将其不可皂化的部分提取到有机溶剂中。
用HPLC法测定维生素A及维生素E的含量。
2.适用范围
GB12388-90本法适用于各种食物和饲料的测定
3.仪器
（1）高压液相色谱仪（带紫外检测器）
（2）六孔恒温水浴锅
（3）旋转蒸发器
（4）xx氮气
（5）高速离心机
4.试剂
本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水
4.1无水乙醇：重蒸，不含有醛类物质
检查方法：取2ml银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入10%氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。
脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中。
取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。
将两者倾入1L乙醇中，振摇后，放置暗处两天（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶蒸馏，弃去初蒸出的50ml。
当乙醇中：
4.2 10%抗坏血酸溶液（Vc）W/V 临用前配制
4.3 50%氢氧化钾溶液（KOH）W/V
4.4无水乙醚重蒸，不含过氧化物
4.4.1过氧化物检查方法：用5ml乙醚加1ml10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉液，水层呈蓝色。
该乙醚需处理后使用。
4.4.2去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时，瓶中放入铁丝或铁末少许。
弃去10%初馏液和10%残馏液。
4.5 pH 1-14试纸
4.6无水硫酸钠Na2SO4
4.7甲醇色谱纯或分析纯重蒸后使用
4.8重蒸水蒸馏水中加入少量高锰酸钾重蒸后使用
4.9苯并〔e〕芘标准液称取苯并〔e〕芘（纯度98%），用脱醛乙醇配制成1ml相当于5μg苯并〔e〕芘的内标溶液。
4.10维生素A标准液视黄醇（纯度85% Sigma公司）用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg视黄醇。
临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。
维生素E标准液α-生育酚（纯度95% Sigma公司），δ-生育酚（纯度95% Sigma公司），δ-生育酚（纯度95% Sigma公司）。
用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg。
临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的准确浓度。
5.操作步骤
本实验需避光操作
(1)样品皂化称取样品于三角瓶中，加30ml无水乙醇，振摇三角瓶，使样品分散均匀。
加入5ml 10%抗坏血酸和苯并〔e〕芘标准液2ml，混匀。
最后加入10ml氢氧化钾边加边振摇。
于沸水浴上回流30min使样品皂化完全。
皂化后立即放入冰水中冷却。
(2)样品萃取将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50ml水分2次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。
用100ml无水乙醚分两次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。
轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。
然后每次用约100ml水将乙醚液洗至中性，约4-5次。
(3)浓缩将乙醚提取液经无水硫酸钠（约5g）滤入150ml旋转蒸发瓶内，用约15ml乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中乙醚剩下约2ml时，取下蒸发瓶，立即用氮气将乙醚吹干。
加入2ml乙醇溶液，充分混合，溶解提取物。
将乙醇液移入塑料离心管中，于离心机上以3000转/min离心5分钟。
上清液供色谱分析。
(4)标准曲线的制备将维生素A和维生素E标准品配置成标准溶液（约
1mg/ml），制备标准曲线前用紫外分光光度法标定其准确浓度。
标准浓度的标定方法取维生素A和维生素E标准液若干微升，分别稀释至10.00ml乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。
用比吸光系数计算该维生素的浓度。
测定条件如下
标准比吸光系数E1%cm 波长λ，nm 视黄醇1835
325
α—生育酚71 294
γ—生育酚92.8 298
δ—生育酚91.2 298
浓度计算：
-3
式中X1：某xx浓度，mg/ml；
A：维生素的平均紫外吸光值；
S：加入标准的量，μL；
E：某种维生素1%比吸光系数；
10.00/S×10-3：标准液稀释倍数。
本法采用内标两点法进行定量。
把一定量的维生素A、维生素E及内标苯并〔e〕芘液混合均匀，选择合适的灵敏度，使上述物质的各峰高约为满量程的70%，作为高浓度点，高浓度的为低浓度点（内标苯并〔e〕芘的浓度值不变），用此二种浓度的混合标准进行色谱分析。
根据微处理机装置，按说明用二点内标法进行定量。
液相色谱分析
仪器所需条件
预柱：ODS 10μm，4mm×4.5cm。
分析柱：ODS 5μm，4.6mm×25cm。
流动相：甲醇：水=98：2。
混匀，临用前脱气。
紫外检测器波长：300nm。
量程0.02。
进样量：20μL进样定量环。
流速：1.65-1.70mL/min。
6.计算
X：某种xx的含量，mg/100g；
C：由标准曲线上查到某种维生素含量，μg/mL；
V：样品浓缩定容体积，mL；
m：样品质量，g；
用微处理机二点内标法进行计算时，按计算公式计算或由微机直接给出结果。
7.注意事项
（1）维生素A极易被破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。
（2）在皂化过程中，应每5分钟摇一下皂化瓶，使样品皂化完全。
（3）提取过程中，振摇不应太剧烈，避免溶液乳化而不易分层。
（4）洗涤时，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加。
（5）无水硫酸钠如有结块，应烘干后使用。
（6）在旋转蒸发时，乙醚溶液不应蒸干，以免被测样品含量有损失。
（7）用高纯氮吹干时，氮气不能开的太大，避免样品吹出瓶外结果偏低。
（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）。