实验一 感受态制备及转化.
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实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备 及质粒DNA的转化
一、实验目的 学习大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及转化子鉴定的 基本原理和操作技术。 二、实验原理
感受态细胞(Competent Cells)：受体细胞经过一些特殊方
法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，能允许 外源DNA分子进入。 转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细胞,使之 获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、
6. 菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl2 1.0mL，轻吹并悬浮细胞，冰上10min； 7. 离心 5000rpm ，40C，5min，去上清； 8. 用冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2 100μ L用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作； 9.此为感受态细胞，若储存则需加入15～30%甘油，可在-700C或-200C冻存。
基因工程等研究领域的基本实验技术。
目前常用的转化方法为电转化法和化学转化法，电转化法简 便易行，转化效率高，但需要专门的电转化仪；化学转化不
需要额外的设备，成本较低。
致敏过程：用理化方法诱导细胞进入感受态的操作； 细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源 DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短 时间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物；
注意事项
1. 无菌操作 2. 低温操作（冰上操作） 3. 动作要轻柔
思考题
1.如果阴性对照中长出菌落，可能的原因是什么？ 2.在Amp+培养板中，菌的密度过高或培养时间过 长时会在阳性菌的周围长出一些小的卫星菌落，它们是 Amps的，是什么原因导致这些卫星菌落产生的？
Baidu Nhomakorabea
复苏：细菌在非选择性培养基上保温一段时间，使抗性的表
型表达后再转到含抗性的选择性培养基上，长出来的菌落即
为转入了外源基因的菌落；
Ampr抗性基因编码一种周质酶（β -内酰胺酶）可特异地切割Amp的β -内 酰胺环，从而使其失去杀菌能力
影响转化效率的因素
细菌的生长状态(5x107个/mL) 感受态细胞的质量 试剂的质量
外源DNA的质量与数量
器皿的洁净度 污染—尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行
三、器材与试剂
1.材料
大肠杆菌菌株Top10、重组质粒。 2.设备 恒温摇床、电热恒温培养箱、台式高速离心机、超净工作台、低温 冰箱、恒温水浴锅、分光光度计、微量移液枪、1.5mL离心管。 3.试剂 LB液体培养基、氨苄青霉素母液(Ampicillin, Amp)、含Amp的LB固 体培养基、0.1mol/L CaCl2灭菌溶液，IPTG, x-gal。
（二）转化及复苏：
1. 取 100 μL感受态细胞，加入重组DNA 20 μ L （50ng)； 取 100 μL感受态细胞，加入20 μL无菌水（阴性对照1）； 取 100 μL感受态细胞,加入对照DNA 20 μ L （阴性对照2） 用枪头混匀，冰上放置20min。 阴性对照的目的？ 2. 420C循环水浴热激90秒 3. 冰浴2分钟 4. 每管加800μ L LB液体培养基，370C慢摇40min（120～140rpm） 5. 40C，5000rpm离心2min，弃去600μ L，取20～50μ L菌液，加40μ L Xgal和4μ L IPTG，混匀后涂布在含Amp的培养皿中 6. 倒置培养过夜（ 370C）
四、实 验 流 程
（一）感受态细胞的制备： 1. 预培养：接一单菌落到3mL LB培养基中，370C、190rpm振荡培 养过夜； 2. 取 0.4mL预培养菌液转移到含40mL LB液体培养基的锥形瓶中，
370C、250rpm振荡培养2.5～3小时（OD600 0.4～0.5）；
3. 将菌液转移到1.5mL离心管中，冰上放置10min； 4. 离心 5000rpm，40C，5min； 5. 倒出培养液，将管倒置，使培养液流尽；
一、实验目的 学习大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及转化子鉴定的 基本原理和操作技术。 二、实验原理
感受态细胞(Competent Cells)：受体细胞经过一些特殊方
法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，能允许 外源DNA分子进入。 转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细胞,使之 获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、
6. 菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl2 1.0mL，轻吹并悬浮细胞，冰上10min； 7. 离心 5000rpm ，40C，5min，去上清； 8. 用冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2 100μ L用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作； 9.此为感受态细胞，若储存则需加入15～30%甘油，可在-700C或-200C冻存。
基因工程等研究领域的基本实验技术。
目前常用的转化方法为电转化法和化学转化法，电转化法简 便易行，转化效率高，但需要专门的电转化仪；化学转化不
需要额外的设备，成本较低。
致敏过程：用理化方法诱导细胞进入感受态的操作； 细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源 DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短 时间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物；
注意事项
1. 无菌操作 2. 低温操作（冰上操作） 3. 动作要轻柔
思考题
1.如果阴性对照中长出菌落，可能的原因是什么？ 2.在Amp+培养板中，菌的密度过高或培养时间过 长时会在阳性菌的周围长出一些小的卫星菌落，它们是 Amps的，是什么原因导致这些卫星菌落产生的？
Baidu Nhomakorabea
复苏：细菌在非选择性培养基上保温一段时间，使抗性的表
型表达后再转到含抗性的选择性培养基上，长出来的菌落即
为转入了外源基因的菌落；
Ampr抗性基因编码一种周质酶（β -内酰胺酶）可特异地切割Amp的β -内 酰胺环，从而使其失去杀菌能力
影响转化效率的因素
细菌的生长状态(5x107个/mL) 感受态细胞的质量 试剂的质量
外源DNA的质量与数量
器皿的洁净度 污染—尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行
三、器材与试剂
1.材料
大肠杆菌菌株Top10、重组质粒。 2.设备 恒温摇床、电热恒温培养箱、台式高速离心机、超净工作台、低温 冰箱、恒温水浴锅、分光光度计、微量移液枪、1.5mL离心管。 3.试剂 LB液体培养基、氨苄青霉素母液(Ampicillin, Amp)、含Amp的LB固 体培养基、0.1mol/L CaCl2灭菌溶液，IPTG, x-gal。
（二）转化及复苏：
1. 取 100 μL感受态细胞，加入重组DNA 20 μ L （50ng)； 取 100 μL感受态细胞，加入20 μL无菌水（阴性对照1）； 取 100 μL感受态细胞,加入对照DNA 20 μ L （阴性对照2） 用枪头混匀，冰上放置20min。 阴性对照的目的？ 2. 420C循环水浴热激90秒 3. 冰浴2分钟 4. 每管加800μ L LB液体培养基，370C慢摇40min（120～140rpm） 5. 40C，5000rpm离心2min，弃去600μ L，取20～50μ L菌液，加40μ L Xgal和4μ L IPTG，混匀后涂布在含Amp的培养皿中 6. 倒置培养过夜（ 370C）
四、实 验 流 程
（一）感受态细胞的制备： 1. 预培养：接一单菌落到3mL LB培养基中，370C、190rpm振荡培 养过夜； 2. 取 0.4mL预培养菌液转移到含40mL LB液体培养基的锥形瓶中，
370C、250rpm振荡培养2.5～3小时（OD600 0.4～0.5）；
3. 将菌液转移到1.5mL离心管中，冰上放置10min； 4. 离心 5000rpm，40C，5min； 5. 倒出培养液，将管倒置，使培养液流尽；