酶在食品分析中的应用优秀课件

• 对酶法分析来说，其适用范围仅限于与酶促反 应相关的物质的检测分析，包括酶的底物、辅 酶、酶的抑制剂或激活剂的测定。酶法分析的 检测物质范围有限，但不影响其在临床诊断、 食品分析、环境检测和基础研究中的应用。
• 近年来，酶的固定化技术和生物传感器的快速 发展和应用，其低成本、高精度、快速检测和 自动化分析的特点拓宽了酶法分析的应用领域。
• Ex Ea Ei A → B → C→p
• 式中A为底物，B、C为中间产物，P为可直接测定的产物；Ex为待测酶 ，Ea和Ei都为工具酶，依据工具酶作用的不同又分别称为辅助酶和指示 酶；辅助酶在酶偶联反应中可以一个或多个，也可以不需要；指示酶 是指能监测反应速度的酶。临床酶学分析中，以NAD（P）H/ NAD（P ）+为辅酶的脱氢酶和以H2O2为底物的过氧化物酶（POD）是常用的指 示酶。
• ①比色法 如果酶反应的产物可与特定的化学试剂反应而生 成稳定的有色溶液，且生成颜色的深浅与产物的浓度在一 定的范围内有线性关系可用此法。如蛋白酶的活力测定： 蛋白酶可水解酪蛋白，产生的酪氨酸可与福林试剂反应生 成稳定的蓝色化合物，在一定的浓度范围内，所生成蓝色 化合物颜色的深浅与酪氨酸的量之间有线性关系，可用于 定量测定。
• ②量气法 主要用于有气体产生的酶促反应。如氨基酸脱羧 酶、脲酶的活力测定。产生的二氧化碳量可用特制的仪器 如瓦氏呼吸仪测定之。根据气体变化和时间的关系，即可 求得酶反应的速度。
• ③滴定法 如果产物之一是自由的酸性物质可用此法。如脂 肪酶催化脂肪水解，脂肪酸的增加量代表脂肪酶的活力。
• ④分光光度法 利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接 测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。几乎所有 的氧化还原酶都使用该法测定。如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和 辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下 无吸收，脱氢酶类可用该法测定。该法测定迅速简便，自动 扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极 大的方便。
• ⑤放射测量法 是酶活力测定中较常用的一种方法。一般用 放射性同位素标记底物，在反应进行到一定程度时，分离带 放射性同位素标记的产物并进行测定，就可测知反应进行的 速度。常用的同位素有3H，14C，32P，35S，131I等。如脲 酶，将底物尿素用14C标记，产生的带放射性的CO2气体可 用标准计数法进行测定。
酶法分析：定性或定量的检测分析物
酶法分析的发展
• 酶在定量分析中的应用可以追溯到19世纪 中期。当时，曾采用麦芽提取物作为过氧 化物酶源，以愈创木酚作为共底物或指示 剂测定过氧化氢。
• 然而，酶法分析真正的发展应归于它在临 床实验室中的广泛应用。
酶法分析的发展
• 如早在1914年临床上就开始采用脲酶测定尿中 的尿素，但是在临床实验室中酶分析的真正突 破要推迟到1958年，当时转氨酶分析发展成为 诊断肝病和心脏病的一个有效手段。
• 到了20世纪50年代前已有60种物质能借助于酶 法分析。近年来，酶法分析发展迅速，广泛应 用于临床检验、食品、环境等生物及其它样品 的检测。
1. 酶法分析的特点及应用类型
• 酶的特性 催化效率高
• 酶法检测的特点 快速
灵敏性强
专一性
特异性、准确
不需要物理分离，干扰少
酶法定量检测
• 动力学法：单位时间内酶促反应速率
• ⑥酶偶联分析 某些酶本身没有合适的测定方法，但可偶 联另一个酶反应进行测定。其基本方法为：应用某一高
度专一性的工具酶使被测酶反应能继续进行到某一可直 接连续且简便准确测定阶段的方法。如：被测E1反应的 产物B是某一脱氢酶(E2)的底物，向反应体系中加入足量 的脱氢酶和NAD+或NADPH+，使反应由A经B继续进行到 C，然后测定NADH或NADPH的特征吸收光谱的变化，即 可间接地测定E1的活力大小。如己糖激酶的活力测定即 应用这一方法。
酶在食品分析中的应用类型
• 1. 去除样品中的杂质。如测定果糖、多糖等。 • 2. 催化待测物生成新的产物，而这种产物更容
易被定量分析。如：淀粉的测定。 • 3. 测定食品中酶的活性作为食品的指标，如过
氧化物酶的测定。 • 4. 利用酶催化反应所产生的一些信息。如酶联
免疫法、酶电极法等。
2 酶联免疫测定（ELISA）
• ELISA是将酶分子与抗体分子连接成一个酶标分 子，当它与固相免疫吸附中相应抗原或抗体复 合物相遇时形成酶-抗原-抗体结合物，加入酶底 物，底物被催化成可溶性或不溶性显色产物， 可用肉眼或分光光度计定性或定量，根据显色 深浅，确定待测抗原或抗体的浓度与活性。
酶在食品分析中的应用
主要内容
• 1 酶法分析的特点及应用类型
• 2 酶联免疫测定（ELISA） 重点
• 3 聚合酶链式反应（PCR）
•
4 酶生物传感器
•
5 酶抑制率法
酶法分析的定义
• 酶法分析是以酶作为分析试剂，利用酶催 化反应的特异性和高效性的特点，定性、 定量的检测待测物。
酶活力测定：测定样品中酶的含量或酶活力
• 酶联免疫测定（enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA）是继放射免疫测定技术之后发 展起来的一项新的免疫学技术。
• ELISA自上世纪70年代出现开始，就因其高度的 准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快以 及费用低等优点，在临床和生物疾病诊断与控 制等领域中倍受重视，成为检验中最为广泛应 用的方法之一。
• 要求：底物、pH、温度、样品、空白与 对照
• 测定方法：取样测定法、连续测定法
酶偶联反应法
• 酶偶联法测定，即在反应体系中加入一个或几个工具酶， 将待测酶生成的某一产物转化为新的可直接测定的产物， 当加入酶的反应速度与待测酶反应速度达到平衡时，可以 用指示酶的反应速度来代表待测酶的活性。
• 在酶活性测定时，如果底物或产物不能直接测定或难于准 测定，可采用此方法。
• 注意：使用该法要求指示酶必须很纯，且具有高度的专 一性，以免干扰反应而给测定带来麻烦。
• 终点法：完成一定量反应所需要的时间。 • 如α-淀粉酶的活力测定。因为碘对淀粉呈现蓝
色反应，当淀粉溶液中加入淀粉酶后，碘的蓝 色反应消失而呈现红棕色；碘对淀粉颜色反应 消失的时间可表示淀粉酶活力的大小。碘对淀 粉颜色反应消失花的时间越短，表示酶的活力 越高