脲酶活力测定(纳氏试剂比色法)
脲酶活性的测定
大豆制品中脲酶活性的测定定性法：酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不产生强烈发热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液；结晶尿素；三、方法：将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。
空白试验：不加尿素，其他同上。
品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。
•0-1min变红，活性非常强（＞1.0）；•1-2min变红，活性大概0.5-1.0；•2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
四、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。
尿素-酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）三、方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。
脲酶活力测定（纳氏试剂比色法）
实验四 脲酶活力测定（纳氏试剂比色法）一、实验原理脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0 。
反应式： (NH 2)2CO+ H 2O 脲酶2NH 3 + CO 2氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。
反应式：NH 3·H 2O ＋2K 2HgI 4 + 3KOH HgO ·HgNH 2I ＋7KI + 3H 20 （纳氏试剂） （碘化氨氧合汞） 二、实验步骤将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作：取3 支干净干燥试管，编号：1、空白；2、标准；3、样品。
按下表步骤加入实（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min ，立即向样品管（3号管）加1 mol ·L -1H 2SO 4 1.00mL ，终止反应。
（8）另取3支干净试管，分别对应于上面各反应液进行显色。
三、结果计算脲酶活力（U · mL -1) = ( A 3 - A 1 ）* 标准管中的NH 3微摩尔数 ( A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数 式中：n 为酶样品的稀释倍数 四、仪器和试剂1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。
2 、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷酸盐缓冲液适当稀释。
3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。
4 、磷酸盐缓冲液（pH7.0）：6.70 g Na2HPO4 ·2 H2O , 3.25 g KH2PO4 ，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。
5 、1 mol·L -1 H2SO4溶液：56mL 浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL 蒸馏水的容量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。
6 、硫酸铵标准溶液：称取在60°C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL 。
实验五 固定化脲酶活力的测定
实验五固定化脲酶活力的测定一、实验原理固定化酶的活力测定方法，有振荡测定法、酶柱测定法和连续测定法等多种方法。
常用的振荡测定法，是将一定质量的固定化酶放在一定形状和大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在固定化酶的最适反应条件下，振荡或搅拌反应系统，反应一定的时间后，取出一定量的反应液，进行酶活力测定。
酶活力测定的反应原理和方法与溶液酶活力的测定方法相同：脲酶催化尿素水解生成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。
氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比。
故可测定脲酶活力的大小。
二、仪器和试剂1、水浴锅，分光光度计，移液管，比色皿及其他常规仪器2、实验四制备的固定化脲酶3、磷酸缓冲液（pH 7.0）：6.7 g Na2HPO4.2H2O，3.25 g KH2PO4，溶于蒸馏水并定容至100 ml4、3%尿素溶液：3 g尿素溶于磷酸缓冲液中，并定容至100 ml5、标准氨溶液：称取在60℃干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322 g，蒸馏水溶解并定容至100 ml。
此溶液含NH3为40 µM6、1 M H2SO4溶液：56 ml浓硫酸，缓慢加入盛有600 ml蒸馏水容量瓶中，冷却后加水定容至1000 ml7、纳氏试剂：称取16 g氢氧化纳，溶于50 mL水中，充分冷却至室温。
另称取7 g碘化钾和10 g碘化汞(HgI2)溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐注入氢氧化纳溶液中，用水稀释至100 mL，过夜澄清后，倒出上清液贮于棕色瓶中，密塞保存。
三、实验步骤1、将实验四中得到的凝胶包埋脲酶重新称重（m1）。
取0.3-0.5 g，切碎。
2、取两支试管编号（1号空白管，3号样品管），分别称取凝胶包埋脲酶100mg（m2）置于两管中，各加入蒸馏水9 ml，磷酸缓冲液1 ml，于30℃水浴中保温5 min。
3、向3号管加入30℃预保温的3%尿素溶液1 ml，并准确开始计时；向1号管加蒸馏水1 ml，于30℃水浴中反应20 min（t），并不断振摇。
脲酶的测定方法
一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。
1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。
1h内再分光光度计上于578nm处比色。
脲酶提取工艺及活性检测方法研究报告
脲酶提取工艺及活性检测方法研究报告本研究报告主要介绍从三个不同品种的刀豆当中提取脲酶的工艺流程并且确立了酶活性的检测方法。
通过固体浸提、乙醇分级沉淀、G-200葡聚糖凝胶过滤、冷冻干燥等工艺处理，最终获得比活性分别为923.6U/g，780.1U/g，585.3U/g 的脲酶。
1刀豆脲酶的提取工艺1.1 30%乙醇提取刀豆脲酶用天平称取干燥的刀豆，粉碎，以100目钢筛筛出豆粉。
向锥形瓶中加入10.0g豆粉，再加入100ml（固液比1：10）的30%乙醇溶液，充分摇匀30min，放置冰箱保存24h后，以4000r/min离心15min，上清液为脲酶粗提取液。
1.2 刀豆脲酶的分离纯化1.2.1乙醇分级沉淀向粗酶液中加入预冷（-20℃）的无水乙醇至终体积分数为10%，以8000r/min 冷冻离心10min进行一级沉淀，收集上清液；再向上清液中加入预冷无水乙醇至终体积分数为40%，以15000r/min冷冻离心10min，弃去上清液，收集沉淀，立即将沉淀溶于少量磷酸缓冲液（pH6.8）中，4℃保存备用。
1.2.2凝胶过滤脲酶分子量较大，脲酶粗制品通过交联葡聚糖Senhadex G－200 层析柱，酶本身不能进入凝胶颗粒，而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒。
用磷酸缓冲液（pH=6.8）作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离的目的。
首先进行凝胶溶胀，然后装柱，加样，控制流速，流出的液体分别收集在刻度离心管中，收集量为 3 mL/管。
或者在设备允许的情况下，直接使用蛋白质自动纯化系统进行蛋白质纯化，本实验采用此种方法。
通过凝胶过滤，收集蛋白质含量较高的各管并4℃保藏备用。
1.2.3冷冻干燥将经凝胶过滤后的酶液分装在能够保证蒸发表面尽量大且厚度尽量薄的容器中，装量要均匀，然后进行冷冻处理，冻结之后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥。
干燥完毕后立即对样品进行酶活性检测，同时将产品低温保藏。
脲酶的制备及其生物学性质的研究
综合研究性实验三：脲酶的制备及其生物学性质的研究一.实验目的1.学习大豆脲酶的提取方法；2.掌握脲酶米氏常数Km的测定方法；3.测定脲酶的活力单位及此活力；4.测定温度、PH、抑制剂对酶活性的影响。
二.脲酶提取液的制备三.脲酶Km的测定[一]实验原理K m值一般可看作是酶促反应中间产物的解离常数。
测定K m在研究酶的作用机制、观察酶与底物间的亲和力大小、鉴定酶的种类及纯度、区分竞争性抑制与非竞争性抑制作用等研究中均具有重要的意义。
当环境温度、pH值和酶的浓度等条件相对恒定时，酶促反应的初速度v随底物浓度[S]增大而增大，直至酶全部被底物所饱和达到最大速度V。
反应初速度与底物浓度之间的关系经推导可用下式来表示，即米氏方程式：对于K m值的测定，我们通常采用Lineweaver-Burk作图法，即双倒数作图法。
具体做法为：取米氏方程式倒数形式。
若以1/v对1/[S]作图，即可得下图中的曲线，通过计算横轴截距的负倒数，就可以很方便地求得K m值。
本实验从大豆中提取脲酶，脲酶催化尿素分解产生碳酸铵，碳酸铵在碱性溶液中与纳氏试剂作用，产生橙黄色的碘化双汞铵。
在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵的产量成正比。
通过分光光度计所得到的光吸收值可代表酶促反应的初速度（单位时间所产生的碳酸铵含量与光吸收值成正比）。
具体反应如下：（1）酶促反应（2）呈色反应[二]实验试剂1.0.05mol/L尿素溶液2.0.1mol/LpH=7.0Tris-HCl缓冲液3.10%ZnSO4溶液4.0.5mol/LNaOH溶液5.10%酒石酸钾钠溶液6.钠氏试剂将碘化钾75g，碘55g，蒸馏水50mL以及汞75g，置于500mL锥形瓶内，用力振荡约15min，待碘色消失时，溶液即发生高热。
将锥形瓶浸在冷水中继续摇荡，一直到溶液呈绿色时止。
将上清液倾入1000mL量筒内，并用蒸馏水洗涤残渣，将洗涤液也倾入量筒中，最后加蒸馏水至1000mL，此即为母液。
豆浆中脲酶活性的测定
表 ２ 准确 度试验 （ 一３ ｎ ）
０ ９９ ） ． ９２ 。结 果表 明 ： 豆 甙在 ０ ０ ２ ． ３ｍｇ ｍｌ 大 ． ０ ￣０ ０ ０ ／ 范 围 内呈 良好 的 线 性 关 系 ， 低 检 出 限 为 ０ ０ｔ ； 最 ．４ｔ ｇ 淫 羊 藿甙 在 ０ ０ ２ ０ １ｍｇ ｍｌ 围 内呈 良好 的线 ．０ ￣ ． Ｏ ／ 范
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江 苏预防医学 ２０ 年 ９月第 １ 卷第 ３ ０２ ３ 期
Ｊ ｎｓ ｒ ｄ Ｓｐ２ ０ ， ｌ ３Ｎ — ｉ ￣ｕＦｅ Ｍｅ ， ｅ ，０２Ｖｏ １ ， ｏ３ ａ ＇ｖ —．
பைடு நூலகம்
（ ＮＨ ４ ２ ３ ２ ａ Ｈ — ）ＣＯ ＋ Ｎ Ｏ
２ ２ Ｈ Ｏ
２ ５０ ２０ １）
【 文献 标识码】 Ｂ 【 中图分类号】 Ｒ一３ 【 ３ 文章编 号】 １ ０ －９ ７ （０ ２０ － ０ ６ －０ ０ ６ ００２０）３ ０ ３ ３ 【关 键 词 】 豆浆 ； 酶活性 ； 脲 吸光 度
豆浆营养丰富 ， 但必须煮沸后才可食用 。 煮沸可 防止豆浆 中毒 ， 但也破坏了多种营养物质 。 由于豆浆 有“ 假沸” 现象 ， 目前多以豆浆脲酶 活性来表示抗营
［］ 张 回剐 ， ３ 曾红 ， 徐绥绪 ， ． 效液 相色谱法测定糖脂双 降茶中 等 高 淫羊藿甙的含量 Ｅ］色谱 ，０１ １（）３５３６ Ｊ． ２０ ，９４ ：６—６．
－ １ ］ 王 德先 ， ４ 杨更 亮 ， 秀荣 等 ．毛 细管 电泳 法测 定 淫羊 藿甙 的 宋 ｐａ Ｋ 值及其在 中药淫羊藿 中的含量ｌ ］ 色谱 ，０ １ １ （ ） ６— －． Ｊ ２ ０ ，９ １ ：４
６６ ．
２ ５ 准确 度 试 验 ．
脲酶提取工艺及活性检测方法研究报告
脲酶提取工艺及活性检测方法研究报告本研究报告主要介绍从三个不同品种的刀豆当中提取脲酶的工艺流程并且确立了酶活性的检测方法。
通过固体浸提、乙醇分级沉淀、G-200葡聚糖凝胶过滤、冷冻干燥等工艺处理，最终获得比活性分别为923.6U/g，780.1U/g，585.3U/g 的脲酶。
1刀豆脲酶的提取工艺1.1 30%乙醇提取刀豆脲酶用天平称取干燥的刀豆，粉碎，以100目钢筛筛出豆粉。
向锥形瓶中加入10.0g豆粉，再加入100ml（固液比1：10）的30%乙醇溶液，充分摇匀30min，放置冰箱保存24h后，以4000r/min离心15min，上清液为脲酶粗提取液。
1.2 刀豆脲酶的分离纯化1.2.1乙醇分级沉淀向粗酶液中加入预冷（-20℃）的无水乙醇至终体积分数为10%，以8000r/min 冷冻离心10min进行一级沉淀，收集上清液；再向上清液中加入预冷无水乙醇至终体积分数为40%，以15000r/min冷冻离心10min，弃去上清液，收集沉淀，立即将沉淀溶于少量磷酸缓冲液（pH6.8）中，4℃保存备用。
1.2.2凝胶过滤脲酶分子量较大，脲酶粗制品通过交联葡聚糖Senhadex G－200 层析柱，酶本身不能进入凝胶颗粒，而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒。
用磷酸缓冲液（pH=6.8）作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离的目的。
首先进行凝胶溶胀，然后装柱，加样，控制流速，流出的液体分别收集在刻度离心管中，收集量为 3 mL/管。
或者在设备允许的情况下，直接使用蛋白质自动纯化系统进行蛋白质纯化，本实验采用此种方法。
通过凝胶过滤，收集蛋白质含量较高的各管并4℃保藏备用。
1.2.3冷冻干燥将经凝胶过滤后的酶液分装在能够保证蒸发表面尽量大且厚度尽量薄的容器中，装量要均匀，然后进行冷冻处理，冻结之后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥。
干燥完毕后立即对样品进行酶活性检测，同时将产品低温保藏。
土壤脲酶活性的比色法测定
土壤脲酶活性的比色法测定是一种常用的方法，它可以测量土壤中脲酶的存在和活性。
这种方法通常使用一种叫做脲酶试剂盒的工具，该试剂盒中包含了所需的试剂和比色剂。
具体的测试步骤如下：
取一定量的土壤样品，并加入适量的水，搅拌均匀。
将混合物加入试剂盒中，加入脲酶试剂。
按照试剂盒中的说明，在一定的时间内进行反应。
比较样品的颜色和标准对照物的颜色，并记录下来。
根据脲酶试剂盒的不同，颜色的变化可能会有所不同。
一般来说，脲酶的存在和活性越高，样品的颜色就会越深。
通过对样品颜色的比较，就可以知道土壤中脲酶的存在和活性水平。
请注意，这种方法只能测量土壤中脲酶的活性水平，并不能测量脲酶的种类和数量。
土壤脲酶活性的比色法测定是一种常用的测量土壤中脲酶存在和活性的方法。
它使用脲酶试剂盒，包含所需试剂和比色剂。
测试步骤包括取样、加水搅拌、加入试剂盒、反应并比较颜色。
结果表明，脲酶存在和活性越高，样品颜色越深。
注意，这种方法只能测量脲酶活性水平，不能测量脲酶种类和数量。
脲酶、蛋白酶和L-天冬酰胺酶活性测定方法
一、脲酶活性测定方法（苯酚钠-次氯酸钠比色法）1.称取5g过100目筛的风干土样于50ml容量瓶中，加入1ml甲苯使其与土样充分混匀静置15min，使土壤中微生物被完全杀死；2.往瓶中加入10ml 100g/L的尿素溶液和20ml柠檬酸盐缓冲液，仔细混匀后置于37℃恒温下培养24h；3.用加热至38℃的蒸馏水稀释至刻度线（甲苯应浮在刻度线之上），摇匀，过滤；4.每一土样都设置用水代替基质的对照；对整个实验，设置无土壤的对照，以检验试剂的纯度；5.吸取3ml滤液到50ml容量瓶中，用水稀释至15ml，然后加入4ml苯酚钠溶液，并加入3ml次氯酸钠溶液，每次加完试剂都要摇匀；6.静置20min后，使其充分显色，定容显色液，于分光光度计578nm处比色，脲酶活性以24h后1g土壤中铵态氮的mg数表示。
1.取25ml酪氨酸基质溶液于100ml三角瓶中，于30℃水浴保温；2.加入5g鲜土，1ml甲苯，混匀后，30℃恒温箱中培养48h；3.取出三角瓶，加入25ml蛋白质沉淀剂，静置30min，待蛋白质沉淀后用干滤纸过滤；4.取2ml滤液于试管中，加入0.55mol/L Na2CO35ml，33% Folin试剂1ml，立即振荡；5.将试管放入30℃恒温水浴中，显色30min；6.用分光光度计在波长680nm处测定光密度，由标准曲线查出酪氨酸含量。
1.称取5g鲜土（过10目）于50ml刻度试管中，加0.2ml甲苯和9ml Tris缓冲液，混匀后加入1ml 0.05mol/L L-天冬酰胺溶液，混匀，37℃下培养2h后，加入35ml KCl-Ag2SO4混合溶液，混合均匀，静置冷却至室温（约5min），用KCl-Ag2SO4混合溶液定容，混匀；2.吸取20ml L-天冬酰胺溶液前，加入KCl-Ag2SO4混合溶液。
脲酶试验操作规程(3篇)
第1篇一、目的本规程旨在规范脲酶试验的操作流程，确保试验结果的准确性和可靠性。
二、原理脲酶是一种催化脲分解成氨和二氧化碳的酶。
在本试验中，脲酶将脲分解，产生的氨与酸化后的水杨酸酚反应，生成紫色化合物，通过比色法测定脲酶的活性。
三、试剂与材料1. 试剂：- 脲酶试剂：含有脲、水杨酸酚、氢氧化钠、硫酸铜等成分的溶液。
- 酸化试剂：含有硫酸的溶液。
- 标准氨溶液：已知浓度的氨溶液。
- 比色试剂：用于比色的溶液。
- 比色仪：用于测定吸光度的仪器。
2. 材料：- 试管：用于加样和反应的容器。
- 移液器：用于精确量取试剂的仪器。
- 磁力搅拌器：用于混合溶液的仪器。
四、操作步骤1. 标准曲线制备：- 准备一系列已知浓度的氨溶液。
- 将氨溶液加入试管中，每组加入2ml。
- 加入等体积的酸化试剂，混匀。
- 加入等体积的脲酶试剂，混匀。
- 在室温下反应30分钟。
- 使用比色仪测定吸光度，以氨浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 脲酶活性测定：- 准备待测样品，按需稀释。
- 将样品加入试管中，每组加入2ml。
- 加入等体积的酸化试剂，混匀。
- 加入等体积的脲酶试剂，混匀。
- 在室温下反应30分钟。
- 使用比色仪测定吸光度。
- 根据标准曲线，计算样品中脲酶的活性。
五、注意事项1. 试剂应保存在阴凉、干燥、避光处，避免与有机溶剂接触。
2. 操作过程中应避免样品污染，确保实验结果的准确性。
3. 试剂加入顺序应严格按照操作规程进行，避免产生误差。
4. 实验过程中，严格控制反应时间，确保反应完全。
5. 使用比色仪时，注意校准仪器，确保测量结果的准确性。
六、结果记录与分析1. 记录每组实验的吸光度值。
2. 根据标准曲线，计算样品中脲酶的活性。
3. 对实验结果进行统计分析，判断脲酶活性是否符合预期。
七、质量控制1. 定期进行空白试验，以排除试剂和操作过程中的干扰。
2. 使用已知脲酶活性的标准样品，对实验结果进行校准。
3. 定期对仪器进行维护和校准，确保实验结果的准确性。
两种脲酶活性定性测定方法及比较
两种脲酶活性定性测定方法及比较随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。
判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。
脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。
脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。
脲酶活性没有负值，最低为0。
在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。
国内很多大企业一般均采用0.2。
实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。
目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。
一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。
2.试剂2.1尿素:GB696，分析纯。
2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
3.操作方法3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。
3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。
3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。
颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验。
样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。
脲酶值的测定实验报告
脲酶值的测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定样品中的脲酶值，以评估样品中脲酶的活性水平，为相关研究和应用提供数据支持。
二、实验原理脲酶能够催化尿素水解生成氨和二氧化碳。
通过检测反应过程中产生的氨量，可以间接反映脲酶的活性。
通常采用苯酚次氯酸钠比色法来测定氨的含量，从而计算出脲酶值。
三、实验材料与设备1、实验材料尿素溶液（浓度为 10%）苯酚溶液（5g/L）次氯酸钠溶液（活性氯含量大于 52%）氢氧化钠溶液（10mol/L）氯化铵标准溶液（100μg/mL）待测样品2、实验设备分光光度计恒温水浴锅移液器容量瓶（100mL、500mL 等）具塞刻度试管（10mL、25mL 等）四、实验步骤1、标准曲线的绘制分别吸取 0、1、2、3、4、5mL 氯化铵标准溶液于 25mL 具塞刻度试管中，用蒸馏水补足至 5mL。
向各试管中加入 4mL 苯酚溶液和 3mL 次氯酸钠溶液，摇匀，在室温下放置 30min。
用分光光度计在 625nm 波长处，以空白管（即 0mL 氯化铵标准溶液）为参比，测定各管的吸光度值。
以氯化铵的含量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、样品处理称取适量的待测样品，置于 100mL 容量瓶中，加入 20mL 尿素溶液，在 37℃恒温水浴锅中保温 30min。
保温结束后，将容量瓶取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。
吸取 5mL 上述处理后的样品溶液于 25mL 具塞刻度试管中，按照绘制标准曲线的步骤进行操作，测定样品溶液的吸光度值。
3、空白对照除了不加入样品外，按照样品处理的步骤进行操作，得到空白对照溶液。
测定空白对照溶液的吸光度值。
五、实验结果与计算1、根据样品溶液和空白对照溶液的吸光度值，在标准曲线上查出相应的氯化铵含量（μg）。
2、脲酶值（μg/g·30min）的计算公式为：脲酶值＝（样品中氯化铵含量空白对照中氯化铵含量）×稀释倍数 × 1000 ／样品质量六、实验注意事项1、实验过程中应严格控制反应条件，如温度、时间等，以确保实验结果的准确性。
脲酶的测定方法Word 文档
一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。
1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。
1h内再分光光度计上于578nm处比色。
土壤脲酶测定
土壤脲酶测定（专用）关松荫苯酚-次氯酸钠比色法测定土壤脲酶活性（Sunny-zhao）1 方法原理脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物内。
它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨、二氧化碳和水。
土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。
根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤，所以人们常用土壤脲酶活性表征土壤氮素的状况。
土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定为水解的尿素量来求得。
本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨在强碱性介质与苯酚——次氯酸钠的作用生成蓝色的靛酚，其颜色深浅与溶液中的NH4+-N含量成正比，进而分析脲酶活性。
2 试剂和材料2.1 甲苯分析纯。
2.2 10% 尿素：称取10 g尿素，用水溶至100 ml。
2.3 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.7）：184 g柠檬酸和147.5 g氢氧化钾溶于适量蒸馏水中，用水稀释至950 ml，用1 mol/L NaOH将pH调至6.7，最后用水定容到1000 ml。
2.4 苯酚钠溶液（1.35 mol/L）：62.5 g苯酚溶于少量无水乙醇，加2 ml甲醇和18.5 ml丙酮，用无水乙醇稀释至100 ml（A溶液），存于冰箱；27 g NaOH溶于100 ml水（B液）。
将A、B保存于冰箱中。
使用前将A、B液各20 ml混合，用蒸馏水稀释至100 ml。
2.5 次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%。
（根据分析纯原有活性氯含量而定）2.6 氮的标准溶液：精确称取0.4717 g硫酸铵溶于水并稀释至1000 ml，得到1 ml 含有0.1 mg的氮的标准液。
3 主要仪器恒温培养箱，可见分光光度计。
4 分析步骤4.1 标准曲线的测定将标准溶液稀释10倍（吸取10 ml标准液定容至100 ml）制成氮的工作液（0.01 mg/ml）。
从其中分别吸收0，1.00，3.00，5.00，7.00，9.00，11.00，13.00 ml移至50 ml容量瓶，加水至20 ml，再加入4 ml苯酚钠溶液，充分混合。
脲酶的分离纯化及比活性测定
General principles of protein purification
Complicated and specific “Black art”
SOURCE OF MATERIAL
• Concentration: choose tissue, organism with high production/concentration of target protein • Developmental stage: Does level of protein change with development? • Subcellular localization • Use of expression system
4
0.4 0.8 2.6
5
0.5 1 2.5
6
0.6 1.2 2.4
7
3
混匀
奈氏试剂 A480 0.75ml, 混匀，测A480
硫酸铵标准曲线制作
1.2 1.0 0.8 A480
NH3的μmol数 = A480 K
0.6 0.4 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 含NH3的μmol数
脲酶活性检测-2
2. 酶促反应
洗脱液 空白 粗提液 (1:20稀释)
1
3%尿素(ml) 0.5 0.1M PBS 酶液 H2O 1.0 -0.5 0.5 1.0 0.5 --
2
0.5 1.0 0.5 --
3
0.5 1.0 0.5 --
…
0.5 1.0 0.5 --
9
0.5 1.0 0.5 --
10
1
上述反应液 0.5
2
3
…
9
脲酶利用实验报告
一、实验目的1. 了解脲酶的催化作用及其活性测定方法。
2. 掌握通过比色法测定脲酶活性的实验操作。
3. 分析影响脲酶活性的因素。
二、实验原理脲酶是一种以尿素为底物的酶，可以将尿素水解成氨和二氧化碳。
在酸性条件下，氨与苯酚-次甲基蓝试剂发生反应，生成蓝色络合物。
通过测定蓝色络合物的吸光度，可以计算出脲酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 脲酶- 尿素- 苯酚-次甲基蓝试剂- 酸性缓冲液- 水浴锅- 分光光度计- 移液器- 容量瓶2. 实验仪器：- 移液器- 容量瓶- 烧杯- 试管- 滴定管- 精密天平四、实验步骤1. 准备工作：- 配制脲酶溶液：将脲酶用磷酸盐缓冲液稀释至适当浓度。
- 配制苯酚-次甲基蓝试剂：按照试剂说明书配制。
2. 实验操作：（1）取一只试管，加入一定量的脲酶溶液。
（2）向试管中加入适量的尿素溶液，混匀。
（3）将试管放入水浴锅中，保持一定温度。
（4）定时取样，用移液器将样品转移至另一只试管中。
（5）向试管中加入苯酚-次甲基蓝试剂，混匀。
（6）用分光光度计测定吸光度。
3. 数据处理：- 计算不同时间点的吸光度，绘制吸光度-时间曲线。
- 根据吸光度-时间曲线，确定脲酶的最大活性时间点。
- 根据最大活性时间点，计算脲酶的活性。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 通过实验，成功制备了脲酶溶液。
- 实验过程中，吸光度随时间逐渐增加，表明脲酶活性逐渐增强。
- 在最大活性时间点，吸光度达到最大值。
2. 分析：- 实验结果表明，脲酶活性受温度、pH值等因素的影响。
- 在一定范围内，温度升高，脲酶活性增强；温度过高，酶活性反而降低。
- 在一定范围内，pH值适宜，脲酶活性增强；pH值过高或过低，酶活性降低。
六、结论1. 成功制备了脲酶溶液，并成功测定了脲酶的活性。
2. 脲酶活性受温度、pH值等因素的影响，在一定范围内，温度升高、pH值适宜，脲酶活性增强。
3. 本实验为脲酶的活性研究提供了实验依据。
脲酶的分离纯化及比活性测定
脲酶的分离纯化及比活性测定实验原理：脲酶分子量较大，脲酶粗制品通过交联葡聚糖Senhadex G－150层析柱。
酶本身不能进入凝胶颗粒的网络内，而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒。
用蒸馏水作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离的目的。
酶活性测定系根据酶催化尿素水解释出氨和CO2的作用。
定时或定量收集洗脱液，分光光度计测其吸光度，以280nm吸光度为纵坐标，收集管号为横坐标，绘制脲酶粗制品的蛋白质分离洗脱曲线。
再分别测定洗脱峰内各管的酶活性，以酶活性为纵坐标，相应管号为横坐标，会出酶活性曲线，酶活性曲线与蛋白质洗脱曲线中峰值重叠部位即为分离所得到的脲酶所在部位。
用Nessler试剂使氨显色来比色测定，从而计算脲酶活性。
仪器、材料和试剂器材：层析柱φ1.2mm/cm×20cm 恒温水浴 751或752紫外分光光度计 721分光光度计试剂：1、3%尿素。
2、0.1mol/L pH6.8磷酸盐缓冲液称取Na2HPO4·12H2O 8.7745g 溶于蒸馏水中，定容到500mL。
3、1 mol/L HCl。
4、32%丙酮溶液。
5、纳氏（Nessler）试剂。
6、0.001mol/L标准硫酸铵溶液取0.01 mol/L标准硫酸铵溶液10 mL至100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，即为0.001mol/L标准硫酸铵溶液。
实验步骤1、硫酸铵标准曲线的制作取试管7支，编号，按下表操作：加入Nessler试剂后，立即混匀。
在721分光光度计480nm波长比色。
以测定得到的吸光度为纵坐标，所含NH3的微克分子数为横坐标，绘制标准曲线。
2、样品的制备（1）称取0.5g大豆粉置于小三角瓶中，加入32%丙酮2.5ml,振摇10min(充分混匀)进行提取,然后倒入离心管中，用 32%丙酮1ml 洗小三角烧瓶一次，洗液也倒入离心管中，离心10 min（4000rpm）。
蛋白质与酶工程实训报告
2014-2015学年第二实践学期蛋白质与酶工程综合实训报告专业：生物技术班级： B1204*名：***学号： **********指导教师：***二○一五年七月六日100g/LZnSO4 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 蒸馏水 3 3 3 3 3 0.5 mol/L NaOH 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 充分摇匀，室温下静放5min，过滤，另取5支中试管，同上编号，按下表加入试剂滤液（mL） 1 1 1 1 1 蒸馏水（mL） 2 2 2 2 2 显色液（mL） 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 迅速摇匀，用分光光度计在420 nm 下测定各管A 值。
5支试管在420 nm 下各管A 值分别为0.294、0.278、0.254、0.243、0.180三、实验结果:以尿素终浓度1/C为横坐标，1/A（1/v）为纵坐标作图，然后依1/C找出对应1/A点，将各点连线并延长与1/C轴相交，得- 1/Km ，计算出Km（以x×10-nmol·L-1表示）。
1/C 100 150 200 2501/A 1.01 1.02 1.08 1.12Km值代表酶的亲和力，km值越大亲和力越小，反之则越大。
三、实验结果：测得糖浆液重：45.5g实训三、不同浓度果胶酶对澄清果汁收得率的影响所需药品与仪器：药品：桃子、果胶酶溶液、抗坏血酸溶液、明胶、活性炭。
仪器：榨汁机、水果刀、PH试纸、温度计、定性滤纸、量筒、烧杯、刻度试管、恒温水浴器等。
一、实验原理桃汁中存在的果胶，有很强的保护胶体的作用，能保持稳定的浑浊度，同时，果胶溶液粘度大，如果不加处理，过滤是困难的，而且即使过滤之后，在果汁中所存在的果胶和其它高分子物质，在贮藏中，由于分解、与金属离子结合及其他作用，也会产生凝固沉淀，因此，在过滤之前，必须先进行澄清，常用的澄清方法主要有自然澄清法和热处理法、冷冻法、酶法、加澄清剂法、离心分离法、超滤法等。
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实验四脲酶活力测定(纳氏试剂比色法)
一、实验原理
脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。
反应式：
(NHO2CO+ HO ^脲酶＞2NH3 + CO2
氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。
反应式：
NH・ F2O+ 2KHgl4 + 3KOH ■—HgO • HgNH + 7KI + 3H 20
(纳氏试剂) (碘化氨氧合汞)
二、实验步骤
将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作：
取3支干净干燥试管，编号：1空白；2、标准；3、样品。
按下表步骤加入实验制备的酶液及试剂：
(7)从样品管加尿素开始计时，准确反应5min,立即向样品管(3号管)加1 mol -L HSQ 1.00mL，终止反应。
(8)另取3支干净试管，分别对应于上面各反应液进行显色
(9)各管混匀后，30min内，用分光光度计测试:
比色记录A260nm A i A A3
三、结果计算
脲酶活力(U • mL -1) = ( A 3 - A 1 ) *标准管中的NH微摩尔数
(A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数
式中：n为酶样品的稀释倍数
四、仪器和试剂
1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。
2、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷酸盐缓冲液适当稀释。
3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。
4、磷酸盐缓冲液（pH7.0）: 6.70 g Na2HPO4 • 2 H2O , 3.25 g KH2PO4，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。
5、 1 mol • L -1 HSQ溶液：56mL浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL蒸馏水的容量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。
6、硫酸铵标准溶液：称取在60° C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL。
此溶液含NH3为40卩mol • mL-1。
7、纳氏试剂：分别溶解3.5g 氯化高汞（HgCl2）于20mL热蒸馏水，10g碘化钾于5 mL水中，再将前者慢慢倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红色的少量沉淀为止。
向此液中加70 mL30% KOH不断搅拌，再滴HgCl2溶液至出现红色沉淀为止。
混匀，静置过夜，倾出清液贮于棕色试剂瓶（用橡皮塞）中放置暗处保存。
在有碘化汞情况下，可溶10 g HgI2 和7 g KI 于少量蒸馏水中，另溶16 gNaOH 于50mL 水中，待冷却后，将前者慢慢倒入其中，边加边搅拌，最后用水定容至100 mL 。
过夜澄清后，倾出上清液存于棕色试剂瓶中。
（配置方法之二）。