无菌、微生物限度、细菌内毒素方法学验证

1．“微生物限度检查”和“无菌检查”是药品安 全性检查的重要项目。虽然近几版《中国药典》均 收载有“微生物限度检查法”和“无菌检查法”， 但在如何保证检验方法的科学性和检验结果的准确 性方面与国外药典相比仍具有一定差距，其关键是 《中国药典》未强调对检验方法进行必要的方法验 证。为此，药典会设立专项科研课题，对2005年版 《中国药典》的“微生物限度检查法”和“无菌检 查法”增加验证试验的必要性进行研讨。根据研究 结果，2005年版《中国药典》规定当进行药品的 “微生物限度检查”或“无菌检查”时应进行方法 验证。
结果判断：
与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均 生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下 无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检 查法和检查条件进行供试品的无菌检查。 如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢 或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下
有抑菌作用。
消除供试品抑菌的方法
问题：方法描述不够详细，没有可操作性

如：某产品验证资料内容“将规定量的供试 品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次冲 洗液中加入小于100CFU的试验菌，过滤。取 出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养集中，或 将培养基加至滤筒中”。
薄膜过滤法滤膜材质选择



普通滤膜 有机膜 低吸附滤膜 1.根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。 2.应保证滤膜在过滤前后的完整性。 3.采用全封闭过滤器注意观察膜的状态，某 些油性供试品或采用蓖麻油等作为溶媒的供 试品可以损伤普通滤膜。
验证试验与无菌检查
培养观察时间
Leabharlann Baidu
验证试验：按规定的温度培养3～5天 无菌检查：阳性对照培养48～72h应生长 良好
直接接种法

取符合直接接种法培养基用量要求的硫 乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于 100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取 符合直接接种法培养基用量要求的改良 马丁培养基4管，分别接入小于100cfu的 白色念珠茵、黑曲霉各2管。其中1管接 人规定量的供试品，另1管作为对照，按 规定的温度培养3～5天。
中国药典无菌、微生物限度及 细菌内毒素检查方法学验证内 容简介

省药品检验所
主要内容

1、无菌检查方法学验证关键点及常见问题 2、微生物限度检查方法学验证关键点及常见 问题 3、细菌内毒素检查方法学验证关键点及常见 问题

无菌检查的方法学验证
相关规定 无菌检查验证的关键点 验证中常见的问题
一、相关规定

问题：方法选择错误



薄膜过滤法和直接接种法 如：一般供试品（无特殊说明）采用直接接种法 某厂家胸腺五肽注射液为普通注射剂，完全可以 采用薄膜过滤法，生产单位进行的无菌检查验证 法为直接接种法。 也有的厂家把两种方法的验证都写上，结论中也 没有说明采用那种方法。 CP2005：无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种 法，只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。 修订：改为薄膜过滤法重新进行验证。
菌种的要求： 传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的
冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保
藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
加菌量:＜100cfu。
验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下
列要求进行操作。对每—试验菌应逐一进行验
证。
验证方法： 直接接种法 薄膜过滤法
薄膜过滤法

将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤， 冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于 100cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种 至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培 养基中，或将培养基加至滤筒内。另取 一装有同体积培养基的容器，加入等量 试验菌，作为对照。按规定温度培养3～ 5天。各试验菌同法操作。

对检验数量和检验量的把握应考虑便于实 际操作，比如处理100ml/袋的样品，取9袋 样品一次分配到一组三联滤器，检验数量 大于药典规定的6个，但检验量似乎不符合 药典规定的每袋样品取半量检验的规定， 仅为1/3，但根据药典检验量即为一次试验 所用供试品总量（g或ml）的解释，这与先 将6袋分配两个滤筒，再将剩下3袋抽入一 个滤筒作为样定对照的方法一样，却更节 省时间。（中检所讲义）
成药，因原料来源、工艺、辅料的不同， 药品可能表现出不同的抑菌特性；同一个 企业生产的相同品种，因原料来源不同、 工艺改变或不同实验室等原因，也可能导 致检测结果的差异。因此，不同企业生产 的相同品种进行“微生物限度检查”或 “无菌检查”时，其具体试验方法如冲洗 量等不能简单照搬，需通过验证试验核实 该试验方法和检测系统是否适宜。

对国内新药的注册检验，也应请企业提供方法验 证资料，如果企业提供不出方法学验证资料，根 据药品注册管理办法，应在审核意见中明确指出 “方法学未经验证，无法检验”，并建议企业重 新建立“微生物限度检查”或“无菌检查”方法。 监督抽验药品，由于2005年版以前历版《中国药 典》未强调进行方法学验证，故各药检所目前在 进行具体品种检验时难度较大，故也应请企业提 供方法验证资料并进行审核，未经过方法学验证 的“微生物限度检查”或“无菌检查”结果，决 不能给出“符合2005年版《中国药典》的规定” 的结论。
无菌检查验证用菌株：



金黄色葡萄萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26 003] 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10 104] **拟修订为大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) [CMCC(B) 63 501] 生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941] 白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001] 黑曲霉 (Asperglllus niger) [CMCC(F) 98 003]

验证的目的是为了确认试验中供试品应 选择药典中所收载的何种供试液制备方 法、何种测定方法及确定的检测系统是 否适用于该供试品的检验，即只有通过 方法验证，才能确定供试品的检验条件 和方法，保证“微生物限度检查”或 “无菌检查”方法的科学性和检验结果 的准确性。
2．不同企业生产的相同品种，特别是中
验证的类型
●前验证: 建立药品的微生物限度检查法和无菌 检查法时（当建立药品的无菌或微生物限度检查 法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法 适合于该药品的无菌检查）。 ● 再验证: 修订的检验方法;供试品的组分或原 检验条件发生改变可能影响检验结果时 ;定期的 方法验证（若药品的组分或原检验条件发生改变 时，检查方法应重新验证） 。
增加冲洗量 增加培养基的用量 使用中和剂或灭活剂： β-内酰胺酶、对氨基苯甲酸
更换滤膜品种
注意：重新进行方法验证。
方法学验证资料试验记录
总的要求：详细、严谨、可操作性 供试品信息 检验数量和检验量：按照无菌检查的量确定 供试品处理、供试品溶液的制备 检验方法（选择直接接种法说明理由） 实验用菌 代数、稀释级、计数 检验条件：主要是冲洗条件（冲洗液、冲洗次数、 量，必要时说明滤膜材质、仪器、泵速等条件）。 需要中和、酶处理等特殊处理方法的需说明 逐日记录各菌的生长情况


国家药典委员会 中国药品生物制品检定所 二00五年十月十一日
●
验证的目的: 验证所采用的方法和条件是否适合 于供试品的无菌检查。 即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌 活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。
● 验证的意义：保证检验结果的准确、可靠及检
验方法的完整性。
二、无菌检查验证的关键点
问题：生长缓慢的判断标准？
敏感菌株与阳性对照菌
阳性对照菌不是验证试验选定的敏感菌 株
问题：降低了阳性对照菌的意义，实际 工作中抑制枯草芽孢杆菌的样品很多 （敏感菌株），但阳性对照只能选择金 黄色葡萄球菌。
关于大肠埃希菌的问题
供试品无菌检查中规定“抗革兰阴性菌 为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌”， 但在方法学验证中所用菌株没有大肠埃 希菌。 解决措施：抗革兰阴性菌的抗菌药物进 行方法学验证时增加大肠埃希菌。 即将修订，将铜绿假单胞菌修订为大肠 埃希菌。修订后按新方法执行。

3．目前各药检所涉及的检验工作可分为三类： 注册检验（包括进口注册和新药注册）、监督 抽验和进口检验。考虑到各检验性质的差异， 各口岸所在进行进口复核及进口检验时，应请 企业提供方法验证材料或详细的SOP资料进行审 核；各口岸所完成复核时应在修订的进口注册 标准中明确“微生物限度检查”或“无菌检查” 的关键操作点（如供试品的处理方法等）及试 验方法（如平皿法、薄膜过滤法、直接接种法 等），并在复核说明中概述验证实验结果，以 方便以后的进口检验。
问题：冲洗条件、冲洗量的选择
有些厂家提供的验证资料中，对非抑菌
性供试品也采用大量的冲洗，100ml/次 *10次/膜，增加了出现误差的机会。 1. 对膜的损伤 2. 检验方法繁琐，大大增加检验人员 的工作量（检验要按照已经验证的方法 进行） 3. 验证试验方法选择总的原则是由易 到难
实际工作中，药品生产、研发企业和各级药检
所在工作中都存在很多困难和问题。
关于执行《中国药典》2005年版微生物限度 检查法和无菌检查法有关问题的说明
国药典发[2005]98号

各药品检验所： 根据国食监注[2005]234号“关于颁布和 执行《中国药典》2005年版有关事宜的通知” 规定，《中国药典》7月1日起开始执行，各 药品检验所在执行“微生物限度检查法”和 “无菌检查法”过程中遇到了一些问题，为 保证《中国药典》2005年版的顺利实施，现 就有关问题说明如下：




冲洗不一定为100ml/次，可少量多次，如50ml/次， 注意充分振摇。 对于抑菌性较强的供试品，可以先用适宜的稀释液 稀释后再过滤，以减少膜的吸附, 减少冲洗量。如： 抗生素品种取规定量，混合至含适量稀释液（如 500ml等)的无菌容器中，然后再过滤。 对于抑菌性较强的注射用无菌粉末或固体原料，一 定要充分溶解、混合均匀。 抗菌药可以根据其抗菌谱选择敏感菌先进行预试验， 找到合适的条件再进行其他菌的实验。 采用开放式薄膜过滤器：滤膜分成几份与取样量、 冲洗条件的选择有关，建议尽量与无菌检查法一致 （最常见为3等分）。
药品无菌和微生物限度检查方法验证作为中国药 典2005年版增订的一项重要内容对促进我国药品 微生物检验的标准化是十分重要和必要的，执行
近一年以来的情况表明，方法验证是促使我国药
品无菌和微生物限度检查方法更加合理、科学和 严谨的重要途径。（2006年6月全国会议纪要）
中检所和药典会多次召开会议肯定工作的成绩、 研讨存在的问题，希望各级领导能给予高度重 视，从各方面支持这项工作长期持续发展。
检验数量和检验量

进行供试品无菌检查时，所采用的检验 方法和检验条件应与验证的方法相同。 结合无菌检查检验数量和检验量确定验 证时取样量。 如同时进行无菌检查一定要按照规定的 检验数量和检验量取样。




生产单位进行方法学验证时检验数量要按照表1 批出厂产品最少检验数量。检验量（每只样品 接入每种培养基的最少样品量）同上市抽验品 种。 无菌检查法中规定：只要供试品特性允许，应 将所有容器内的全部内容物过滤。因此，验证 试验中检验量就多不就少，如10ml注射液，虽 然每个滤膜每容器取2ml也符合药典规定，10支 分配至3个或更多滤筒也可，但建议取15支分3 个滤筒（贵重药品和抗生素品种可灵活掌握， 但不能低于最少量）。
方法学验证资料试验结论 采用的方法：薄膜过滤法/直接接种法 关键实验点：如冲洗条件、中和、酶处 理等因素

三、验证及资料中常见的问题
薄膜过滤法加菌的时机

按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌 液，而验证试验主要考虑滤膜/滤器残留抗 菌物质对阳性菌的生长的影响，可以与对 照滤器比较而作出判断，所以验证试验中 加菌时机与方式只要与对照一致即可（中 检所讲义）。