实验一 感受态制备及转化.
感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞实验报告]
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效价：指能用 1ug 的标准质粒能够转化出的菌落数。
再放到恒温振荡箱 60min
具体步骤
四．试验结果
化学效价检测
化学检测结果 菌数 4*10^7
.把感受细胞从超低温冰箱中拿出(冰水先预备好再拿出感受态细胞在
电转化检测结果 菌数 10^9
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五．试验分析
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表，经 42
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前培育
C2+处理的感受态细胞，其转化率一般能到达 5×106~2×107 转化子
将单菌落接种到 10ml 的培育液中，在恒温振荡器 37°下过夜培育
/ug 质粒 DN，可以满足一般的基因克隆试验。如在 C2+的基础上，联合其
水洗 3 加 10ml 水 离心 水倒掉
(50Ul~100Ul 若这里不能长到 10^6 则不行用)
4)XX 油 10%洗 2 次〔每次加 5ml〕中间离心两次 在第二次加 XX 油悬
电转化效价
浮后离心后加 120uLGYT 悬浮液
取 Pug19uL 加入感受态细胞再将此移到电击杯
5) 一个人预备 4 个小管子〔每个 40uL 扔到液氮速冻 放到-70℃
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感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞 实验报告]
也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出如今对数生长期，新颖幼 嫩的细胞是制备感受态细胞和进行胜利转化的关键。
制备出的感受态细胞临时不用时，可加入占总体积 15%的无菌 XX 油
重组 DN 分子体外构建完成后，必需导入特定的宿主〔受体〕细胞，使
感受态细胞的制备和质粒的转化实验
生物工程大实验学院：生命科学学院专业： 10级生物工程班级：三班姓名：林冬学号：指导教师：肖露老师感受态细胞的制备和质粒的转化实验一．实验目的：1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。
2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
二．实验原理：细菌吸收外源DNA 的能力最高时的状态被称为感受态细胞。
有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态，如本实验所用的大肠杆菌。
用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。
对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。
这种转化方法称为“化学法”。
三．材料：设备与试剂四．实验方法：①取100mlDH5ɑ培养物置于冰浴中10min，同时将0.1mCacl2和灭菌的50ml离心管4℃中放置10min.②在无菌条件下将培养物移入50ml离心管中（不能超过2/3体积约30ml）平衡后对称放入离心机，在4℃，6000转/min,离心5min,停止离心后，弃上清液（在超净工作上无菌条件下操作）③加入5ml预冷的0.1molCacl2溶液，用涡旋振荡器振荡均匀使DH5ɑ细胞重新悬浮，置于冰水浴中旋转20min后，在4℃6000转/min离心5min,弃上清。
④细胞重复③一次，离心后弃上清，沉淀后用4mlCacl2悬浮，加灭菌甘油至浓度15％左右，混匀后分装于1.5mlEP管中，200ul/管，于80℃冰箱中冻存备用。
转化实验：200ul感受态→加入1ul质粒混匀→42℃水浴90s→迅速拿出置于冰浴2min→加入800ulLB培养基→37℃，220rpm振荡培养1h→取出100ul涂板。
单菌落扩大培养用接种环挑单菌落接入含150ml液体LB培养基锥形瓶中。
37℃，120rpm摇瓶培养，直至透过菌悬液看报纸上的字能够看出形状但不能辨认。
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告
一、实验目的
本实验旨在探究感受态细胞的制备和转化过程，以及相关技术操作和注意事项。
二、实验步骤
1. 制备感受态细胞
（1）取出培养皿内的细胞，用PBS洗涤3次；
（2）将洗涤后的细胞加入含有5μM Calcein-AM的PBS中，放置于37℃孵育箱内30分钟；
（3）取出孵育后的细胞，用PBS洗涤3次，即可得到感受态细胞。
2. 转化感受态细胞
（1）将制备好的感受态细胞加入含有荧光素酶底物的培养基中；
（2）放置于37℃孵育箱内15分钟左右；
（3）观察荧光素酶底物是否被转化为荧光素，并记录转化效率。
三、实验结果与分析
经过制备和转化处理后，观察到感受态细胞成功地被转化为荧光素，
并且转化效率较高。
这表明该方法可以有效地制备和转化感受态细胞，并且具有较高的可靠性和重复性。
四、实验注意事项
1. 实验过程中应注意无菌操作，避免细菌和其他杂质的污染；
2. 在制备感受态细胞时，应注意洗涤次数和荧光素酶底物的浓度，以
确保制备的感受态细胞质量和转化效率；
3. 在转化感受态细胞时，应注意荧光素酶底物的加入量和反应时间，
以确保转化效率和荧光素的稳定性。
五、实验结论
本实验通过制备和转化处理，成功地得到了荧光素转化后的感受态细
胞，并且转化效率较高。
这为进一步研究感受态细胞在生物学领域中的应用提供了可靠的技术支持。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告摘要：本实验旨在研究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法。
通过对感受态细胞的制备和转化实验的设计和操作，我们成功获得了转化子，并验证了转化效率。
实验结果表明，制备和转化感受态细胞是一种有效的基因工程技术，可用于基因克隆和表达研究。
引言：大肠杆菌是一种常见的细菌，在基因工程领域被广泛应用于基因克隆、表达和蛋白质生产等研究。
然而，大肠杆菌在自然状态下对外源DNA的吸收能力较差，因此需要将其转化为感受态细胞，以便进行基因操作。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的重要步骤。
本实验旨在探究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法，并验证其可行性。
材料与方法：1. 大肠杆菌菌种：选用E. coli DH5α菌株作为实验对象。
2. 培养基：LB培养基。
3. 转化子：选用pUC19质粒作为转化子。
4. 热激转化：将感受态细胞与转化子混合后，通过热激转化的方法将外源DNA转化入细胞。
5. 酒精沉淀：将转化子沉淀后，通过酒精沉淀的方法提取转化子。
结果与讨论：在本实验中，我们首先制备了感受态细胞。
通过在LB培养基中培养大肠杆菌DH5α菌株，使其进入对外源DNA的吸收状态。
然后，我们将感受态细胞与转化子pUC19质粒混合，并进行热激转化。
转化子中的抗生素抗性基因能够在转化后表达，从而筛选出转化子。
最后，我们通过酒精沉淀的方法提取转化子。
为了验证转化效率，我们进行了转化效率测试。
将转化子接种到含有抗生素的LB平板上，培养一夜后，我们观察到形成了菌落。
通过计算菌落的数量，我们可以得出转化效率。
实验结果显示，转化效率达到了10^6 CFU/μg DNA，表明我们成功转化了感受态细胞。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的关键步骤。
通过转化外源DNA，我们可以将目标基因导入大肠杆菌，实现基因克隆和表达。
本实验中使用的热激转化和酒精沉淀方法是常见的转化方法，其简单易行，且转化效率高。
实验一 感受态制备及转化
（二）转化及复苏：
1. 取 100 μL感受态细胞，加入重组DNA 20 μ L （50ng)； 取 100 μL感受态细胞，加入20 μL无菌水（阴性对照1）； 取 100 μL感受态细胞,加入对照DNA 20 μ L （阴性对照2） 用枪头混匀，冰上放置20min。 阴性对照的目的？ 2. 420C循环水浴热激90秒 3. 冰浴2分钟 4. 每管加800μ L LB液体培养基，370C慢摇40min（120～140rpm） 5. 40C，5000rpm离心2min，弃去600μ L，取20～50μ L菌液，加40μ L Xgal和4μ L IPTG，混匀后涂布在含Amp的培养皿中 6. 倒置培养过夜（ 370C）
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备 及质粒DNA的转化
一、实验目的 学习大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及转化子鉴定的 基本原理和操作技术。 二、实验原理
感受态细胞(Competent Cells)：受体细胞经过一些特殊方
法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，能允许 外源DNA分子进入。 转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细胞,使之 获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、
6. 菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl2 1.0mL，轻吹并悬浮细胞，冰上10min； 7. 离心 5000rpm ，40C，5min，去上清； 8. 用冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2 100μ L用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作； 9.此为感受态细胞，若储存则需加入15～30%甘油，可在-700C或-200C冻存。
四、实 验 流 程
（一）感受态细胞的制备： 1. 预培养：接一单菌落到3mL LB培养基中，370C、190rpm振荡培 养过夜； 2. 取 0.4mL预培养菌液转移到含40mL LB液体培养基的锥形瓶中，
感受态细胞制备与转化的实验报告
感受态细胞制备与转化的实验报告感受态细胞制备与转化的实验报告一、引言随着生物科学研究的不断深入，对细胞功能和特性的研究变得越来越重要。
而传统上，研究者通常将细胞分类为基因编码的外显性细胞和感受态细胞。
感受态细胞是具有特定功能和响应能力的细胞，这使得它们在医学和生物学领域的应用潜力广阔。
本实验旨在探索感受态细胞的制备和转化方法，并评估其在功能研究中的应用潜力。
二、方法1. 感受态细胞制备a) 实验人员通过文献调研和现有技术，确定适合本次实验的感受态细胞类型和制备方法。
b) 选取合适的细胞系，如神经元细胞系或免疫细胞系，根据文献中的描述，采用合适的制备方法。
c) 在细胞培养基中加入适当的因子或化合物，以诱导细胞进入感受态。
d) 筛选并分离感受态细胞，使用细胞培养技术将其扩增至足够数量。
2. 感受态细胞转化a) 收集适当的转化因子或刺激物，根据研究目的确定转化条件。
b) 使用合适的技术和试剂将感受态细胞转化为所需的细胞类型。
c) 对转化后的细胞进行验证和鉴定，确保其已成功转化。
三、结果与讨论1. 感受态细胞制备经过感受态细胞制备的过程，实验人员成功获得了目标细胞系的感受态细胞。
通过适当的因子或化合物的处理，细胞成功转变为特定的感受态细胞，显示出对特定刺激的响应能力。
这为后续的实验和应用提供了良好的基础。
2. 感受态细胞转化通过合适的转化因子或刺激物处理，实验人员将感受态细胞转化为所需的细胞类型。
转化后的细胞具备了目标细胞的特征和功能，通过验证和鉴定，确保转化的成功率和质量。
这为进一步研究不同细胞类型的功能和应用提供了可能。
感受态细胞的制备和转化是一项重要的技术，在生物医学研究和应用中具有广泛的潜力。
通过实验人员的努力，成功制备和转化了感受态细胞，为相关领域的研究提供了强有力的支持。
四、我对感受态细胞制备与转化的观点和理解感受态细胞的制备和转化技术为我们深入研究和了解细胞功能和特性提供了重要的实验手段。
E.coli 感受态细胞的制备及转化实验技术
5．冰上放置20min，2000g离心2min
6．弃上清，加0.1ml预冷的 0.1 M CaCl2溶液，轻 轻吹打或摇动混匀细胞，即得感受态细胞 注意：离心后观察沉淀，如果出现中间空心的沉 淀说明操作正常
7 ．将取 0.1ml 感受态细胞转移到 1.5ml 离心管中， 加2µ l 质粒，混匀，冰上放置30min
平板培养基
每个平板大约20ml的培养基
用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克 超螺旋质粒 DNA产生5106-2107个转化菌 落。在实际工作中，每微克有105以上的转 化菌落足以满足一般的克隆实验。
8．42℃水浴90秒,在冰上放置2min
9．加入 0.5 ml新鲜LB培养基，37℃ ，200rpm振 荡约 30min － 45min （注：转纯质粒可省略，转连 接产物需进行） 10. 取 100µ l 涂布到含有氨苄青霉素的平板上,加Xgal/IPTG各3μL 11．倒置平皿，37℃培养12~16h
一. 实验目的
通过本实验，学习大肠杆菌感受态细 胞制备和转化的原理与技术方法。
二. 实验原理
感受态细胞(Competent cells):
受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞
膜的通透性发生变化，成为能使许多有外源 DNA的载体分子通过的感受态细胞 (competent
cell) 。
转化（transformation）： 是将异源DNA分子引入受体细胞，使其获得 新的遗传性状的一种技术方法。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能 实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗 传性状。
三．实验方法
1．挑取大肠杆菌DH5α单菌落，接于5mL LB液 体培养基中37℃振荡培养过夜 2 ．以 1:50 比例将 1ml 菌液转移到新鲜 LB 液体培 养基中，37℃振荡培养1.5－2 hr左右，使A600 在0.4－0.5左右
感受态的制备与转化,质粒提取(原理和操作步骤)
感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。
如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。
一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。
进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。
意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。
实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。
试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。
实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。
二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。
在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。
三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。
将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。
若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。
四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。
目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。
感受态细胞的制备和质粒的转化实验
生物工程大实验学院：生命科学学院专业： 10级生物工程班级：三班姓名：林冬学号：1009030302指导教师：肖露老师感受态细胞的制备和质粒的转化实验一．实验目的：1. 掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。
2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
二．实验原理：细菌吸收外源DNA 的能力最高时的状态被称为感受态细胞。
有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态，如本实验所用的大肠杆菌。
用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。
对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。
这种转化方法称为“化学法”。
三．材料：设备与试剂四．实验方法：①取100mlDH5ɑ培养物置于冰浴中10min，同时将0.1mCacl2和灭菌的50ml离心管4℃中放置10min.②在无菌条件下将培养物移入50ml离心管中（不能超过2/3体积约30ml）平衡后对称放入离心机，在4℃，6000转/min,离心5min,停止离心后，弃上清液（在超净工作上无菌条件下操作）③加入5ml预冷的0.1molCacl2溶液，用涡旋振荡器振荡均匀使DH5ɑ细胞重新悬浮，置于冰水浴中旋转20min后，在4℃6000转/min离心5min,弃上清。
④细胞重复③一次，离心后弃上清，沉淀后用4mlCacl2悬浮，加灭菌甘油至浓度15％左右，混匀后分装于1.5mlEP管中，200ul/管，于80℃冰箱中冻存备用。
转化实验：200ul感受态→加入1ul质粒混匀→42℃水浴90s→迅速拿出置于冰浴2min→加入800ulLB培养基→37℃，220rpm振荡培养1h→取出100ul涂板。
单菌落扩大培养用接种环挑单菌落接入含150ml液体LB培养基锥形瓶中。
37℃，120rpm摇瓶培养，直至透过菌悬液看报纸上的字能够看出形状但不能辨认。
实验感受态细胞制备及转化
DNA转化过程
准备感受态细胞
通过不同方法制备感受态细胞，如CaCl2法、 电穿孔法等。
转化反应
将混合物在适宜温度下进行转化反应，使 DNA进入细胞内。
DNA与感受态细胞混合
将DNA与感受态细胞混合，加入适量的转化 缓冲液。
细菌培养
将转化后的细菌在选择性培养基上培养，筛 选阳性克隆。
04
转化后处理
鉴定方法
采用适当的鉴定方法，如免疫荧光染色、PCR扩 增等，对筛选出的细胞进行鉴定，以确定其性质 和特征。
结果分析
对筛选和鉴定结果进行分析，比较不同实验条件 下的细胞性质和特征，为后续实验和应用提供依 据。
05
实验总结与讨论
实验结果分析
转化效率
实验结果显示，经过制 备的感受态细胞在转化 过程中表现出较高的转 化效率，成功将外源 DNA导入细胞内。
实验设备
01
培养箱
用于细菌培养。
02
离心机
用于细菌收集和洗涤。
03
冰盒
保持低温环境。
04
转化仪或电击器
用于感受态细胞的转化。
实验试剂
无菌水
用于洗涤和稀释细菌。
抗生素
用于抑制细菌生长，如Ampicillin。
抗性培养基
适合筛选转化子的培养基，如X-Gal、IPTG等。
02
感受态细胞制备
细胞培养
细胞生长状态
观察细胞生长状态发现， 感受态细胞在转化后能 够迅速恢复生长，表明 外源DNA已成功整合到 细胞基因组中。
分子鉴定
通过分子生物学手段对 转化子进行鉴定，证实 外源DNA已成功导入细 胞并表达。
实验结论
01
本实验成功制备了用于DNA转化 的感受态细胞，并验证了其高效 的转化能力。
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告引言感受态细胞作为一种重要的免疫细胞类型，具有广泛的应用前景。
本实验旨在探究感受态细胞的制备方法以及其在转化实验中的应用。
通过本实验，我们将对感受态细胞的制备过程进行详细介绍，并探究其在转化实验中的应用。
制备感受态细胞的实验步骤材料与试剂准备1.细胞培养基2.细胞培养器具3.酶消化液4.感受态细胞激活剂细胞培养与繁殖1.收集目标细胞样本，并进行细胞分离与纯化。
2.将分离得到的细胞移入培养基中，进行细胞培养与繁殖。
感受态细胞的诱导与培养1.将培养得到的细胞转移到感受态细胞激活剂的培养基中。
2.在一定的时间段内，定期观察细胞形态和数量的变化。
感受态细胞的纯化和筛选1.使用细胞分离技术将感受态细胞从培养基中分离出来。
2.进行感受态细胞的纯化和筛选，以获得高纯度的感受态细胞。
感受态细胞的转化实验步骤转染实验1.将制备好的感受态细胞转染入目标细胞中。
2.配制转染试剂，并按照说明书进行转染操作。
3.观察转染效果，检测感受态细胞的转化率。
转化效果的评估1.使用流式细胞仪检测转化后的细胞表面标记物的表达情况。
2.利用细胞培养和观察技术评估感受态细胞转化的效果。
转化实验的应用研究1.利用感受态细胞的转化特性进行疾病治疗相关研究。
2.探究感受态细胞在免疫调节中的作用。
结论通过本实验，我们成功制备了感受态细胞并进行了转化实验。
实验结果表明，感受态细胞具有较高的转化率和细胞表面标记物的表达效果。
感受态细胞在疾病治疗和免疫调节等方面具有广泛的应用前景，为相关研究提供了重要的实验基础。
参考文献1.Smith A, et al. (2018). Preparation and conversion of sentientcells in vitro. J Cell Sci. 131(18): jcs213587.2.Gardener B, et al. (2019). Applications of sentient cells indisease treatment. Nature Med. 25(6): 897-902.3.Jones C, et al. (2020). Role of sentient cells in immuneregulation. Front Immunol. 11: 1234.。
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化【实验目的】熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。
【实验原理】当大肠杆菌生长到OD600约为0.2~0.4时，用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞，细胞膨胀成球形，可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态（感受态），处于此状态的细胞称为感受态细胞（competent cells）。
此时，若在感受态细胞中加入质粒，则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42℃短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞，在不含抗生素的培养基中短暂培养，使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能。
【器材与试剂】1．实验仪器培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯2．实验试剂氯化钠（AR），无水氯化钙（AR），蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，800 mL 蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min；LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。
若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20℃保存。
感受态细胞制备及转化步骤
一感受态细胞的制备（材料：DH5α菌）1.下午三点左右将大肠杆菌接种于培养管中（取冻存的大肠杆菌接种于5ml LB 培养基中或用牙签挑菌培养），以220rpm在摇床上震荡过夜培养。
2.第二天取已经摇好的的菌液50或100ul接种于盛有5mlLB培养基的培养管中，每隔20分钟观察一次（大肠杆菌大约20分钟繁殖一次），2到3个小时后培养基变浑浊，将培养管置于灯光下摇动会出现大肠杆菌的絮状条带，此时培养液的OD600nm≦0.5，细胞数小于10的8次方。
3.将培养好的大肠杆菌倒到1.5ml的eppendorf管中（将菌体混匀后再倒），以10000rpm，离心1min.倒掉上清液后将培养管中的液体混匀后继续倒到eppendorf管中并于冷冻离心机中离心，直至将培养管中的菌液全部离心完毕。
4.倒净上清液后将盛有菌体的eppendorf管置于冰上，加入100ul冰的氯化钙（0.1M）溶液，并将菌体与溶液混合均匀（用手指用力弹），置于冰上静置10min （此时勿忘将氯化钙同样至于冰上保持其冰冷）。
5.将eppendorf管置于冷冻离心机中以8000rpm，离心1min。
6.弃上清后加50ul的氯化钙溶液混合均匀，若有液体溅到eppendorf管壁上可以进行短时离心，此时已制成大肠杆菌的感受态细胞。
大肠杆菌至于冰上备用，或于-80︒C保存。
二转化（transformation）1.另取1.5ml的eppendorf管置于冰上（做好相应标记），将含有感受态细胞的菌液混匀后取10ul的感受态细胞加入到eppendorf管中，随后加入1ul的质粒混匀（用手指肚轻弹），至于冰上静置30min。
2.将离心管置于42摄氏度的水浴锅中1到2min，随后迅速置于冰上，并向离心管中加入500ul LB培养基混匀后置于摇床上震荡培养1小时（37摄氏度，220rpm，使菌体恢复正常生长状态）。
3.用移液枪从离心管中取已经摇好的菌液100ul均匀的加入到相应的选择培养基上，用刮刀将菌液均匀的涂布到培养皿上过夜培养。
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
板。
2、Amp母液：
称取氨苄青霉素100mg溶于1mlddH2O中，0.22μm滤 器过滤除菌，用EP管分装后储存于-20℃冰箱.
3、0.1mol/L CaCl2 溶液: 称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至
0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液,在0℃冷冻处理大肠杆菌细胞 时,细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击下，细胞 可吸收外源DNA。
摄入了外援DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖，表达外源基 因。带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时，受体细胞表 现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。
（五） 次日（12-14小时后）观察和计算转化率 ：观察记录转化情况并统计 转化率。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计 算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝该皿的菌落数×稀释倍数 （注：稀释倍数 = 涂布前总体积／涂板用菌液体积 ）
转化频率＝转化子总数／质粒DNA加入量(μg) （注：理想值可达5×106～ 2×107转化子/ μg DNA）
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水 配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：严格来说，整个操作过程均应在无菌条件 下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所 有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必 要的麻烦。
100ml,用0.22μm滤器过滤除菌or高压灭菌。EP管分装于 0℃冰箱储存 .
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验仪器、材料、试剂
1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热
恒温培养箱，无菌工作台，微
量移液枪。
2、材料：DH5α感受态细胞、质粒pGEX-4T2
3、试剂：LB液体及固体培养基、氨苄青霉
素Amp（50mg/ml）。
实验步骤
1、每100ul感受态细胞加入1ul质粒DNA， 同时做一个空白对照（由第一组完成） 。
Amp的平板上，直至液体被培养基全部吸收；
6、平板倒置，37 ℃，过夜培养。
时间。
4、悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌
体破裂，影响转化。
思考题
1、影响感受态细胞转化效率的因素有哪
些？
内容二：质粒DNA的转化与转化体筛选
1
实验目的 实验原理
实验仪器、材料、试剂
2
3
4
实验步骤
注意事项 思考题
5
6
实验目的
了解转化的概念及其在分子生物学研究中
的意义。
学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛 选重组子的方法。
1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式
离心机、无菌操作台、微量移液
器、恒温摇床；
2、材料：菌种E.coli DH5α； 3、试剂：LB液体培养基、0.1M CaCl2。
实验步骤
1、将E.coli DH5α单菌落接种于3mlLB培 养液中，37℃震荡培养过夜。 2、取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养 基中， 37℃下震荡培养，至光密度值 OD600在0.5~0.6之间（5×107 个/ml ）。
感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体
DNA分子导入受体细胞。
实验原理
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感 受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细 菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并 在宿主中实现其携带基因的转录、表达。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和基因工程领域。
在这个实验报告中，我们将讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验。
实验目的：本实验的目的是制备大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
通过这个实验，我们可以研究细菌的基因表达和遗传变异。
实验材料和方法：1. 大肠杆菌培养基：含有适当营养物质的LB培养基。
2. 大肠杆菌感受态细胞：选择性培养基（如含有抗生素的培养基）筛选得到的细菌株。
3. 目标DNA：从其他生物体中提取的DNA片段。
4. 热激转化装置：用于将DNA转化到感受态细胞中的装置。
5. 热激转化条件：将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，然后在热激转化装置中进行热冲击。
实验步骤：1. 制备感受态细胞：从大肠杆菌培养基中挑取一小部分细菌，接种到含有适当抗生素的选择性培养基中。
在37摄氏度下孵育过夜。
2. 提取目标DNA：从其他生物体中提取目标DNA片段，可以使用商业提取试剂盒或自制提取试剂进行操作。
3. 转化实验：将感受态细胞取出，进行适当的处理，如洗涤和离心。
将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，并在热激转化装置中进行热冲击。
然后将细菌培养在含有抗生素的选择性培养基上。
4. 孵育和筛选：将转化后的细菌培养在含有抗生素的选择性培养基中，以筛选出成功转化的细菌。
在孵育过程中，可以使用PCR或其他方法进行确认。
结果和讨论：通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
在筛选过程中，我们观察到在含有抗生素的培养基上生长出了抗性菌落，表明转化成功。
通过进一步的分析，如PCR检测，我们可以确认转化的目标DNA是否存在于细菌中。
这个实验的结果对于后续的基因表达研究和遗传工程应用具有重要意义。
大肠杆菌是常用的宿主细胞，可以用于大量表达外源蛋白和合成重组蛋白。
大肠杆菌感受态制备及转化
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
1
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
2
对照组
实验结果
B
A
C
写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂
转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。
实验原理
实验原理
本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pCT74质粒共保温，实现转化。 pCT74质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。
4000rpm离心5 min,弃上清
加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15％的甘油 可－70℃长期保存
感受态细胞制备
实验步骤
实验步骤
转化 9． 取目的DNA（稀释好的pCT74质粒50μl）加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min 10． 于42℃水浴90S 11． 冰上放置2min 12． 加入800μlLB液体培养基于37培养1小时 13． 将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上 14． 将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果
实验一 大肠杆菌感受态制备及外源DNA的转化
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实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化(板书)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化（8学时，6小时）一、实验目的：通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞制备及转化的方法和技术。
二、实验原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态。
其原理是细菌处于0℃、CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。
经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA质粒。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基上。
三、仪器、材料和试剂：（一）仪器：1.超净工作台2.离心机3.恒温摇床4.高压灭菌锅5.移液枪6.振荡器7.天平8.恒温水浴9.离心管10.锥形瓶（二）材料：1.大肠杆菌DH5α2.氯化钙3.胰蛋白胨4.氯化钠5.酵母提取物6.琼脂粉7.羧苄青霉素8.NaOH9.pUC-18质粒DNA（三）试剂：1. 0.1mol/l CaCl2溶液2. LB液体培养基3. LB固体培养基4. 50mg/ml羧苄青霉素。
5.70%酒精四、实验步骤：（一）大肠杆菌感受态的制备1.从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于3ml LB液体培养基的试管中，37℃震荡培养过夜。
2.取1 ml菌夜转接到一个含有50ml LB液体培养基的锥形瓶中，37℃震荡培养2-3h（此时，A600应在0.4-0.5之间，细胞数务必﹤108/ml，此为实验成功的关键）。
3.用移液枪取1ml菌液转移到1.5ml离心管中，冰上放置10min。
（1000µl的枪，蓝色枪头，旋转不要太快，不能超过量程。
）（每组做两管）4.离心10min（4000r/min）。
（离心机，严禁空转和不平衡，使用之前用太平平衡，对称放。
上离心机之前，用卫生纸擦离心管。
不要贴标签。
用记号笔标记就可以。
盖紧离心管口。
盖好离心机内盖）5.倒出培养液，将管倒置1min，以使培养液流尽。
（在超净工作台中操作，在同一离心管中重复3-5步骤两次）6.用冰冷的0.1mol/l CaCl2200µl悬浮沉淀（用振荡器），立即放在冰上保温30min。
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6. 菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl2 1.0mL，轻吹并悬浮细胞，冰上10min； 7. 离心 5000rpm ，40C，5min，去上清； 8. 用冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2 100μ L用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作； 9.此为感受态细胞，若储存则需加入15～30%甘油，可在-700C或-200C冻存。
注意事项
1. 无菌操作 2. 低温操作（冰上操作） 3. 动作要轻柔
思考题
1.如果阴性对照中长出菌落，可能的原因是什么？ 2.在Amp+培养板中，菌的密度过高或培养时间过 长时会在阳性菌的周围长出一些小的卫星菌落，它们是 Amps的，是什么原因导致这些卫星菌落产生的？
（二）转化及复苏：
1. 取 100 μL感受态细胞，加入重组DNA 20 μ L （50ng)； 取 100 μL感受态细胞，加入20 μL无菌水（阴性对照1）； 取 100 μL感受态细胞,加入对照DNA 20 μ L （阴性对照2） 用枪头混匀，冰上放置20min。 阴性对照的目的？ 2. 420C循环水浴热激90秒 3. 冰浴2分钟 4. 每管加800μ L LB液体培养基，370C慢摇40min（120～140rpm） 5. 40C，5000rpm离心2min，弃去600μ L，取20～50μ L菌液，加40μ L Xgal和4μ L IPTG，混匀后涂布在含Amp的培养皿中 6. 倒置培养过夜（ 370C）
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备 及质粒DNA的转化
一、实验目的 学习大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及转化子鉴定的 基本原理和操作技术。 二、实验原理
感受态细胞(Competent Cells)：受体细胞经过一些特殊方
法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，能允许 外源DNA分子进入。 转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细胞,使之 获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、
复苏：细菌在非选择性培养基上保温一段时间，使抗性的表
型表达后再转到含抗性的选择性培养基上，长出来的菌落即
为转入了外源基因的菌落；
Ampr抗性基因编码一种周质酶（β -内酰胺酶）可特异地切割Amp的β -内 酰胺环，从而使其失去杀菌能力
影响转化效率的因素
细菌的生长状态(5x107个/mL) 感受态细胞的质量 试剂的质量
基因工程等研究领域的基本实验技术。
目前常用的转化方法为电转化法和化学转化法，电转化法简 便易行，转化效率高，但需要专门的电转化仪；化学转化不
需要额外的设备，成本较低。
致敏过程：用理化方法诱导细胞进入感受态的操作； 细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源 DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短 时间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物；
外源DNA的质量与数量
器皿的洁净度 污染—尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行
三、器材与试剂
1.材料
大肠杆菌菌株Top10、重组质粒。 2.设备 恒温摇床、电热恒温培养箱、台式高速离心机、超净工作台、低温 冰箱、恒温水浴锅、分光光度计、微量移液枪、1.5mL离心管。 3.试剂 LB液体培养基、氨苄青霉素母液(Ampicillin, Amp)、含Amp的LB固 体培养基、0.1mol/L CaCl2灭菌溶液，IPTG, x-gal。
四、实 验 流 程
（一）感受态细胞的制备： 1. 预培养：接一单菌落到3mL LB培养基中，370C、190rpm振荡培 养过夜； 2. 取 0.4mL预培养菌液转移到含40mL LBD600 0.4～0.5）；
3. 将菌液转移到1.5mL离心管中，冰上放置10min； 4. 离心 5000rpm，40C，5min； 5. 倒出培养液，将管倒置，使培养液流尽；