无菌、微生物限度、细菌内毒素方法学验证
[医药]细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定
摘要:本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。
关键词:细菌内毒素检查、方法、验证细菌内毒素检查法作为控制药品质量的一种有效方法,已经广泛的被世界各国药典收载。
经过30多年的不断改进,无论是凝胶法还是光度法均比较成熟和完善。
但是,在为新化合物或新药建立细菌内毒素检查方法时,常常会遇到各种各样的困难,尤其是尚处于新药研发早期阶段的药物,由于药物制剂、赋形剂等还不稳定,经常会发生变化,这样就给方法的建立带来不同程度的影响。
在建立细菌内毒素检查法之前,应尽可能多的收集有关该药品的基本信息,例如:有关样品的溶解性信息,推荐的稀释液,在水中的溶解度,以及最适溶剂;样品的pH范围;分子量大小;产品规格、体积或重量;拟用于临床的用法和用量等等。
以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法,对于早期研发阶段的药物,应选择合适的赋形剂,以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。
此外,在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量,为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。
关键词:细菌内毒素方法建立几个内毒素检查一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时,首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径,计算和确定样品的内毒素限值,选择合适的鲎试剂,根据临床规格,计算最大有效稀释倍数,稀释产品,并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。
可以采用凝胶法,也可以采用终点法或动态法。
当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法为准。
1、细菌内毒素限值的确定一个药品在投放市场前,它是否满足内毒素限值的要求?样品的内毒素含量具体是多少?这些问题不但关注用药安全,还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息,为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。
尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程,但其最终目的还是要为控制药品质量服务。
因此,在方法建立时,不但要阐明限值的合理性,考虑技术可能达到的限值,同时还要满足相关药品管理法规的要求。
注射剂研发的基本流程细则
注射液研发的流程一、试验前期资料信息的收集1、初步调查品种的基本情况,包括品种的市场份额、销量,药物研究历史等安全有效的信息,有无专利和保护信息、技术壁垒等。
2、综合评估撰写项目可行性分析报告,包括产品基本信息,立项目的与依据,有无知识产权和药政保护,产品的特点及试验难易程度、设备是否齐备、国家政策风险等,有无技术壁垒,产品优劣势,经费预算与市场回报。
3、是否有合法原料提供,及价格如果只是进行制剂的仿制研究,必须提供原料药的合法证明;对于仿制原料的话,必须对药物的合成工艺打通,优化中试生产,质量合格,杂质种类和数量不高于上市品,必须与制剂一同申报。
4、了解临床资料、不良反应资料及产品说明书等相关资料5、了解国内及进口制剂剂型及规格全面掌握拟仿制药物的国内外上市情况,包括上市的剂型、规格、厂家等。
6、产品质量标准查阅产品相关的国内标准(药典标准和国内首仿标准)和进口标准,并试着草拟自己的标准。
7、工艺研究资料查阅参考文献(CNKI、博硕论文、维普、专利),查阅其合成工艺或制剂工艺,或查找相同剂型的工艺研究资料,对其分析汇总,撰写自己的初步研究方案。
8、专利、国家政策及生产注册情况查询专利、国家政策及生产注册情况,以保证产品研究能够顺利报批。
二、试验用物品的采购1、原料的采购如果只是申请制剂的仿制,必须提供原料的合法来源及其证明文件,必须选择国内外合法的厂商进行原料的购买,购买时需要厂家提供原料药的批准证明文件,药品标准,检验报告,原料药生产企业的营业执照,药品生产许可证,药品生产质量管理规范认证证书,购销发票,供货协议等复印件,并要注意原料的种类,是注射级别的还是口服级别的,原料的包装规格,原料标准是药典标准还是注册标准,原料的采购量是否充足,价格如何等。
2、辅料和包材的购买要保证辅料和包材的合法来源,通过对仿制药处方及剂型的分析,粗略知道所用辅料和包装材料的种类和用量,已有的材料不需购买,没有的在国家批准的厂家购买辅料和包材,并需要厂家提供辅料和包材的厂家资质(生产许可证和营业执照,GMP 证书),药品包装材料和容器注册证,发票,检验报告,标准,购销合同等的复印件。
无菌、内毒素检查法验证讲义1
无菌、内毒素检查法验证讲义1凝胶法和终点法采用单一的时间点采集结果数据,决定反应在规定的时间内是否达到预定的水平。
而动态法则是在适当的检测波长下监测整个反应过程的数据。
内毒素的浓度决定了蛋白凝胶形成的速率,因此,通过测量达到设定光密度的时间,确定光密度随时间的改变情况,以建立光密度变化的速率与参照内毒素之间的线性关系。
终点法中人为的加入反应终止剂,并且在此时间点读取和记录样品和标准曲线点的光密度,其缺点是:必须人为的终止反应,标准曲线的范围有限,仅为一个Log。
而在动态法中光度检测仪连续的读取光密度的变化,动态监测光密度的变化,记录达到设定的光密度所需要的时间。
动态法以将已知的标准内毒素浓度的对数与最终反应时间的对数作图,因此,测定范围可跨越4-5个Log(一般为0.005-50EU/ml),克服了终点法的缺点。
动态比浊法:凝胶的浊度形成是凝胶形成的前提,因此,在这个意义上浊度法其实是凝胶法的延伸。
进行浊度法的鲎试剂含有凝固蛋白原的量足以在凝固酶的作用下形成浊度,但不足以形成凝胶。
浊度法克服了凝胶法只能检测某一个限值水平的缺点,可以定量一定范围内的内毒素含量。
现在细菌内毒素定量法的使用率在国外已超过凝胶法,大约占65%~70%,并且还在逐年上升。
细菌内毒素检查方法的建立方法标准物质限值的确定干扰试验检验一、方法细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法凝胶法为限量测定方法,光度测定法为定量测定方法凝胶法分为限量试验和半定量试验;光度测定法包括动态浊度法、终点浊度法、动态显色法和终点显色法两种方法可任选一种进行内毒素的检测当测定结果有争议时,除有特殊规定外,以凝胶法结果为准二、标准物质除另有规定外,细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作对照品应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品三、限值的确定 1、计算公式L=K/M 药品人用最大剂量参考《国家药品标准化学药品说明书内容汇编》。
中国人均体重按60kg计算;人均体表面积按1.55m2计算。
药品生物检定技术简介
门冬酰胺酶(抗肿瘤药) Ch.P(2005)二部 本品系自埃希大肠杆菌(E.coli ASI.357)
或欧文菌(Er-winia casotovora)中提取制备的 具有酰氨基水解作用的酶。
肝素钠(抗凝血药) Ch.P(2005)二部 本品系自猪或牛的肠黏膜中提取的硫酸氨
基葡聚糖的钠盐,属黏多糖类物质。
小包装容器的数量。
例:2支(瓶)/2板×12粒
检查量:指一次试验所用供试品的总量
(g 或 ML)
例: 2×10=20ML
24×0.25=6g
2、对照试验: 阳性对照
阴性对照
9
3、检查方法:
a、薄膜过滤法:应用广、准确性高,适用 于任何药品、尤其是具有抑菌作用的
。
b、直接接种法:操作简便,适用于无 抑菌 作用的供试品。
中文名称
英文名或缩写
适应症
重组人干扰素a1b
rhuIFNaIb
上皮生长因子
(EGF)
粒细胞集落刺激因子
(GCSF)
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)
红细胞生成素
(EPO)
溶栓药物链激酶
(SK)
重组人胰岛素
Humulin
Novolin
Humalog
白细胞介素-2
rhuIL-2
治疗病毒性角膜炎 烧伤或创伤治疗外用药物
细胞因子类(重组人干扰素)
生长因子类(重组人表皮生长因子)
激素类(重组人胰岛素)
酶类(重组链激酶)
疫苗(重组乙型肝炎疫苗)
单克隆抗体
37
重组DNA技术
38
国外重组DNA制品
中文名称
英文名或缩写
适应症
胰岛素
方法学验证(微生物内毒素)试卷
答卷人部门得分工号考试日期:年月日本试卷得分在60分(含)以上为合格,否则为不合格。
一.选择题(每题4分,共20分)1、细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准,用于凝胶法时,其内毒素含量小于:。
( )A、0.010EU/mlB、0.005EU/mlC、0.015EU/mlD、0.020EU/ml2、耐热器皿常用去除可能存在的外源性内毒素。
( )A、干热灭菌法(160℃、30分钟以上)B、干热灭菌法(250℃、30分钟以上)C、干热灭菌法(170℃、30分钟以上)D、干热灭菌法(250℃、15分钟)3、细菌内毒素的成分是。
(B)A、H抗原B、脂多糖C、肽聚糖D、荚膜多糖4、供试品溶液本身为强酸、强碱,或本身具有偏酸偏碱的缓冲作用时,排出干扰的方法为:( )A、将供试品的pH值调节至6.0~8.0B、添加适量钙离子、镁离子C、将供试品适当加热D、选择适当的超滤设备进行滤除5、细菌内毒素检查法主要依靠细菌内毒素可以活化,来检测细菌内毒素。
( )A、凝固蛋白原B、凝固酶原C、B因子D、C因子二、多选题(每题4分,共20分)1、无菌药品附录中规定,必要时,物料的质量标准中应当包括:检查项目。
( )A、微生物限度B、细菌内毒素C、热原D、培养基的外观2、细菌内毒素的活性单位的表达方式包括:。
( )A、EUB、IUC、IED、L3、细菌内毒素检查时常见的干扰因素包括:。
( )A、含有螯合剂B、含有某些抗凝因子C、含有葡聚糖类物质D、含有干扰作用的小分子4、对于存在内毒素污染的物质或器具,则可以选择下述方法去除:。
( )A、加热法B、酸碱法C、蒸馏法D、吸附法5、热原污染的途径。
( )A、注射用水B、从原辅料中带入C、从容器、用具、管道和装置等带入D、制备过程中的污染三.判断题(每空5分,共20分)1. 平皿法操作时应先注入培养基,再加入1ml供试液。
()2. 制备的菌液若在室温下放置,应在2小时内使用,若保存在2-8℃可在24小时内使用()3. 培基适用性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较,以阳性菌的生长状态或特征来评价判断检验用培养基是否符合检验要求。
微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题
微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题
钟长鸣;陈希;吴燕红
【期刊名称】《中国药品标准》
【年(卷),期】2011(12)1
【摘要】@@ 有些药品由于其自身杀菌和抑菌作用,在微生物限度和无菌检查时就有可能出现假阴性结果,为使检查结果真实可靠则必须消除其自身杀菌和抑菌作用.消除药品自身杀菌和抑菌作用的方法有:培养基稀释、离心沉淀集菌、薄膜过滤、中和等方法.寻找一种恰当的能消除药品其自身杀菌和抑菌作用的方法是其方法验证的内容.我所在开展方法验证工作中发现存在一些问题.
【总页数】2页(P12-13)
【作者】钟长鸣;陈希;吴燕红
【作者单位】江西省食品药品检验所,南昌,330029;江西省食品药品检验所,南昌,330029;江西省食品药品检验所,南昌,330029
【正文语种】中文
【中图分类】R927
【相关文献】
1.对替硝唑注射液无菌检查方法验证中不同厂家集菌器使用问题的探讨 [J], 凌真;陈莹洁;丁莉
2.无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析 [J], 国明;祝清芬;郑力真
3.加强药品无菌检查和微生物限度检查方法验证的对策 [J], 赵建英;寿文虹;李爱玲
4.无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析 [J], 李红
5.微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题 [J], 郭焕君
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无菌检查方法验证
无菌检查方法验证:取本品,分别加灭菌注射用水 1ml 溶解,采用薄膜过滤法依法检查(中国药典 2022 年版二部附录Ⅺ H ),应符合规定。
菌液制备: 10 倍稀释法培养基 营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基硫乙醇酸盐培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂斜面 培养基菌悬液制备计数结果菌种 代数 稀释级 菌落数(cfu/ml )枯草芽孢杆菌 4 10-6 61金黄色葡萄球菌 4 10-7 89大肠埃希菌 4 10-6 78生孢梭菌 4 10-6 67白色念珠菌 4 10-7 83黑曲霉菌 4 10-4 401、供试品处理将供试品去掉铝塑盖,外表面用75%酒精全面消毒,然后向每支样品中注 入 1.0ml0.1%的蛋白胨灭菌溶液,备用。
2、检查阳性对照: 将等量的试验菌直接加入到液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液 体培养基管中,在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在 30-35℃下培菌种枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大肠埃希菌 CMCC(B)44102生孢梭菌 CMCC(B)64941白色念珠菌 CMCC(F)98001黑曲霉菌 CMCC(F)98003菌悬液制备用 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌少于 100cfu (菌落行程单 位)的菌悬液加入 5ml0.9%无菌氯化钠溶液,将 孢子洗脱,再同上制成每 ml 含菌 小于 100cfu 的菌悬液养;改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
阴性对照:将灭菌的液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液体培养基管直接放在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养;改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
样品 (薄膜过滤法):每种实验菌取10 支处理好的供试品溶液,将溶液合并后加入制备好的菌悬液1ml,用0.1%的蛋白胨灭菌溶液稀释至100ml,按薄膜过滤法过滤,取出滤膜,将其分为3 等份,分别置于含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中,其中一份作为阳性对照用。
无菌、微生物限度检查及方法验证
01
02
03
直接接种法
将样品接种在培养基上, 观察是否有微生物生长。
薄膜过滤法
将样品通过薄膜过滤,收 集滤膜上的微生物,再进 行培养。
离心沉淀法
将样品离心,收集沉淀物 中的微生物,再进行培养 。
无菌检查的注意事项
确保环境洁净
无菌检查需要在洁净的环境中进行,以避免 外界微生物的污染。
避免样品中防腐剂的影响
方法验证
方法验证的定义与目的
定义
方法验证是对检测方法的可靠性、准确性和可重复性的评估过程,以确保该方 法能够满足预期的检测要求。
目的
方法验证的目的是确保所采用的无菌、微生物限度检查方法具有足够的灵敏度 、特异性、重现性和可操作性,以保证检测结果的准确性和可靠性。
方法验证的流程
准备验证计划
制定详细的验证计划,包括验 证实验的设计、实验步骤、数 据收集和分析等内容。
进出口检验
进出口药品需要进行严格的微生物限度检查,以确保药品符合进口 国或地区的质量标准,保障公众健康。
方法验证在药品质量控制中的应用
验证无菌、微生物限度检查方法的可靠性
通过方法验证可以确保无菌、微生物限度检查方法的准确性和可靠性,提高药品质量控制 水平。
评估检测方法的性能指标
方法验证过程中需要对检测方法的性能指标进行评估,如灵敏度、特异性、重现性等,以 确保检测结果的准确性和可靠性。
如果样品中含有防腐剂,可能会抑制微生物 的生长,因此需要进行相应的处理。
正确选择培养基
根据待测样品的特性,选择适合的培养基, 以确保微生物能够正常生长。
定期进行方法验证
无菌检查方法需要定期进行验证,以确保其 可靠性。
0义与目的
微生物检验项目
微生物检测项目
食品/农产品/保健品:菌落总数、霉菌、酵母菌、大肠菌群、沙门氏菌、单核增生李斯特氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、商业无菌等
水质(饮用水/泳池水/纯化水等):细菌总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌等
一次性卫生用品:微生物指标、抗菌性能、抑菌性能、杀菌性能等
原辅料及药品:微生物限度检查(大肠埃希菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠菌群及梭菌)及方法学验证、细菌内毒素检测、无菌检查及方法适用性验证、培养基适用性检查及灵敏度验证
医疗器械/设备:初始污染菌、无菌检查及方法适用性验证、培养基适用性检查及灵敏度验、生物负荷试验等
日化洗涤产品:微生物指标、抗菌性能、抑菌性能、杀菌性能等
抗菌制品/材料:抗菌检测(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等)、防霉检测
生物肥料:有效活菌数(地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、固氮菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌等)
公共用品用具:细菌总数、大肠菌群、致病菌等
集中空调通风系统:军团菌、β-溶血性链球菌、细菌总数、真菌总数等
消毒产品:(消毒剂/抗抑菌剂/消毒器械)微生物指标、微生物杀灭试验、微生物抑菌试验、现场试验、模拟现场试验等。
盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液无菌检查方法学验证
盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液无菌检查方法学验证作者:吴羽岚嵇海澄来源:《中国医药科学》2013年第13期[摘要] 目的对盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液的无菌检查方法进行探讨,建立其无菌检查方法。
方法按《中国药典》(2010年版)附录ⅪH无菌检查方法进行。
结果在验证条件下,该方法能消除对微生物生长的抑制作用。
结论可以采用此法对本品的无菌进行检查。
[关键词] 盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液;无菌检查方法;薄膜过滤法[中图分类号] R-331 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616(2013)13-95-02Study of sterile examination method of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection WU Yulan JI HaichengJiangsu Hansoh Pharmaceutical Co.Ltd.,Lianyungang 222000,China[Abstract] Objective To discuss and establish the sterile examination method of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection. Methods The test were done according to appendix XIH-sterile examination method in"Chinese Pharmacopeia"(2010 edition). Results The method could eliminate the inhibition of microbe growth under the validation condition. Conclusion This method can be used for the sterile examination of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection.[Key words] Levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection;Sterile examination method;Membrane-filter procedure盐酸左氧氟沙星(Levofloxacin Hydrochloride)化学名称:(S)-9-氟-2,3-二氢-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-7H-吡啶并[1,2,3-de]-[1,4]苯并嗪-6-羧酸盐酸盐的水合物,属第三代喹诺酮类抗菌药。
中国药典无菌、微生物限度与细菌内毒素检查方法学验证内容详解
国家药典委员会
中国药品生物制品检定所
二00五年十月十一日
● 验证的目的: 验证所采用的方法和条件是否适合 于供试品的无菌检查。 即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌 活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。 ● 验证的意义:保证检验结果的准确、可靠及检 验方法的完整性。
二、无菌检查验证的关键点
中检所和药典会多次召开会议肯定工作的成绩、 研讨存在的问题,希望各级领导能给予高度重 视,从各方面支持这项工作长期持续发展。 实际工作中,药品生产、研发企业和各级药检 所在工作中都存在很多困难和问题。
关于执行《中国药典》2005年版微生物限度 检查法和无菌检查法有关问题的说明
国药典发[2005]98号
验证的目的是为了确认试验中供试品应选择药 典中所收载的何种供试液制备方法、何种测定
方法及确定的检测系统是否适用于该供 试品的检验,即只有通过方法验证,才 能确定供试品的检验条件和方法,保证 “微生物限度检查”或“无菌检查”方法的 科学性和检验结果的准确性。
2.不同企业生产的相同品种,特别是中 成药,因原料来源、工艺、辅料的不同, 药品可能表现出不同的抑菌特性;同一个 企业生产的相同品种,因原料来源不同、 工艺改变或不同实验室等原因,也可能导 致检测结果的差异。因此,不同企业生产 的相同品种进行“微生物限度检查”或“无菌 检查”时,其具体试验方法如冲洗量等不 能简单照搬,需通过验证试验核实该试验 方法和检测系统是否适宜。
生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941]
白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001]
黑曲霉 (Asperglllus niger) [CMCC(F) 98 003]
无菌、微生物限度检查及方法验证
此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法,仅能用于工作用菌种的短期保藏。
8
琼脂斜面低温保藏法保藏法(厂家常用)
保藏芽胞液对
产芽胞的微生物宜制成芽胞菌悬液后再保藏, 无菌操作,取1ml孢子液接入茄形瓶或培养皿内,轻轻转动使菌液均匀分布于培养基表面。 将培养皿在适当的温度下培养。一般需要7天或更长时间 在层流台下,取3~5ml氯化钠磷酸盐缓冲液(pH7.0)加入培养皿内 用无菌玻璃L棒轻轻刮下菌苔,注意不要划破培养基。 用无菌注射器或无菌吸管吸取菌悬液,收集于试管中。 将收集的芽胞液放在80~90℃水浴中加热15分钟,冷却。 做好标记,放至2~8℃冰箱中保藏。原始芽胞液可保存1年。 每次使用前用平皿法重新标定其浓度。
微生物实验室的质量管理
设施—洁净室、净化工作台、生物安全柜。 设备—高压蒸汽灭菌器、电热恒温干烤箱、培养箱、冰箱。 实验仪器—全封闭薄膜过滤装置、电动匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心机、显微镜,及刻度吸管、试管、三角烧瓶、培养皿等。 建立主要设施、设备、仪器的明细记录,内容包括名称、型号、生产厂家、购买日期。 质量保证档案:购买发票、安装验收或开箱验收记录、调试记录、计量检定或运行校验合格证、指定专人负责、制订标准操作规程(SOP)、建立使用登记册,维修、保养记录、改造或更新记录、直至报废记录。
记录温湿度是否在规定的范围内,每次实验时,对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数并记录;如发现问题应找原因,及时报修和报告并将报修原因和结果记录归档。如遇停电,应立即停止实验,重新进入无菌室前,至少开启机房运转1小时以上。
实验室使用管理
微生物实验室的质量管理
平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动,通向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。
枯草芽孢杆菌 [CMCC(B)63501] 金黄色葡萄球菌 [CMCC(B)26003] 生孢梭菌 [CMCC(B)64941] 铜绿假单胞菌 [CMCC(B)10104] 大肠埃希菌 [CMCC(B)44102] 乙型副伤寒沙门菌 [CMCC(B)50094] 白色念珠菌 [CMCC(B)98001] 黑曲霉 [CMCC(B)9 003]
细菌内毒素检测方法
细菌内毒素检测方法(译自英国药典版,等同欧洲药典版。
见原文之附录BP2004EP5XIV A方法)2.6.14.本文所描述的五种方法用于检测产品中是否存在细菌内毒素,而这些方法适用于药典中的细菌内毒素的检查法限度试验方法的制定者希望弄清楚,如在--.生产中能否降低其产品中的内毒素的含量,本篇幅中有关使用这些测试的相关方法将在补充的附录被提供。
细菌内毒素的检测原理是利用鲎变形细胞的溶解物来进行的(,,,试验)。
将含内毒素的溶液加入鲎变形细胞的溶解物可产生浑浊、沉淀或混合物的凝胶化反应。
反应速度依赖于溶液中的内毒素的浓度、和温度;反应要求有一定量pH 的二价阳离子、一个原凝酶系和可溶性蛋白的创造,而这些都哪由鲎变形细胞的溶解物提供。
采用从染色基因肽中释放的染料浓度来进行测定样品的内毒素浓度。
下面五种方法将在后面文章中介绍;方法:凝胶法;限度试验A方法:半定量凝胶法B方法:动力学浑浊法C方法:动力学发色肽方法D方法:发色肽终点法E当一篇专门文献中介绍内毒素的测定而没有指明某一种方法时,那么测试的方法就是按照方法。
次种方法已经得到证实,否则,产品的有效检测将会在A 专门文献中特别提到。
很多专著以“细菌内毒素限定浓度”的概念给出了细菌内毒素指标,也即某种产品所含细菌内毒素浓度不能超过限定浓度,要想证明产品符合要求,就必须表明产品所含内毒素的含量是少于内毒素限定浓度的。
试验是利用一种能避免微生物污染的方式进行的。
检测前的准备工作中,必须证实如下内容:1——所以的设备器皿不吸附内毒素。
——溶解物的灵敏度λ,λ是被定义为标记的溶解物敏感度或者最低内毒素浓度被用于制作标准曲线的(定量法)。
——干扰素的排除;如有必要时,需对设备和器具进行处理,以减少其本身所带内毒素。
除非特别指明外,否则在文献中从方法A到E中均采用相同标准。
在本篇附录中,术语说明中包括任何其他的容器,诸如一个微滴定率的极板等。
本试验包括如下试剂和标准溶液制备:标准细菌内毒素BRP;与国际标准相比较,对标准内毒素BRP进行效准,并以国际标准单位来表示。
验证管理规程
一.目的规范厂房、设施、设备、系统、仪器、操作规程、分析方法、清洁方法和产品等验证的管理,确保验证有效实施并符合GMP要求,保证验证工作的系统化与规范化,从而使药品质量能达到预期的结果。
二.适用范围适用于厂房、设施、设备、仪器确认及工艺、清洁方法、分析方法、操作规程验证等。
三.责任者总经理助理(分管质量):负责公司的验证管理工作,审核批准公司验证主计划。
质管部部长:负责公司日常验证管理,审核、批准验证方案和验证报告,签发验证合格证书。
与验证相关的部门:准确提供制定公司验证主计划所需的各项材料,按本规程要求和已经批准的验证主计划,制定验证方案,按照批准的验证方案组织实施验证,编写验证报告。
生产子公司生产总助:负责审核工艺、清洁及厂房设备设施等系统验证/确认方案和报告。
生产子公司制造部生产运营主管:负责审核车间工艺、清洁验证文件,并对工艺验证报告最终结论进行评价和建议。
生产子公司设备工程部负责人:负责审核厂房设备设施等系统验证/确认方案和报告,并对厂房设备设施确认报告最终结论进行评价和建议。
生产车间主任:负责审核车间工艺、清洁验证,设备确认文件;组织完成清洁验证有关的部分工作,如设备详细内表面积计算、设备取样示意图、清洁验证取样工器具的准备及处理、送样等;跟踪车间各项验证实施情况,确保验证按照计划及时有效开展。
物料仓库主任:负责审核物料仓库设备、仪器的确认文件。
车间工艺员:负责制定工艺验证文件;根据车间年度验证计划及补充的各项验证计划跟踪各项验证的实施情况,若计划有变或不能按计划执行应及时填写《验证变更审批表》并流转审批,确保车间各项验证工作及时有效开展。
设备班长/设备管理员:负责制定车间/QC设备确认文件,参与制定车间清洁验证文件。
QA巡检员:负责审核工艺验证及设备确认文件,制定清洁验证文件,负责清洁验证过程的取样,并按照要求监督验证工作的开展。
QA验证管理员:负责公司年度验证主计划的制定、验证或确认方案及报告的审核,负责清洁验证结果的评价,负责验证工作的动态管理。
细菌内毒素方法学验证方案
细菌内毒素方法学验证方案生效日期:再验证时间:审批表1.概述细菌内毒素检查法在药品的热原限量控制中应用广泛,本方案通过对无菌氯化钠溶液、配套药盒和本公司所生产的锝[99m Tc]放射性药品的细菌内毒素检测,对生产过程进行质量控制。
因此对细菌内毒素检验方法的验证就显得尤为重要。
2.目的为了保证所购买的无菌氯化钠溶液、配套药盒和本公司所生产的锝[99m Tc]放射性药品的细菌内毒素检验方法的专属性和灵敏性,且保证检测结果可符合质量标准要求,特制定此方案。
3.范围本方案适用于无菌氯化钠溶液、配套药盒以及本公司所生产的锝[99m Tc]放射性药品的无菌检查方法的验证。
4.确认小组成员与职责成立确认小组,明确各成员及相应职责。
5.参考文件5.1确认与验证管理规程5.2《中国药典》2010年版二部附录XI E6.验证所需仪器和材料6.1验证中所用到的仪器:电子天平、电热干燥箱、恒温水浴箱、水银温度计和旋涡混合器,验证所涉及到的仪器均经过检定或确认合格,且在有效期内。
6.2验证所需试剂:具有国家主管部门的批准文号的鲎试剂和由中国药品生物制品检定所统一发放的细菌内毒素工作标准品。
7.验证标准在实验结果中,必须要阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时,实验有效。
8.验证步骤8.1实验前准备验证前首先要进行细菌内毒素标准品的制备,内毒素限值的确定。
然后确认鲎试剂是否进行灵敏度复核和干扰试验。
确定干扰试验中的最大稀释倍数(MVD)。
8.1.1根据2010年版中国药典二部附录ⅪE细菌内毒素检查法中规定,细菌内毒素限值计算公式:L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值,本品以EU/mg表示;K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量,注射剂K=5EU/(kg.h);M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量,人均体重按60kg计算,人体表面积按1.62m2计算。
注射时间若不足1小时,按1小时计算。
本品以腺苷蛋氨酸计最大剂量为1000mg。
微生物限度与无菌-内毒素区别
;’.微生物限度-无菌-内毒素区别与联系微生物检测基本就这3项了。
微生物限度:用营养琼脂、玫瑰红钠培养。
洁净度中等操作台内进行(B级)无菌:硫乙醇酸盐、改良马丁在无菌套筒里操作并培养。
洁净度要求较高(A级)内毒素:鲎试剂稀释不同浓度来判定。
洁净度要求不高,D级情况下即可。
我的理解微生物泛指细菌和霉菌酵母菌等等、应该是包罗万象,各种杂菌都有无菌则也是各种杂菌与微生物限度检测的微生物有什么区别?内毒素是一种热源,服用没什么关系,在注射后容易导致人体发热。
内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分,叫做脂多糖。
脂多糖对宿主是有毒性的。
内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来,所以叫做内毒素。
耐高温比如说注射液产品用气接触产品,他应该用滤器过滤其他吧。
用膜直径改用0.45(过滤)的好还是0.22(除菌)的好?滤膜泡点肯定要做的,高风险产品应该要最少2层滤膜吧。
用了这滤膜可以不用检这3项还是要检其中项目?而且有的企业只是一年验证一下,不对气体日常可行吗?求大神详解3者的联系与区别,各什么时候需要检这3项及为什么。
答:微生物限度针对非无菌产品无菌和内毒素针对无菌产品。
微生物限度,无菌检验,内毒素检验均为供试品安全性检测。
主要区别是微生物限度,无菌检验是检验活的微生物方法,内毒素检验可以检验死去的微生物中内毒素含量。
什么时候选用不同的检验方法,主要参见药典要求,例如口服制剂选择微生物限度,注射剂和眼用制剂选择无菌检验,注射剂也需要做内毒素检验。
选择不同实验方法主要依据是供试品生物风险级别和供试品用途。
例如纯化水检验中不需做内毒素实验,注射用水检验中不需做无菌实验。
依据是纯化水主要用途为清洗,注射用水用途是配液,所以注射用水的微生物风险更高,需要做内毒素实验,控制风险。
微生物限度和无菌实验用具要求无菌,内毒素实验用具要求去除内毒素。
检验环境要求现行药典微生物限度和无菌实验均是C级下局部A级,微生物限度在超净工作台,无菌实验在生物安全柜内操作。
热源、无菌、细菌内毒素、微生物限度检查
热源、无菌、细菌内毒素、微生物限度检查的关系前面看到过关于无菌和内毒素区别的帖子。
那么请问各位,热源、无菌、细菌内毒素和微生物限度检查究竟有什么区别,又有什么联系呢?本人我在微生物方面比较白,只是觉得这四项都和细菌有关,都需要培养基,都要在无菌台里做…… 汗~~ 其他的实在不知了。
头都大了,希望各位指点迷津,谢谢。
[楼主] | Posted:08-09-09 10:22|珊瑚礁级别: ★会员发帖: 292威望: 6财富: 95注册时间:2008-03-06最后登陆:2010-11-25无菌,最终灭菌产品和百级生产非灭菌产品需要检测的项目,一般采用薄膜过滤法;如,粉针剂、大输液产品。
微生物限度,允许结果有菌落,但有限度,是一定范围,一般采用半封闭薄膜过滤法和平皿法。
指非灭菌产品,如口服制剂和食品、外用药。
热源,目前很多品种采用细菌内毒素检测方法代替,简单,成本低。
但必须按照国家标准。
内毒素和热源一般是大输液产品的检测项目。
想了解很多,应该多看看专业书籍啊[1 楼] | Posted:08-09-09 12:21|洲际捣蛋级别: 论坛版主发帖: 2500威望: 315财富: 42注册时间:2008-03-15最后登陆:2010-11-08热原---不需要培养基兔法看药典就知道是怎么回事了细菌内毒素----不需要培养基一般工作环境也可以做无菌----需要培养基薄膜过滤法直接接种法也可以参照药典微生物限度检查----需要培养基薄膜过滤法梯度稀释图布平板法区别:热原和细菌内毒素检验方法的不同但检验的东西在本质上其实是一样的另外细菌内毒素检查法要比热原检查法灵敏10倍,根据各种药物的特性,规定检查热原还是细菌内毒素。
注册时间:2008-03-10最后登陆:2010-10-11zyb3421060级别: ★会员发帖: 65威望: 3财富: 1注册时间:2008-03-10最后登陆:2010-11-12还不是很明白[5 楼] | Posted:08-12-25 08:26|shabb007级别: ★★会员发帖: 649威望: 20财富: 20注册时间:2007-12-14最后登陆:2010-12-03这么说吧。
细菌内毒素检测方法建立
细菌内毒素检测是确保药品、生物制品和医疗器械等产品安全的重要环节。
在建立细菌内毒素检测方法时,需遵循国家相关药品检测标准,如《中国药典》等规定,确保检测方法的准确性和可靠性。
以下是建立细菌内毒素检测方法的一些关键步骤:
1. 方法选择:根据检测样品的特性和预期用途,选择合适的检测方法。
目前常用的方法包括凝胶法、动态浊度法和显色基质法等。
2. 鲎试剂选择:选择合适的鲎试剂是检测过程中的关键。
鲎试剂的质量直接影响到检测结果的准确性。
3. 检测限度的确定:通过方法学验证,如准确度、精密度、专属性、定量限、线性、范围和耐用性等试验,来确定检测方法的检测限度。
4. 干扰因素分析:分析样品在检测过程中可能存在的干扰因素,如样品中的蛋白质、脂多糖等成分可能对检测结果产生影响。
5. 方法学验证:对所建立的方法进行验证,确保其准确度、精密度、专属性等满足检测要求。
6. 样品适应性验证:对不同样品进行适应性验证,确保方法的可重复性和稳定性。
7. 结果判定:根据检测结果,结合相关标准和规定,对样品中的细菌内毒素进行判定。
8. 质量控制:在整个检测过程中,需严格控制实验条件,如温度、时间等,确保检测结果的准确性。
9. 数据记录与分析:详细记录实验数据,进行统计分析,确保数据的完整性和可追溯性。
建立细菌内毒素检测方法是一个复杂且严谨的过程,需要专业知识和技能。
同时,检测人员需具备一定的实验操作能力和理论知识,以确保检测工作的顺利进行。
2008 无菌_微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析_国明
中国药品标准 2008年第 9卷第 1 Nhomakorabea 47以减少膜的吸附, 对于抑菌性较强的注射用无菌粉 末或固体原料, 一定要充分溶解、混合均匀。 114 加菌时机不一致
验证试验主要考虑滤器中残留抗菌物质对阳性 菌生长的影响, 应与对照滤器比较而作出判断, 所以 验证试验中加菌时机要与对照一致 [ 2] 。
115 薄膜过滤法滤膜材质选择不正确, 直接影 响试验结果
20 05年 版药 典执 行以 来药 品 生 产企 业 、科 研 单 位等 在药品质量标准建立及检验工作中困难和问题较多 的项目。我们在药品注册品种的审核检验中, 发现 有的申报单位对方法学验证的意义理解不够, 验证 试验的科学性、完整性及可操作性均存在着很多问 题。为尽快提高方法学验证水平, 更好地保证用药 的安全性, 现将方法学验证工作中常遇到的问题进 行分析、讨论。 1 无菌检查方法学验证问题及分析 111 验证菌株选择不正确 11111 敏感菌株与阳性对照菌不一致, 降低了阳性 对照菌的意义。有些药品选择了敏感菌株进行方法 学验证试验, 但是无菌检查时阳性对照菌不是验证 试验选定的敏感菌株。实际工作中抑制枯草芽孢杆 菌的样品很多, 可用此作为敏感菌株, 但药典规定无 菌检查时以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌, 使金 黄色葡萄球菌失去了阳性对照菌的意义。应在此类 无菌检查时也增加敏感菌株作为阳性对照菌。 11112 2005年版药典无菌检查中规定 / 抗革兰阴 性菌为主的供 试品以大肠埃希菌为对照菌 0, 但方 法学验证规定用菌株没有大肠埃希菌, 缺少了验证 此类药物抗菌作用的代表菌株。建议对抗菌作用中 明确具有抗革兰阴性菌的药品进行无菌检查方法学 验证时, 应增加大肠埃希菌作为验证菌株。 112 验证时取样量不符合要求 11211 无菌检验量与验证试验的取样量不同, 与中 国药典 2005年版方法学验证要求不符。进行供试 品检查时, 所采用的检验方法和检验条件应与验证 的方法相同, 应按照规定的检验数量和检验量取样。 11212 有的生产单位无菌检查方法学验证仅按抽 验产品检验数量进行验证, 药典规定应按照批出厂 产品最少检验数量进行试验 [ 1] 。 113 方法选择错误或不恰当, 不符合 2005 年版中 国药典要求 11311 有的申报单位无菌检查时无论什么药品都 用直接接种法。 2005年版中国药典规定, 只要供试 品性状允许, 应采用薄膜过滤法 [ 1] 。 11312 有些申报单位对非抑菌性供试品也用大量 的冲洗液冲洗, 如每次 100 mL, 10次 /膜, 既增加了 对膜的损伤和对微生物生物特性的破坏机会, 也增 加了检验繁琐性和检验人员的工作量。所以薄膜过 滤时尽 可能 减少 冲 洗量, 冲 洗 不一 定 为每 次 100 mL, 可少量多次, 并注意充分振摇。对于抑菌性较 强的供试品, 可以先用适宜的稀释液稀释后再过滤,
无菌制剂的质量要求
无菌制剂的质量要求无菌制剂是指在制备过程中无菌状态得到保持的药物制剂。
无菌制剂的质量要求十分重要,直接关系到患者的安全和疗效。
下面将从无菌制剂的质量控制、无菌制剂的质量评价以及无菌制剂的质量保证三个方面进行阐述。
一、无菌制剂的质量控制1. 原材料的选择和质量控制:无菌制剂的原材料应选择具备高纯度、低内毒素、无菌状态的物质。
对原材料的接收、检验应严格按照相关规范进行,确保原材料的质量符合要求。
2. 制备过程的无菌控制:无菌制剂的制备过程应在无菌工作台或无菌室内进行,操作人员应穿戴无菌防护服,严格遵守无菌操作规程。
同时,应对制剂设备、工具等进行严格的清洁和消毒,确保无菌操作的有效性。
3. 灭菌方式的选择和验证:根据无菌制剂的特点和要求,选择合适的灭菌方式,如热灭菌、辐射灭菌、过滤灭菌等,并对灭菌过程进行验证,确保灭菌的有效性和可靠性。
二、无菌制剂的质量评价1. 外观检查:对无菌制剂的外观进行检查,包括颜色、透明度等。
无菌制剂应具备清澈透明、无悬浮物、无沉淀等特点。
2. pH值检测:无菌制剂的pH值应符合规定的范围,确保其稳定性和适用性。
3. 细菌限度检验:通过菌落计数法和涂片法等方法,检测无菌制剂中的微生物限度。
无菌制剂中的微生物应符合相关规定,确保无菌制剂的无菌状态。
4. 内毒素检测:采用适当的方法,对无菌制剂中的内毒素进行检测,确保其内毒素含量符合规定。
5. 稳定性研究:对无菌制剂进行稳定性研究,包括物理稳定性、化学稳定性和微生物稳定性等方面的考察,确保无菌制剂的质量稳定和持久有效。
三、无菌制剂的质量保证1. 质量管理体系:建立和实施质量管理体系,包括质量方针、质量手册、质量标准等,确保质量管理的全面有效。
2. 人员培训和资质管理:对从事无菌制剂制备和质量控制的人员进行培训,提高其无菌操作技术和质量控制意识。
同时,对人员的资质进行管理,确保其符合相关要求。
3. 设备设施管理:对制剂设备、工具和无菌室等进行管理,包括设备的校验、维护和清洁消毒等,确保其符合无菌制剂制备的要求。
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无菌检查验证用菌株:
金黄色葡萄萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26 003] 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10 104] **拟修订为大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) [CMCC(B) 63 501] 生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941] 白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001] 黑曲霉 (Asperglllus niger) [CMCC(F) 98 003]
直接接种法
取符合直接接种法培养基用量要求的硫 乙醇酸盐流体培养基8管,分别接入小于 100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管;取 符合直接接种法培养基用量要求的改良 马丁培养基4管,分别接入小于100cfu的 白色念珠茵、黑曲霉各2管。其中1管接 人规定量的供试品,另1管作为对照,按 规定的温度培养3~5天。
验证的目的是为了确认试验中供试品应 选择药典中所收载的何种供试液制备方 法、何种测定方法及确定的检测系统是 否适用于该供试品的检验,即只有通过 方法验证,才能确定供试品的检验条件 和方法,保证“微生物限度检查”或 “无菌检查”方法的科学性和检验结果 的准确性。
2.不同企业生产的相同品种,特别是中
问题:方法选择错误
薄膜过滤法和直接接种法 如:一般供试品(无特殊说明)采用直接接种法 某厂家胸腺五肽注射液为普通注射剂,完全可以 采用薄膜过滤法,生产单位进行的无菌检查验证 法为直接接种法。 也有的厂家把两种方法的验证都写上,结论中也 没有说明采用那种方法。 CP2005:无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种 法,只要供试品性状允许,应采用薄膜过滤法。 修订:改为薄膜过滤法重新进行验证。
结果判断:
与对照管比较,如含供试品各容器中的试验菌均 生长良好,则供试品的该检验量在该检验条件下 无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计,照此检 查法和检查条件进行供试品的无菌检查。 如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢 或不生长,则供试品的该检验量在该检验条件下
有抑菌作用。
消除供试品抑菌的方法
问题:方法描述不够详细,没有可操作性
如:某产品验证资料内容“将规定量的供试 品按薄膜过滤法过滤,冲洗,在最后一次冲 洗液中加入小于100CFU的试验菌,过滤。取 出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养集中,或 将培养基加至滤筒中”。
实际工作中,药品生产、研发企业和各级药检
所在工作中都存在很多困难和问题。
关于执行《中国药典》2005年版微生物限度 检查法和无菌检查法有关问题的说明
国药典发[2005]98号
各药品检验所: 根据国食监注[2005]234号“关于颁布和 执行《中国药典》2005年版有关事宜的通知” 规定,《中国药典》7月1日起开始执行,各 药品检验所在执行“微生物限度检查法”和 “无菌检查法”过程中遇到了一些问题,为 保证《中国药典》2005年版的顺利实施,现 就有关问题说明如下:
冲洗不一定为100ml/次,可少量多次,如50ml/次, 注意充分振摇。 对于抑菌性较强的供试品,可以先用适宜的稀释液 稀释后再过滤,以减少膜的吸附, 减少冲洗量。如: 抗生素品种取规定量,混合至含适量稀释液(如 500ml等)的无菌容器中,然后再过滤。 对于抑菌性较强的注射用无菌粉末或固体原料,一 定要充分溶解、混合均匀。 抗菌药可以根据其抗菌谱选择敏感菌先进行预试验, 找到合适的条件再进行其他菌的实验。 采用开放式薄膜过滤器:滤膜分成几份与取样量、 冲洗条件的选择有关,建议尽量与无菌检查法一致 (最常见为3等分)。
问题:冲洗条件、冲洗量的选择
有些厂家提供的验证资料中,对非抑菌
性供试品也采用大量的冲洗,100ml/次 *10次/膜,增加了出现误差的机会。 1. 对膜的损伤 2. 检验方法繁琐,大大增加检验人员 的工作量(检验要按照已经验证的方法 进行) 3. 验证试验方法选择总的原则是由易 到难
国家药典委员会 中国药品生物制品检定所 二00五年十月十一日
●
验证的目的: 验证所采用的方法和条件是否适合 于供试品的无菌检查。 即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌 活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。
● 验证的意义:保证检验结果的准确、可靠及检
验方法的完整性。
二、无菌检查验证的关键点
检验数量和检验量
进行供试品无菌检查时,所采用的检验 方法和检验条件应与验证的方法相同。 结合无菌检查检验数量和检验量确定验 证时取样量。 如同时进行无菌检查一定要按照规定的 检验数量和检验量取样。
生产单位进行方法学验证时检验数量要按照表1 批出厂产品最少检验数量。检验量(每只样品 接入每种培养基的最少样品量)同上市抽验品 种。 无菌检查法中规定:只要供试品特性允许,应 将所有容器内的全部内容物过滤。因此,验证 试验中检验量就多不就少,如10ml注射液,虽 然每个滤膜每容器取2ml也符合药典规定,10支 分配至3个或更多滤筒也可,但建议取15支分3 个滤筒(贵重药品和抗生素品种可灵活掌握, 但不能低于最少量)。
1.“微生物限度检查”和“无菌检查”是药品安 全性检查的重要项目。虽然近几版《中国药典》均 收载有“微生物限度检查法”和“无菌检查法”, 但在如何保证检验方法的科学性和检验结果的准确 性方面与国外药典相比仍具有一定差距,其关键是 《中国药典》未强调对检验方法进行必要的方法验 证。为此,药典会设立专项科研课题,对2005年版 《中国药典》的“微生物限度检查法”和“无菌检 查法”增加验证试验的必要性进行研讨。根据研究 结果,2005年版《中国药典》规定当进行药品的 “微生物限度检查”或“无菌检查”时应进行方法 验证。
成药,因原料来源、工艺、辅料的不同, 药品可能表现出不同的抑菌特性;同一个 企业生产的相同品种,因原料来源不同、 工艺改变或不同实验室等原因,也可能导 致检测结果的差异。因此,不同企业生产 的相同品种进行“微生物限度检查”或 “无菌检查”时,其具体试验方法如冲洗 量等不能简单照搬,需通过验证试验核实 该试验方法和检测系统是否适宜。
中国药典无菌、微生物限度及 细菌内毒素检查方法学验证内 容简介
省药品检验所
主要内容
1、无菌检查方法学验证关键点及常见问题 2、微生物限度检查方法学验证关键点及常见 问题 3、细菌内毒素检查方法学验证关键点及常见 问题
无菌检查的方法学验证
相关规定 无菌检查验证的关键点 验证中常见的问题
一、相关规定
问题:生长缓慢的判断标准?
敏感菌株与阳性对照菌
阳性对照菌不是验证试验选定的敏感菌 株
问题:降低了阳性对照菌的意义,实际 工作中抑制枯草芽孢杆菌的样品很多 (敏感菌株),但阳性对照只能选择金 黄色葡萄球菌。
关于大肠埃希菌的问题
供试品无菌检查中规定“抗革兰阴性菌 为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌”, 但在方法学验证中所用菌株没有大肠埃 希菌。 解决措施:抗革兰阴性菌的抗菌药物进 行方法学验证时增加大肠埃希菌。 即将修订,将铜绿假单胞菌修订为大肠 埃希菌。修订后按新方法执行。
薄膜过滤法滤膜材质选择
普通滤膜 有机膜 低吸附滤膜 1.根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。 2.应保证滤膜在过滤前后的完整性。 3.采用全封闭过滤器注意观察膜的状态,某 些油性供试品或采用蓖麻油等作为溶媒的供 试品可以损伤普通滤膜。
验证试验与无菌检查
培养观察时间
验证试验:按规定的温度培养3~5天 无菌检查:阳性对照培养48~72h应生长 良好
对国内新药的注册检验,也应请企业提供方法验 证资料,如果企业提供不出方法学验证资料,根 据药品注册管理办法,应在审核意见中明确指出 “方法学未经验证,无法检验”,并建议企业重 新建立“微生物限度检查”或“无菌检查”方法。 监督抽验药品,由于2005年版以前历版《中国药 典》未强调进行方法学验证,故各药检所目前在 进行具体品种检验时难度较大,故也应请企业提 供方法验证资料并进行审核,未经过方法学验证 的“微生物限度检查”或“无菌检查”结果,决 不能给出“符合2005年版《中国药典》的规定” 的结论。
菌种的要求: 传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的
冷冻干燥菌种为第0代),并采用适宜的菌种保
藏技术,以保证试验菌株的生物学特性。
加菌量:<100cfu。
验证时,按“供试品的无菌检查”的规定及下
列要求进行操作。对每—试验菌应逐一法
薄膜过滤法
将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤, 冲洗,在最后一次的冲洗液中加入小于 100cfu的试验菌,过滤。取出滤膜接种 至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培 养基中,或将培养基加至滤筒内。另取 一装有同体积培养基的容器,加入等量 试验菌,作为对照。按规定温度培养3~ 5天。各试验菌同法操作。
增加冲洗量 增加培养基的用量 使用中和剂或灭活剂: β-内酰胺酶、对氨基苯甲酸
更换滤膜品种
注意:重新进行方法验证。
方法学验证资料试验记录
总的要求:详细、严谨、可操作性 供试品信息 检验数量和检验量:按照无菌检查的量确定 供试品处理、供试品溶液的制备 检验方法(选择直接接种法说明理由) 实验用菌 代数、稀释级、计数 检验条件:主要是冲洗条件(冲洗液、冲洗次数、 量,必要时说明滤膜材质、仪器、泵速等条件)。 需要中和、酶处理等特殊处理方法的需说明 逐日记录各菌的生长情况
方法学验证资料试验结论 采用的方法:薄膜过滤法/直接接种法 关键实验点:如冲洗条件、中和、酶处 理等因素