琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制

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实验2 琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察

实验2  琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察

实验2 琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察(一)原理琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶,测定细胞中有无这种酶可以初步鉴定三羧酸循环途径是否存在。

琥珀酸脱氢酶可使其底物脱氢,产生的氢可通过一系列传递体最后递给氧而生成水。

在缺氧的情况下,若有适当的受氢体也可显示出脱氢酶的作用。

如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下,可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸,脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。

这样,便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。

琥珀酸+ 甲烯蓝琥珀酸脱氢酶延胡索酸+ 甲烯白无氧条件丙二酸的化学结构与琥珀酸相似,它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。

若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合,则不能再催化琥珀酸脱氢,这种现象称为竞争性抑制。

如相对地增加琥珀酸的浓度,则可减轻丙二酸的抑制作用。

(二)试剂1.1.5%琥珀酸钠溶液:称取琥珀酸钠1.5g,用蒸馏水溶解并稀释至100ml。

如无琥珀酸钠可用琥珀酸配成水溶液后,以氢氧化钠溶液中和至pH7~8。

2.1%丙二酸钠溶液:称取丙二酸钠1g,用蒸馏水溶解并稀释至100ml。

3.0.02%甲烯蓝溶液。

4.1/15mol/LNa2HPO4溶液:取Na2HPO4 · 2H2O 11.8g,用蒸馏水溶解并稀释至1 000ml。

5.液体石蜡。

(三)操作1.猪心脏制备液:称取新鲜猪心1.5~2.0g放组织捣碎机中,加入等体积的石英砂及1/15mol/LNa2HPO4溶液3~4ml,捣碎成浆,再加入6~7ml1/15mol/LNa2HPO4溶液,放置1小时,不时摇动,离心取上清液备用。

2.取4支试管,编号并按下表操作:试管心脏制备液 1.5%琥珀酸钠溶液1%丙二酸钠溶液蒸馏水0.02%甲烯蓝溶液(滴)(滴)(滴)(滴)(滴)1 5 5 -10 22 5 5 -10 2(先煮沸)3 5 5 5 5 24 5 10 5 5 23.各管溶液混匀后,每管各加液体石蜡一薄层(约5~10滴)。

琥珀酸脱氢酶15生物化学实验--琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用

琥珀酸脱氢酶15生物化学实验--琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用

琥珀酸脱氢酶 15生物化学实验--琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用【目的】1 .掌握琥珀酸脱氢酶作用及丙二酸抑制作用的实验技术与原理。

2 .深化理解酶的竞争性抑制作用的特点。

【原理】肌肉组织含有的琥珀酸脱氢酶是一种结合蛋白酶,以FAD 为辅基。

它能催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸,FAD 接受氢生成FAD2H 。

体外实验以美蓝( 甲烯蓝) 为受氢体,使美蓝还原生成美白( 甲烯白) 。

其反应如下:琥珀酸脱氢酶活性越高,美蓝脱色所需的时间越短,由于美白易被空气中的氧氧化成美蓝。

故实验需在无氧条件下进行,可加一层液体石蜡以隔绝空气。

丙二酸与琥珀酸的化学结构很相似,能和琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酶结合,从而抑制琥珀酸的脱氢作用。

其抑制程度与抑制剂和底物二者的浓度有关。

本实验通过不同浓度的琥珀酸和丙二酸来观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用。

【器材】 1 .研钵与剪刀 2 .漏斗 3 .纱布 4 .恒温水浴【试剂】1 .0.2mol/L 琥珀酸溶液2 .0.02mol/L 琥珀酸溶液3 .0.2mol/L 丙二酸溶液4 .0.02mol/L 丙二酸溶液以上四种溶液均先用5mol/L NaOH 溶液调至pH7.0 ,再用0.01mol/L NaOH 溶液调至pH7.4 。

直接用琥珀酸钠或丙二酸钠配制亦可。

5 .1/15mol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.4 )1/15mol/L Na 2 HPO 4 80.8ml 与1/15mol/L KH 2 PO 4 19.2ml 混匀即可。

6 .0.02% 美蓝溶液7 .液体石蜡【操作】1 .肌肉提取液的制备取用蒸馏水清洗过的新鲜动物肌肉组织约10g ,置于研钵(或匀浆器)中,研磨成糜状,然后每克肌肉组织加 4 倍体积的冰冷的pH7.4 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液,混匀,用双层纱布过滤,取滤液备用。

2 .酶促反应取试管 5 支,编号,按下表操作。

实验三:琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 南京医科大学

实验三:琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 南京医科大学

3、丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂
浓 度
4、本实验以甲烯蓝为受氢体,在隔离空气条件下,
以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢
酶活性的抑制作用。
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸
延胡索酸ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
FAD
FADH2
三、操作步骤:
1、酶提取液的制备 1 g 兔肌肉、剪碎+海沙(研磨成糜状)
+12 ml 1/15M磷酸盐缓冲液 (区别于0.1mol/L) (两次,研成糊状);纱布过滤
2、酶促反应及竞争抑制作用
试剂(滴) 1 2 3 4 5
酶提取液
20 20 20 20 -
0.2 mol/L琥珀酸 4
4
4
-
4
0.02mol/L琥珀酸 -
-
- 4-
0.2 mol/L丙二酸 -
4
-
4
-
0.02mol/L丙二酸 -
-4--
蒸馏水
4
-
-
- 24
0.02%甲烯蓝
2 2 2 22
3、 各管混匀,加石蜡5滴隔绝空气, 37℃水浴
保温,观察褪色情况。(斜执试管,沿壁缓慢加, 不要产生气泡)
四、结果、讨论: 阴性对照
编号 1




时间
10min
20min
30min 40min 50min 60min
褪色快
不褪色 褪色缓慢 不褪色 不褪色
五、注意事项:
1 、充分碾磨家兔肌肉,碾磨器械、纱布要及时清 洗,注意回收。
2 、滴加液体石蜡。(实验结束,试管用洗衣粉刷净) 3 、观察结果时不能振摇试管,避免甲烯白重新氧
实验三 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制

生化试验课件实验三:琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制

生化试验课件实验三:琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
3丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂4本实验以甲烯蓝为受氢体在隔离空气条件下以甲烯蓝褪色程度来观察判断丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用
实验三 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
刘向华
南京医科大学
Nanjing medical university
生化与分子生物学系
Department of biochemistry and molecular biology
浓 度
4、本实验以甲烯蓝为受氢体,在隔离空气条件下,
以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢
酶活性的抑制作用。
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸
延胡索酸
FAD
FADH2
三、操作步骤:
1、酶提取液的制备 1 g 兔肌肉、剪碎+海沙(研磨成糜状)
+12 ml 1/15M磷酸盐缓冲液 (区别于0.1mol/L) (两次,研成糊状);纱布过滤
2、酶促反应及竞争抑制作用
试剂(滴) 1 2 3 4 5
酶提取液
20 20 20 20 -
0.2 mol/L琥珀酸 4
4
4
-
4
0.02mol/L琥珀酸 -
-
- 4-
0.2 mol/L丙二酸 -
4
-
4
-
0.02mol/L丙二酸 -
-4
-
-
蒸馏水
4
-
-
- 24
0.02%甲烯蓝
2 2 2 22
3、 各管混匀,加石蜡5滴隔绝空气, 37℃水浴
一、目的与要求:
了解琥珀酸脱氢酶(enzyme) 的作用及酶促反应中的竞争性抑 制作用(competitive inhibition)
二、实验原理:

琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制

琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制

实验三琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
一实验目的
了解琥珀酸脱氢酶的作用及酶促反应中竞争抑制。

二实验原理
肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶,能催化琥珀酸脱氢氧化生成延胡索酸,脱下的一对氢原子由FAD接受,生成FADH2。

本实验在无氧条件下采用甲烯蓝为受氢体(蓝色),接受FADH2传递的氢原子,使甲烯蓝受氢还原成甲烯白(无色),以指示酶的活性。

丙二酸与琥珀酸的结构相似,是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。

在该酶促反应中设置不同含量的底物,并加入等量的丙二酸,观察甲烯蓝颜色消退的速度,判断琥珀酸脱氢酶的活性及丙二酸对酶活性的抑制程度。

三药品器材试管、滴管、高速组织捣碎机、恒温水浴箱、组织等。

1.0.1mol/L磷酸盐缓冲液(Ph7.4)取0.1mol/L磷酸氢二钠溶液81ml和0.1mol/L
磷酸二氢钠19ml混合即成。

2. 1.5%琥珀酸钠溶液。

3.1%丙二酸钠溶液。

4.0.02%甲烯蓝溶液。

5.液体石蜡。

6.肌肉匀浆取新鲜的动物肌肉组织适量,用组织剪将其剪碎,加入pH
7.4磷酸盐
缓冲液,置于高速组织捣碎机中加工成约20%的肌匀浆。

四实验方法取四支试管,编号,按下表操作:
中保温,在15~20分钟内观察各管各管的颜色变化,做好记录。

五思考题
1结合本实验说明竞争性抑制的特点。

2结合实验原理说明各管颜色变化的原因。

探究“琥珀酸脱氢酶的作用及其抑制”实验操作过程的再设计

探究“琥珀酸脱氢酶的作用及其抑制”实验操作过程的再设计

[] 2 查锡 良, 周春燕. 0 8 生物化学 ( 7版 ) 北京 : 民卫生 出版 20. 第 . 人

[] 3 贾弘裎. 05 生物化学. 20 . 北京 : 人民卫生出版社 , 9 1 8 [] 4 杨光彩 , 肖应庆 , 方振伟.0 1 生物化学 实验指导. 20 . 广州 : 华南 理
工 大 学 出 版 社 ,6 9
室外拿小盆盛 雪 以备用 , 避免 了 因冰块 和试 管接 触面
积减少所造成 对酶 活性 的影 响 , 这样 不 但能 提高 学生 对 实验操作 的兴趣 , 而且增 强他们的求 知欲 ; 实验时 ④ 取心、 、 肝 骨骼肌 由原来 的 5 减少到 3 , g g制备 的酶液足

丙 二酸是琥珀酸脱 氢酶 的竞 争性 抑制 剂 , 如果有 丙 二酸存在时 , 酶 的活 性受 到抑 制 。丙 二酸 与琥 珀 此
酸 脱氢酶 的亲和力 远大 于琥 珀酸本 身 对它 的亲和 力 ,
因此 抑制作 用很 强 l 。心 肌 、 、 骼肌 等 组织 细胞 - 5 J 肝 骨
中的琥 珀酸脱 氢酶 , 能催化琥 珀酸脱氢 生成延胡索 酸 , 脱 下的 2 H由辅基 F D接受还 原成 F D 2 然后依 次 A AH , 通 过泛醌 、 细胞 色 素体 系将 2 传 递 给 氧生 成 水 [] H 6。 实验 中用 甲烯蓝 ( B 为受 氢体 。在 隔绝 空 气 的条 M ) 件下脱下 的氢被蓝色的 甲烯蓝 接受 还原成无色 的 甲烯
用[ 。 引
3 结 果 与 分 析
1 号管在 3 ℃恒温 时颜 色消 退最 快 , 明酶 的活 7 说 性最强 ; 5号管 同样在 3  ̄恒 温但加 的是煮沸后 的酶 , 7C 颜 色不变 , 说明酶没有 活性 ; 2号管 由于含 有丙二 酸抑 制剂 , 以褪色 比 1 管慢 ; 所 号 3号管 由于没有加 入琥 珀 酸脱氢酶 , 颜色不变 ; 管褪色速度 介 于 1 和 2号 4号 号 管之间 , 为反应液 中含有丙二酸抑制 剂 , 并且 在抑制 剂浓度相 同的条件 下 , 管底 物 浓度 比 2号 管 增 大 4号

琥珀酸

琥珀酸

先在试管中加入琥珀酸钠、丙二酸钠、水、甲烯蓝、磷酸缓冲液等试剂,放在37℃恒温水浴中保温10min,再加入肌肉浆,混匀后立即在各管中加入0.5~1mL 液体石蜡,覆盖于液面上使试样与空气隔绝。在37℃恒温水浴中继续保温。从加入液体石蜡开始记录甲烯蓝变白所需时间。
注意事项
①第3管加入的肌肉浆预先用100 ℃恒温水浴中保温5min,以杀死酶活性作为对照管。
②观察变色时不要振动试管以免氧气调入管内影响变色。
三、仪器、原料和试剂
仪器
试管、恒温水浴锅、研钵。
原料
肌肉
试剂
1. 1/15mol/L—pH 7.0磷酸缓冲液
2. 0.1mol/L 琥珀酸钠
3. 0.01%甲烯蓝溶液
4. 0.04mol/L 丙二酸钠溶液
5. 石英砂
6. 液体石腊
四、操作方法
1.琥珀酸脱氢酶
(1)取肌肉2g,加磷酸缓冲液5mL 在研钵中研成肌肉浆。
(2)取试管2支,各加肌肉浆2mL,其中一管置100℃恒温水浴锅中保温5min,灭酶作为对照管。
两管各加0.01%甲烯蓝溶液2滴,各加0.1mol/L 琥珀酸钠溶液lmL,摇匀。
(3)各加液体石腊封口。
(4)在40℃恒温水浴中保温10min。
2.丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用
取3支试管编号(若定量,用比色法),按下表加入各种试剂。
丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制刑。细菌量越多或脱氢酶活性越高甲烯蓝脱色所需时间越短。因此,甲烯蓝脱色所需时间的倒数可用来表示酶的活性或细菌生长的情况。
根据上述原理,可用甲烯蓝脱色法来测定脱氢酶或细菌含量。例如,在评定牛奶的等级时,可用此法测定牛奶中的杂菌含量,脱色越快,含菌量越高,牛奶质量越差。由于甲烯蓝容易被空气中的氧所氧化,所以实验需在无氧情况下进行。常用Thnbe ro(邓氏)管抽去空气进行反应,也可简化为,用液体石腊(或冻结琼脂)封闭反应液,制造无氧环境,这样可不用抽真空设备。

实验三琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察

实验三琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察

实验三琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察一、基本原理脱氢酶的作用在于激活并脱下底物上的氢,使之通过一系列传递体最后传给氧而生成水。

在缺氧的条件下,适当的受氢体也可接受脱氢酶从底物上脱下的氢。

因此,选用适当的受氢体便可以观察到脱氢酶的作用。

琥珀酸脱氢酶能使琥珀酸脱氢生成延胡索酸,并将脱下的氢交给受氢体。

当在缺氧的条件下用甲烯蓝(美蓝,蓝色物质)作为受氢体时,甲烯蓝被氢还原生成甲烯白(美白,无色物质),其反应如下:CH2—COOH 琥珀酸脱氢酶HC—COOH| + MB ——————→‖+ MB·2HCH2—COOH 无氧条件HOOC—CH琥珀酸甲烯蓝(兰色)延胡索酸甲烯白(无色)根据这种蓝色转变为无色的变化过程,就可以判断出琥珀酸脱氢酶起了催化作用。

丙二酸的结构与琥珀酸相似,可与琥珀酸竞相结合琥珀酸脱氢酶的活性中心,从而抑制该酶的活性,是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。

这种抑制作用即属酶的竞争性抑制作用。

试剂及器材二、试剂及器材1.1.5% (w/v)琥珀酸钠溶液: 2.1% (w/v)丙二酸钠溶液:3. 0.02% (w/v)甲烯蓝溶液4. 1/15mol/L Na2HPO4溶液:5. 液体石蜡油6 手术剪,镊子7.研钵,净细砂8.恒温水浴锅, 酒精灯9.离心机及离心管10. 刻度吸管和滴管三、操作步骤1.猪心脏提取液的制备:(1)称取新鲜猪心脏1.5—2g放置研钵中剪碎;(2)加入等体积的净细砂1/15mol/LNa2HPO4溶液3—4 ml,然后将之研磨成匀浆;(3)再加入1/15mol/L Na2HPO4溶液6—7ml,放置30min,不时摇动;(4)于2000rpm离心10min,取上清备用。

2.取4支试管,按下表编号操作:2_52010421555103225_55(煮沸)2225_5510.02% 甲烯蓝(滴)蒸馏水(滴)1%丙二酸钠(滴)1.5%琥珀酸(滴)心脏提取液(滴)试管号3.加好试剂后混匀,然后立即在各试管中加入一层(约5-10滴)液体石蜡油。

琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制报告

琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制报告

琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
一、实验原理
在化学结构上与底物类似的抑制剂,能与底物竞争酶分子的活性中心,从而抑制酶的活性。

抑制程度随抑制剂浓度的改变而改变。

如果底物浓度不变,酶活性的抑制程度随抑制剂浓度的增加而增加。

反之,如抑制剂浓度不变,则酶活性随底物浓度增加而逐渐回复,这种类型的抑制称竞争性抑制。

琥珀酸脱氢酶是一种含铁的黄酶,它可以催化琥珀酸脱氢酶,生成延胡索酸,在有氧的情况下,脱下的氢经呼吸链的传递,与氧化合成水。

肝中含有丰富的琥珀酸脱氢酶,体外实验在隔绝空气的情况下,琥珀酸脱下的氢可被人工受氢体一甲烯蓝接受还原成甲烯白。

因此我们可以用甲烯蓝被还原褪色的速度和程度,来了解不同底物浓度,不同抑制剂浓度时酶活性的改变。

二、实验步骤与结果
2.将上述各试管摇匀,于夜面上加液体石蜡10滴,放37℃水浴中保温,随时比较,观察
各试管颜色变化。

3.结果
经观察,各个试管的褪色时间顺序为:1>4>2>3
三、结论
底物浓度、抑制剂浓度影响了酶的竞争性。

琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制实验报告的心得体会

琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制实验报告的心得体会

琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制实验报告的心得体会
琥珀酸脱氢酶(SDH)是一种酶,参与生物体内的三羧酸循环。

SDH的主要功能是将琥珀酸氧化为富能的丙酮酸和二氧化碳,为细胞提供能量。

SDH的活性受到一些物质的影响,例如甲肝灵等药物就可以抑制SDH的活性。

竞争性抑制实验是在SDH的底物琥珀酸中加入不同浓度的抑制剂,观察SDH的活性变化。

实验的结果可能呈现出以下几个情况:抑制剂呈现剂量依赖性的抑制作用,活性呈线性的降低;抑制剂对SDH的抑制作用存在饱和点,但达到饱和点后,SDH的活性降低幅度逐渐增加;抑制剂对SDH的抑制作用存在饱和点,但在饱和点后活性降低趋于不变。

实验者可以通过这些结果,得到抑制剂的半数抑制浓度(IC50),进而评价抑制剂的效果。

在实验中,我们观察到抑制剂呈现剂量依赖性的抑制作用,且具有饱和点。

这说明抑制剂与SDH结合的速度是有限的。

从实验结果中可以看出,IC50值比较低,这表明抑制剂的效果比较好。

实验结果为我们提供了有关SDH的一些基本信息,也有助于我们更好地理解如何控制相关疾病,比如心肌缺血。

在这个实验中,我深刻认识到了科学研究的重要性,同时也学会了如何进行实验和如何分析实验结果。

这些经验对于我的学习和未来的研究都有一定的启示作用。

实验十六、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用

实验十六、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用

实验十六:丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用【实验名称】:丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用09救援一班第三大组李岚宇36室温:25℃(一)实验目的:1、学习和掌握竞争性抑制作用的特点。

2、观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。

(二)实验原理:化学结构与酶作用的底物结构相似的物质,可与底物竞争结合酶的活性中心,使酶的活性降低甚至丧失,这种抑制作用称为竞争性抑制作用。

琥珀酸脱氢酶是机体内参与三羧酸循环的一种重要的脱氢酶,其辅基为FAD,如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下,可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸,脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。

这样,便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。

丙二酸的化学结构与琥珀酸相似,它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。

若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合,则不能再催化琥珀酸脱氢,这种现象称为竞争性抑制。

如相对地增加琥珀酸的浓度,则可减轻丙二酸的抑制作用。

(三)实验材料与仪器:1器材大白鼠、手术剪、镊子、磁盘、匀浆器、量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管及试管架、恒温水箱、电热水浴锅2试剂0.2mol/L琥珀酸溶液、0.02mol/L琥珀酸溶液、0.2mol/L丙二酸溶液、0.02mol/L 丙二酸溶液、1/15mol/L磷酸缓冲液、0.02%甲烯蓝、液体石蜡。

(四)实验步骤:1、酶提取液的制备:去大白鼠的肝脏、心脏、肾脏,用冷水洗3次,加入1/15mol/L磷酸缓冲液pH 在7.4。

在匀浆器中进行匀浆,然后用纱布过滤,用干净的烧杯收集过滤的备用。

2、取试管6支,编号,在按图步骤操作,酶提取液(ml)磷酸缓冲液(ml)0.2mol/L琥珀酸(滴)0.02mol/L琥珀酸(滴)0.2mol/L丙二酸溶液(滴)0.02mol/L丙二酸溶液(滴)蒸馏水(滴)甲烯蓝(滴)褪色时间(分钟)试管1 2 - 8 - - - 8 3 3分33秒试管2 2 - 8 - - 8 - 3 5分30秒试管3 2 - 8 - 8 - - 3 6分04秒试管4 2 - - 8 8 - - 3 7分28秒试管5 - 2 8 - - - 8 3 无限大试管6 2 - 8 - - - 8 3 无限大试管6,在酶提取液先在100℃的水浴加热煮沸5min。

琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制

琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制

三、实验步骤:
标准管法测定酶活性:
1、取干燥试管4支,标号 测定管 对照管 标准管 空白管
2、依次加入试剂,混匀,37℃保温 3、呈色反应后,520nm比色测OD值
P77页
四、结果:
谷丙转氨酶活性单位/mL鼠肝匀浆=
五、注意事项:
1 、保温温度和时间要精确,即谷丙转氨酶发挥 催化作用环境要一致。
2. 试剂滴加时,看清剂量,滴加液体石蜡时沿 着管壁倾斜加入。
3. 观察结果时不能振摇试管!避免甲烯白重新 氧化变蓝。
(Page 76) 实 验
二十二
改良Mohum法测定
鼠肝谷-丙转氨酶活性
一、实验目的
了解谷-丙转氨酶活性测定 的原理及测定方法。
二、实验原理:
丙氨酸+α-酮戊二酸
GPT
谷氨酸+丙酮酸 2、4-二硝基苯肼
4、本实验以甲烯蓝为受氢体,在隔离空气条件下,以甲烯 蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制 作用。
三、操作步骤:
1、酶提取液的制备
1g 兔肌肉(剪碎)+海砂少许 +2mL 1/15 mol /L磷酸盐缓冲液(研磨成糊状),然后再分 两次加10mL 1/15 mol /L磷酸盐缓冲液(混匀)。
2 、掌握概念:酶活性单位 3、 微量移液器的使用
分光光度计的使用
1、打开分光光度计,预热20-30min。 2、调节旋钮至需要的光波长。 3、检查拉杆是否在分光光度计的休息状态。
T档 拉杆0档
调T100% : 空白管
T档 拉杆1档
调T 0% :
A档 拉杆2、3、4档 测吸光度: 标准管,测定管
休息状态:拉杆1档
竞争性抑制作用
抑制程度 取决于抑制剂 和底物对酶的 相对亲和力以 及抑制剂和底 物浓度比。

琥珀酸脱氢酶实验报告

琥珀酸脱氢酶实验报告

一、实验目的1. 理解琥珀酸脱氢酶在细胞代谢中的作用。

2. 掌握琥珀酸脱氢酶的活性测定方法。

3. 观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。

二、实验原理琥珀酸脱氢酶(SDH)是三羧酸循环(TCA循环)中的一个关键酶,其主要功能是催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸,同时将脱下的氢传递给电子传递链。

本实验采用比色法测定琥珀酸脱氢酶的活性,通过观察甲烯蓝的脱色时间来反映酶的活性。

丙二酸作为竞争性抑制剂,其化学结构与琥珀酸相似,可以与琥珀酸竞争酶的活性中心,从而抑制琥珀酸脱氢酶的活性。

三、实验材料与仪器实验材料:1. 大肠杆菌2. 琥珀酸钠3. 甲烯蓝4. 磷酸缓冲液5. 丙二酸溶液6. 液体石蜡实验仪器:1. 试管2. 吸量管3. 电热水浴锅4. 恒温水浴箱5. 移液器四、实验步骤1. 菌液制备:将大肠杆菌接种于斜面培养基,37℃培养24小时,用无菌移液器取菌苔,加入5ml磷酸缓冲液,振荡混匀后,在离心机上以2500 r/min离心5分钟,弃去上清液,加入6ml磷酸缓冲液重悬菌体。

2. 酶活性测定:a. 取试管3支,分别编号为A、B、C。

b. 向A管中加入1ml菌液,B管中加入1ml菌液和1ml丙二酸溶液,C管中加入1ml菌液和1ml磷酸缓冲液。

c. 向各管中加入0.5ml琥珀酸钠和1ml甲烯蓝溶液。

d. 将试管放入恒温水浴箱中,在37℃下保温5分钟。

e. 将各管取出,立即在离心机上以5000 r/min离心5分钟,取上清液。

f. 用分光光度计在波长620nm处测定各管的吸光度值。

3. 计算酶活性:a. 计算A管和C管的平均吸光度值。

b. 计算A管和C管的吸光度比值。

c. 根据标准曲线计算琥珀酸脱氢酶的活性。

五、实验结果与分析1. 通过实验,成功制备了大肠杆菌菌液,并测定了琥珀酸脱氢酶的活性。

2. 加入丙二酸溶液的B管与未加丙二酸溶液的C管相比,吸光度值明显降低,说明丙二酸对琥珀酸脱氢酶具有竞争性抑制作用。

3. 通过计算,得出琥珀酸脱氢酶的活性为X单位。

实验三-丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用

实验三-丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用

实验三-丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用引言:琥珀酸脱氢酶(SDH)是一种重要的蛋白质,其在三羧酸循环中起着关键的作用。

SDH 能够催化琥珀酸脱氢反应,将琥珀酸氧化为富含能量的丙酮酸。

在人体中,SDH的异常通常会导致疾病的发生,如甲状腺疾病、糖尿病、肝脏疾病等。

因此,SDH的调节和控制是非常重要的。

在本实验中,我们将研究丙二酸对SDH的竞争性抑制作用,以期了解其在细胞代谢中的作用。

实验目的:2、了解SDH在细胞代谢中的作用。

实验原理:SDH是一种酸性蛋白质,其催化反应式为:琥珀酸+辅酶Q+OH-→丙酮酸+辅酶QH2。

SDH活性的测定一般采用酶联免疫吸附法(ELISA)。

在实验前,需要将SDH标准品稀释至一定浓度。

然后,将SDH标准品加入到孔板中,与不同浓度的丙二酸预先混合,测定SDH 的活性。

根据SDH催化反应的特点和丙二酸的特异性竞争性抑制作用,可确定丙二酸的浓度和SDH的活性之间的关系。

实验步骤:1、将SDH标准品稀释至一定浓度,取适量的SDH标准品分别加入到不同的孔板中。

2、根据实验需求,添加不同浓度的丙二酸到不同孔板中,混合均匀。

3、放置孔板至37℃恒温箱内,反应30分钟。

4、加入反应液至各个孔位中,搅拌均匀。

5、测定不同孔板的OD值。

6、据此根据SDH活性的公式,计算SDH活性值。

7、根据SDH活性值和丙二酸的浓度,确定丙二酸浓度与SDH活性之间的关系。

实验结果:见附件1。

讨论:通过实验,我们发现丙二酸对SDH的竞争性抑制作用比较显著。

丙二酸的浓度与SDH 的活性呈明显的负相关关系。

这说明丙二酸可能在细胞代谢中扮演着重要的角色,其可以阻碍SDH的催化反应,从而影响三羧酸循环中能量代谢的正常进行。

本实验结果表明,丙二酸具有竞争性抑制SDH的能力,说明丙二酸在细胞代谢中的作用非常重要。

这为进一步探讨丙二酸在细胞代谢中的作用提供了有价值的参考和思路。

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琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
[原理]
肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶,能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸。

反应中生成的FADH2可使蓝色的甲烯蓝还原为无色的甲烯白(还原型甲烯蓝)。

丙二酸与琥珀酸的分子结构相似,是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂,故能与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶的活性中心。

丙二酸与琥珀酸脱氢酶结合后,酶活性受到抑制,则不能再催化琥珀酸的脱氢反应。

抑制程度的大小,随抑制剂与底物两者浓度的比例而定。

本实验以甲烯蓝为受氢体,在隔绝空气的条件下,通过甲烯蓝的褪色程度来判断琥珀酸脱氢酶的活性,并籍此观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。

CH2COOH
CH2 COOH FAD MB•2H(甲烯白)
琥珀酸
琥珀酸脱氢酶
CHCOOH
HOOCCH FADH2MB(甲烯蓝)
延胡索酸
[试剂]
1.0.2mol/L琥珀酸: 取琥珀酸钠(MW:270.14)27克加水至500ml。

2.0.02mol/L琥珀酸: 取1液稀释10倍。

3.0.2mol/L丙二酸: 取丙二酸钠(MW:166.05)16.7克加水至500ml。

4.0.02mol/L丙二酸: 取3液稀释10倍。

5.1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲: 1/15mol/LNa2HPO4溶液80.8ml与1/15mol/LKH2PO419.2ml 混合即成。

(1)1/15mol/LNa2HPO4溶液: 取Na2HPO4.12H2O (MW:358.14)23.876 克, 加水至1000ml。

(2)1/15mol/LKH2PO4溶液:取KH2PO4(MW:136.09)1.814克,加水至200ml.
6.0.02%甲烯蓝溶液
7.液体石蜡
[主要器材]
1.新鲜猪心
2.玻璃研钵
3.漏斗
4.手术剪
5.棉花
6.恒温水浴箱
[操作步骤]
1.心肌提取液的制备取新鲜猪心约6g,用蒸馏水清洗后剪成碎块,置于研钵中,加入适量净沙,研磨成糜状。

再加1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液12ml,研成糊状,用棉花过滤,滤液即为猪心提取液。

2.取小试管5支,编号,按表11操作:
表11
试剂(滴)1管2管3管4管5管
猪心提取液20 20 20 20 ─
0.2mol/L琥珀酸 4 4 4 ─ 4
0.02mol/L琥珀酸─── 4 ─
0.2mol/L丙二酸─ 4 ─ 4 ─
0.02mol/L丙二酸── 4 ──
蒸馏水 4 ───24
0.02%甲烯蓝 1 1 1 1 1
3.将上述各管摇匀,于各管滴加液体石蜡5滴以隔绝空气,置于37℃水浴中保温,随时观察各管甲烯蓝褪色情况,记录时间,确定5个试管的褪色顺序并解释结果。

[注意事项]
1. 加液体石蜡时宜斜执试管,沿管壁缓缓加入,不要产生气泡。

2. 加完液体石蜡后,在观察结果的过程中,不要振摇试管, 以防止溶液与空气接触而使甲烯蓝重新氧化变蓝。

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