琥珀酸脱氢酶
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问题6：如何设计实验方案检测酶被抑制的 程度？
竞争性抑制：分子结构与底物相似的抑制剂 与底物竞争结合酶的活性中心，抑制酶活性。
EI不能转变成产物 Ki：EI的解离常数，抑制常数
草酸、丙二酸与琥珀酸分子结构相似，是琥 珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。
COO COO Oxalate
酶被抑制的程度取决于抑制剂与酶的亲和力 及与底物的相对比例。 可依据蓝色消褪的时间判断酶活性被抑制的 程度。
问题3：如何检测琥珀酸脱氢酶的活性状况？
• 在体内,琥珀酸脱下的2H经电子传递链传递，最后 与氧结合生成水，并释放出能量。
• 在体外可利用甲烯兰(蓝色)作为人工受氢体，接受 琥珀酸脱下的2H而被还原为甲烯白(无色)。
•蓝色消褪的快慢可显示琥珀酸脱氢酶的活性。
问题4：何为竞争性抑制？
问题5：本次实验中的抑制剂是什么？为何 选择该物质作为抑制剂？
– 低速离心机(在6,000rpm以下) – 高速离心机(在25,000rpm以下) – 超速离心机(在30,000rpm以上)
目前商售大型超速离心机最高转速达100,000rpm， 相对离心力达803,000×g。
低速离心机
台式高速冷冻离心机
超速冷冻离心机
离心机转子
常用的离心机转子有三种：
离心机转子从静止状态加速旋转
– 如果颗粒密度＞周围介质的密度，则颗粒离开轴心方向
移动，即发生沉降；
– 如果颗粒密度＜周围介质的密度，则颗粒朝向轴心方向
移动，即发生漂浮。
在离心场中，作用于颗粒上的力主要有离心力Fc、 浮力FB和摩擦阻力Ff。
离心力
转速（revolutions per minute ，rpm）
相对离心力（relative centrifugal force, RCF）：是指在离心力场中，作用于颗粒的离心 力相当于地球引力的倍数， ×g RCF＝1.118×10-5RN2
R为离心转子的半径（cm），N为转速（转/分） 低速离心常以rpm表示 超速离心以×g表示。
离心机的分类
目前在生物医学领域内常用的离心机种类繁多， 按其离心转子所能达到的最高转速分为：
离心操作注意事项
1．精密平衡 2．对称放臵 3．锁定盖子 4．限速运转
– 确认所用转子最大额定速度，离心机不能超过最大额
定速度的75%。
5．停转开盖 6．选择合适的离心管和转子
– 一般离心管是特制聚乙烯管，不能用玻璃管代替离心
百度文库
管。 – 液体不能装得过多，以防离心时甩出，造成转头生锈 或被腐蚀。
实验目的
颈椎脱臼处死法处死小鼠
将实验动物的颈椎脱臼，断离脊髓致死， 为大、小鼠最常用的处死方法。 操作时用左手拇指、食指用力向下按压鼠 头及颈部，右手抓住鼠尾根部用力拉向后 上方，造成颈椎脱臼，脊髓与脑干断离， 实验动物立即死亡。
•注意: • 实验人员的安全； • 确认实验动物已经死亡； • 妥善处理好尸体。
(1)固定角度转子(fixed-angle rotor)；
(2)水平转子(swing-out rotor或swing-backet rotor)； (3)垂直转子(vertical rotor)。
转子通常用(铝)合金、铝(镍)合金或塑料制成。
钛合金转子虽然价格昂贵，加工困难，比较笨重，但 它强度大，耐用，能经受冷冻及高温消毒处理，抗化 学腐蚀和应变侵蚀的性能强，是当前最理想的转子。
2.00 — 1.00 5滴
• 摇匀 (此后再勿摇动!!)，注意观察各管之颜色变化，并记录各 管颜色消退的顺序和时间，并分析之。 •将退色的反应液震荡，观察实验现象并分析产生该现象的原因。
学习动物的处死方法 学习动物组织匀浆法
学习离心机的使用方法
了解琥珀酸脱氢酶的作用，进一步理 解酶的竞争性抑制原理
酶竞争性抑制实验所需试剂
1、pH7.4磷酸缓冲液 2、0.25％琥珀酸钠溶液 3、0.5％草酸钠溶液 4、0.01％甲烯兰溶液
小鼠的抓取保定
小鼠性情较温顺，挣扎力小，比较容易抓取和保定。 抓取时，用左手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部（如图 11-3所示）放在格板或铁笼上。 趁着小鼠试图挣脱的瞬间，迅速用另外三个手指压住小 鼠的尾巴根部握入手掌（如图11-4所示）； 放松拇指和食指，用另外三个手指控制小鼠，然后用食 指和拇指捏住小鼠头部两边疏松的皮肤提起小鼠（如图 11-5所示），完成抓取保定。
2、另取中试管五支，标号，按下表操作(单位为ml)：
试 剂
0.25％琥珀酸钠液
1号管
0.50
2号管
—
3号管
0.50
4号管
2.00
5号管
0.50
0.5％草酸钠液 蒸馏水 肝糜液 甲烯蓝
— 2.00 1.00 5滴
0.50 2.00 1.00 5滴
0.50 1.50 1.00 5滴
0.50 — 1.00 5滴
•The effect of a competitive inhibitor can be overcome with high concentrations of the substrate
离心技术
利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使臵于旋 转体（离心机）中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从 而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。
肝脏
组织匀浆法
匀浆的方式 –手工匀浆
–机器匀浆：组织捣碎匀浆器
–超声匀浆：超声粉碎机
–反复冻融
实验步骤
1、肝糜液的制备： 取小白鼠一只，颈椎脱臼法处死，立即剖腹将肝脏 全部取出（为何选肝脏？），臵于研钵中，用生理 盐水洗净肝脏中血液。 用剪刀剪碎肝脏，充分研碎至糊状，然后分批加入 少量磷酸缓冲液，边加边磨，总共加入7ml。 （分几 次加入，每次加入后均需充分研磨。） 注意：此步一定要研磨充分（酶位于线粒体内膜 上）。 研至匀浆后倒入离心管中，离心4分钟(3000转/分)。 将上清液转入另一试管中备用。此即为含有琥珀酸 脱氢酶的肝糜液。
实验四 酶的竞争性抑制
三峡大学医学院生物化学教研室
问题1：本次实验提取的是什么酶？
问题2：该酶位于细胞的什么部位？催化 什么化学反应？
琥珀酸脱氢生成延胡索酸:
琥珀酸脱氢酶 FAD FADH2
H CH COOH H CH COOH
琥珀酸 (succinate)
HOOC CH HC COOH
延胡索酸 (fumarate)
竞争性抑制：分子结构与底物相似的抑制剂 与底物竞争结合酶的活性中心，抑制酶活性。
EI不能转变成产物 Ki：EI的解离常数，抑制常数
草酸、丙二酸与琥珀酸分子结构相似，是琥 珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。
COO COO Oxalate
酶被抑制的程度取决于抑制剂与酶的亲和力 及与底物的相对比例。 可依据蓝色消褪的时间判断酶活性被抑制的 程度。
问题3：如何检测琥珀酸脱氢酶的活性状况？
• 在体内,琥珀酸脱下的2H经电子传递链传递，最后 与氧结合生成水，并释放出能量。
• 在体外可利用甲烯兰(蓝色)作为人工受氢体，接受 琥珀酸脱下的2H而被还原为甲烯白(无色)。
•蓝色消褪的快慢可显示琥珀酸脱氢酶的活性。
问题4：何为竞争性抑制？
问题5：本次实验中的抑制剂是什么？为何 选择该物质作为抑制剂？
– 低速离心机(在6,000rpm以下) – 高速离心机(在25,000rpm以下) – 超速离心机(在30,000rpm以上)
目前商售大型超速离心机最高转速达100,000rpm， 相对离心力达803,000×g。
低速离心机
台式高速冷冻离心机
超速冷冻离心机
离心机转子
常用的离心机转子有三种：
离心机转子从静止状态加速旋转
– 如果颗粒密度＞周围介质的密度，则颗粒离开轴心方向
移动，即发生沉降；
– 如果颗粒密度＜周围介质的密度，则颗粒朝向轴心方向
移动，即发生漂浮。
在离心场中，作用于颗粒上的力主要有离心力Fc、 浮力FB和摩擦阻力Ff。
离心力
转速（revolutions per minute ，rpm）
相对离心力（relative centrifugal force, RCF）：是指在离心力场中，作用于颗粒的离心 力相当于地球引力的倍数， ×g RCF＝1.118×10-5RN2
R为离心转子的半径（cm），N为转速（转/分） 低速离心常以rpm表示 超速离心以×g表示。
离心机的分类
目前在生物医学领域内常用的离心机种类繁多， 按其离心转子所能达到的最高转速分为：
离心操作注意事项
1．精密平衡 2．对称放臵 3．锁定盖子 4．限速运转
– 确认所用转子最大额定速度，离心机不能超过最大额
定速度的75%。
5．停转开盖 6．选择合适的离心管和转子
– 一般离心管是特制聚乙烯管，不能用玻璃管代替离心
百度文库
管。 – 液体不能装得过多，以防离心时甩出，造成转头生锈 或被腐蚀。
实验目的
颈椎脱臼处死法处死小鼠
将实验动物的颈椎脱臼，断离脊髓致死， 为大、小鼠最常用的处死方法。 操作时用左手拇指、食指用力向下按压鼠 头及颈部，右手抓住鼠尾根部用力拉向后 上方，造成颈椎脱臼，脊髓与脑干断离， 实验动物立即死亡。
•注意: • 实验人员的安全； • 确认实验动物已经死亡； • 妥善处理好尸体。
(1)固定角度转子(fixed-angle rotor)；
(2)水平转子(swing-out rotor或swing-backet rotor)； (3)垂直转子(vertical rotor)。
转子通常用(铝)合金、铝(镍)合金或塑料制成。
钛合金转子虽然价格昂贵，加工困难，比较笨重，但 它强度大，耐用，能经受冷冻及高温消毒处理，抗化 学腐蚀和应变侵蚀的性能强，是当前最理想的转子。
2.00 — 1.00 5滴
• 摇匀 (此后再勿摇动!!)，注意观察各管之颜色变化，并记录各 管颜色消退的顺序和时间，并分析之。 •将退色的反应液震荡，观察实验现象并分析产生该现象的原因。
学习动物的处死方法 学习动物组织匀浆法
学习离心机的使用方法
了解琥珀酸脱氢酶的作用，进一步理 解酶的竞争性抑制原理
酶竞争性抑制实验所需试剂
1、pH7.4磷酸缓冲液 2、0.25％琥珀酸钠溶液 3、0.5％草酸钠溶液 4、0.01％甲烯兰溶液
小鼠的抓取保定
小鼠性情较温顺，挣扎力小，比较容易抓取和保定。 抓取时，用左手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部（如图 11-3所示）放在格板或铁笼上。 趁着小鼠试图挣脱的瞬间，迅速用另外三个手指压住小 鼠的尾巴根部握入手掌（如图11-4所示）； 放松拇指和食指，用另外三个手指控制小鼠，然后用食 指和拇指捏住小鼠头部两边疏松的皮肤提起小鼠（如图 11-5所示），完成抓取保定。
2、另取中试管五支，标号，按下表操作(单位为ml)：
试 剂
0.25％琥珀酸钠液
1号管
0.50
2号管
—
3号管
0.50
4号管
2.00
5号管
0.50
0.5％草酸钠液 蒸馏水 肝糜液 甲烯蓝
— 2.00 1.00 5滴
0.50 2.00 1.00 5滴
0.50 1.50 1.00 5滴
0.50 — 1.00 5滴
•The effect of a competitive inhibitor can be overcome with high concentrations of the substrate
离心技术
利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使臵于旋 转体（离心机）中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从 而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。
肝脏
组织匀浆法
匀浆的方式 –手工匀浆
–机器匀浆：组织捣碎匀浆器
–超声匀浆：超声粉碎机
–反复冻融
实验步骤
1、肝糜液的制备： 取小白鼠一只，颈椎脱臼法处死，立即剖腹将肝脏 全部取出（为何选肝脏？），臵于研钵中，用生理 盐水洗净肝脏中血液。 用剪刀剪碎肝脏，充分研碎至糊状，然后分批加入 少量磷酸缓冲液，边加边磨，总共加入7ml。 （分几 次加入，每次加入后均需充分研磨。） 注意：此步一定要研磨充分（酶位于线粒体内膜 上）。 研至匀浆后倒入离心管中，离心4分钟(3000转/分)。 将上清液转入另一试管中备用。此即为含有琥珀酸 脱氢酶的肝糜液。
实验四 酶的竞争性抑制
三峡大学医学院生物化学教研室
问题1：本次实验提取的是什么酶？
问题2：该酶位于细胞的什么部位？催化 什么化学反应？
琥珀酸脱氢生成延胡索酸:
琥珀酸脱氢酶 FAD FADH2
H CH COOH H CH COOH
琥珀酸 (succinate)
HOOC CH HC COOH
延胡索酸 (fumarate)