产蛋白酶芽孢杆菌

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产蛋白酶波茨坦短芽孢杆菌的鉴定及产酶条件优化

产蛋白酶波茨坦短芽孢杆菌的鉴定及产酶条件优化
梁安健;石沁兰;王金丽;朱成林;邹立扣;朱鹏程;李东亮;唐俊妮
【期刊名称】《现代食品科技》
【年(卷),期】2024(40)5
【摘要】该研究旨在提高一株环境分离菌株的产酶效率,为后续菌株及其蛋白酶的应用提供前期实验基础。

通过水解圈法初步检测菌株S8的产蛋白酶能力,并通过16S rRNA序列比对确认其为波茨坦短芽孢杆菌。

通过单因素试验确定了最佳培养条件和培养基添加成分。

并采用Plackett-Burman设计和最陡爬坡试验对培养条件和培养基进行响应面优化。

优化结果显示,在发酵时间为38.70 h、菌液接种量为1.84%(V/V)、发酵温度为35℃、酵母粉添加量为23.70 g/L、胰蛋白胨添加量为11.70 g/L、MgSO4添加量为20.20 g/L的条件下,菌株的产酶活力可达到114.79 U/mL,相比优化前提升了209.70%。

研究结果为该菌株的后续发酵应用提供了科学数据。

【总页数】11页(P73-83)
【作者】梁安健;石沁兰;王金丽;朱成林;邹立扣;朱鹏程;李东亮;唐俊妮
【作者单位】西南民族大学食品科学与技术学院;四川农业大学资源学院;四川中烟工业有限责任公司
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
【相关文献】
1.产几丁质酶侧孢短芽孢杆菌M64的产酶条件优化及部分酶学性质研究
2.产蛋白酶菌的分离鉴定及产酶条件优化
3.耐酸产蛋白酶芽孢杆菌SD48菌株液体发酵豆粕产大豆肽条件的优化
4.一株产胶原蛋白酶细菌的鉴定及产酶条件优化
5.1株产蛋白酶菌株的分离鉴定及其产酶条件的优化
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产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化

大庆师范学院本科生毕业论文蛋白酶产生菌培养条件的条件优化院(部)、专业生命科学学院生物技术研究方向微生物学学生姓名朱琳学号200901122598指导教师姓名张亦婷2013年06月01日摘要采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。

通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。

关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化AbstractThe sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃.Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization目录摘要 (1)Abstract (2)1 引言 ...........................................................................................................................................................2 材料与方法 (3)2.2.2 实验材料 (3)2.2.1 菌株筛选 (3)3.1 菌株筛选 (6)3.1.1 菌株的分离筛选 (6)2.3 条件优化 (7)2.3.1 不同碳源对产酶的影响 (7)2.3.3不同氮源对产酶的影响 (8)2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响 (9)2.3.5 不同温度对产酶的影响 (10)4 结论 (10)11 引言蛋白酶是催化蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。

高产蛋白酶活性的枯草芽孢杆菌筛选及鉴定

ＣＨＥＮＧＤｅ — ｙｏｎｇ，ＭＩＡＯＬｉ・ｂｎｇ
（ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｉｒｎｇ，ＷｕｈａｎＰｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００２３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｗｅｎｔｙｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅａｓｅｓｐｒｏｄｕｃｉｎｇＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄｆｒｏｍｓｏｉｌｕｓｉｎｇｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔｃｉｒｃｌｅｍｅｔｈｏｄ．Ｓｉｘｏｆｔｈｅｍｓｈｏｗｅｄｌａｒｇｅｒｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔｃｉｃｌｒｅｄｉａｍｅｔｅｒａｎｄｏｈｅｔｒｈｒｔｅｅｃｏｍｍｅｒｃｉｌｌａｙａｖａｉｌ —
ｒｔｅｅｓｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙＭＥＧＡｓｏｆｔｗａｒｅ．ｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｒｔａｉｎＣＤＹ－１ａｎｄＣＤＹ－５ｗｅｒｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉ —

蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告

蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告学院：生物科学与工程学院专业：生物技术班级： 1班姓名：学号：摘要：蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。

当前，食品工业用酶主要来自微生物，尤其是蛋白酶的应用最为广泛。

作为一种生物催化剂,它具有催化反应速度快,无工业污染,催化反应条件适应性宽等的性质和优点。

由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[2] 。

微生物由于具有生长速度快、所需生长空间小、广泛的生化多样性及其遗传可操作性等特点,因而备受人们青睐。

本文主要进行了菌种的生长曲线的绘制与菌种最佳发酵产酶时间等方面的研究。

关键字：蛋白酶生长曲线酶活力第一章前言1.1研究的目的与意义蛋白酶是工业酶中用得最多的一种酶，是催化蛋白质肽键水解的一类酶,它作用于蛋白质,将其分解为蛋白胨、多肽及游离氨基酸[1] ，约占酶总量的 60%，其中碱性蛋白酶就占25%。

有调查显示，酶制剂市场量最大的是洗涤剂用酶，第二位是淀粉加工用酶，以后依次为乳制品加工业、制酒工业、纺织工业和饮料加工业等用酶[2]。

与动、植物来源的蛋白酶相比，利用微生物产的蛋白酶有易于培养、生长快、产量高、易于提取，适于大规模工业化生产，培养基的成本相对较低等优点，使微生物成为生产蛋白酶的重要来源和首选材料。

1.2 国内外研究概况1.2.1 微生物蛋白酶的分类由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[3]。

当前工业用酶主要来源于微生物，微生物来源的蛋白酶按其作用的 pH 值的不同可分为三类，即碱性蛋白酶、中性蛋白酶及酸性蛋白酶，它们作用的最适 pH 值分别为碱性、中性及酸性。

1.2.2在食品工业中的应用蛋白酶在食品工业上的应用主要是用在制干酪，蛋白质水解调味液，烤焙食品，肉类嫩化，功能性低聚肽和阿斯巴甜的合成等。

02 实验二产中性蛋白酶芽孢杆菌的诱变育种

第二次实验：
（二）诱变处理：

预热：在正式照射前，应先开紫外线30min，让紫
外灯预热。

搅拌：取5ml制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放
入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W
紫外线下30cm处。

照射：打开皿盖边搅拌边照射，所有操作必须在黑
暗或红灯下进行。
第二次实验：
（三）培养：

稀释：在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)
五、参考文献
一、目的意义
1、通过紫外线诱变的方法，筛选获得一
株高产中性蛋白酶的突变菌株。
二、材料方法
关键技术:

实验原理
技术路线
紫外线诱变
紫外线诱变育种的原理紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对
诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一
般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80% 是254 nm。
紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA
变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸
收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。
（五）突变株的筛选
1. 初筛（以量为主）方法需简便、快速
2步
初筛复筛
（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性（2）根据平板颜色反应直接挑选透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）；抑菌圈法（抗生素）；变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）；沉淀圈法（外毒素）透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标） 2. 复筛（以质为主，定量测定）摇瓶培养，直接检测所需产物

一株产大豆蛋白酶的芽孢杆菌发酵条件的优化

ｃｍｐｒｄｔｎｒａｉｎｔｏｅｏａｅｏｉｏｇｎｃｉｇｎ，ａｐｏｒａｅｎｕｅａｐｏｏｅｅｚｍｅｒｄｃｉｎｒｐｒｐｉｔｉｄｃｒｃｎｒｍｔｎｙｐｏｕｔ．Ｔｈｒｔａｅｈｗｓｏｅｐｏｅｓｓｏｈｓｅｅｉｈｖｏ，ａｇｕｎｉｅｆｐｏｅｓｓｃｎｂｂａｎｄｉｈｔｔｎｒｈｓ．ｅｏｔｍａｕｔｒｙｔｒｔｂｅａｉｒｌｒｅｑａｔｉｓｏｒｔａｅｐａｅＴｈｐｉｌｃｌｅｃｔｏｕ
ＯｉＬＡＧＪｇｊａ，ＡＧＺｎ－ｅＵＰｎ，ＩＮｎ－ｕｎ‘ ＰＮｏｇｗｎｇｉ
（．ｚｏｎｖｒｉ，ｚｏ４８０，ａｇｉＣｉａ２ＣｌｇｆｉｃｅｃｎｅｈｏｏｙＧｕｎｘＵｉｅｓｙ１ＨｅｈｕＵｉｅｓｙＨｅｈｕ５２０Ｇｕｎｘ，ｈｎ；．ｏｌｅｆＳｉｎｅａｄＴｃｎｌｇ，ａｇｉｎｖｒｉ，ｔｅｏＬｅｔ
ｓｏｄｔａｒａｉｉｏｅｓｍｕｈｂｔｅｏｐｏｔｔａｎＤ－１９’ ｒｗｔｎｙｔｅｉｆｅｚｍｅｈｗｅｈｔｏｇｎｃｎｔｇｎｉｃｅｔｒｔｒｍｏｅｓｒｉｒ６－Ｓｇｏｈａｄｓｎｈｓｓｏｎｙ，
Ｎｎｉｇ５００ＧａｇｉＣｉａａｎｎ３０５，ｕｎｘ，ｈｎ）
Ａｂｓｒｃ：ｅｃｌｕｅｏＢａｉｕｐ．ｔａｔＴｈｕｔｒｆｃｌｓｓＤ－１－ｒｐｉｚｄｆｒｔｅｐｄｃｉｎｏｏｂａｒｔａｅＴｈｅｕｔｌ６９ｗｅｅｏｔｍｉｅｈｒｕｔｏｆｓｙｅｎｐｏｅｓ．ｅｒｓｌｓｏｏ

蛋白酶产生菌的分离

蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。

本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。

也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。

本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。

通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。

1 实验材料1.1 实验样品校园内土壤样品1.2实验仪器与材料牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（ pH 5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。

2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法1.称量按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。

2.溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。

待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

3.调pH4.分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。

5．包扎塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

6．灭菌将上述培养基以1.02kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃， 15-20min高压蒸汽灭菌。

如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

产蛋白酶芽孢杆菌的筛选及其发酵对豆粕的影响

Keywords: Bacillus; protease; fermented soectron microscopy; X-ray diffraction
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180808-073
中图分类号：TS209
本研究筛选到1 株高产蛋白酶的芽孢杆菌，通过形态学、生理生化鉴定，以及进化树的构建，结果显示其是 1 株暹罗芽孢杆菌。研究芽孢杆菌发酵对豆粕化学成分的变化以及对豆粕蛋白的微观结构影响，本实验可为进一步研究微生物发酵对豆粕蛋白结构影响提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与培养基脱脂豆粕吉林华展生物工程有限责任公司；脱脂
乳粉新西兰恒天然集团。改良LB液体培养基：酵母浸粉3 g/L、蛋白胨
10 g/L、氯化钠10 g/L、葡萄糖3 g/L，121 ℃高压灭菌 20 min。改良LB固体培养基：改良LB液体培养基添加
16 g/L琼脂粉。豆粕发酵培养基：10 g豆粕（过20 目筛）、0.2 g红糖、10 g蒸馏水，搅拌均匀，115 ℃高压灭菌15 min。脱脂乳固态培养基：脱脂乳粉50 g/L、琼脂粉 1.5 g/L，115 ℃高压灭菌15 min。 1.2 仪器与设备
24 h at 37 ℃ and at a water content of 50%. Moreover, the SEM images revealed that fermentation signiﬁcantly changed
the microstructure of soybean meal protein, making it looser. The X-ray diffraction patterns showed that the backbone of

土壤中产蛋白酶芽孢杆菌的筛选

土壤中产蛋白酶芽孢杆菌的筛选一、实验目的要求1、了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术2、掌握从土壤中筛选产蛋白酶菌株的原理及方法3、学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法4、培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力二、实验基本原理土壤微生物类群在全球自然生态系统中具有不可替代的作用，它推动着生态系统的能量流动和物质循环，是生态系统的重要组成部分。

芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，多数为碱性菌，主要分布于土壤、动植物体及水体中。

微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。

因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

从而得到所需的菌株。

并且自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。

水解圈与菌落直径的比值，被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。

三、实验材料和试剂器具和其他用具：盛有9ml无菌水试管4支、培养皿10个、锥形瓶250ml、500ml各一个、无菌移液管4根、吸管、玻璃涂棒、电子天平、水浴锅、恒温培养箱、烧杯、报纸、土壤样品、高压灭菌锅、记号笔、显微镜、载玻片、盖玻片、酒精灯、接种环、尺子。

试剂：蛋白胨、牛肉膏、Nacl、琼脂、脱脂奶粉、酵母膏、葡萄糖、(NH4)2SO4、MgSO4.7H2O、K2HPO4、香柏油、二甲苯。

（注：牛奶平板、牛肉膏蛋白胨培养基、淡薄培养基）革兰氏染色：革兰氏染色、草酸铵结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红复染液芽孢染色：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液1、取样在家畜饲养的地方，从地表下10~15cm的土壤中用无菌小铲取土样，并记录取样的地理位置。

2 、采集取一小方土样均匀在纸上，然后再纸的四角和中心各取2g土壤样品，混匀形成10g土样。

3 、灭菌将10g土样放入100ml无菌水中并置于250ml的三角瓶中，然后放入水浴锅中加热（80℃）处理10min。

地衣芽孢杆菌产碱性蛋白酶论文

地衣芽孢杆菌产碱性蛋白酶可行性分析1研究背景芽孢杆菌是一类需氧或兼性厌氧G+(目前也发现有G-)，在一定条件下能产生抗逆性内生孢子的化能异养菌。

在自然界分布非常广泛。

生理特性丰富多样。

是土壤和植物微生态优势种群之一。

它可产生多种抗生素，包括脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类、核酸类物质，对多种动、植物及人类病原菌起到很好的抑制作用。

而且芽孢杆菌还具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性。

地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中较具应用潜力的菌种之一，地衣芽孢杆菌能产生多种抗菌物质，对一些植物病原菌有较好的抑制作用。

2 产品目标和研究内容蛋白酶是最重要的工业用酶之一，约占世界上酶生产总量的60%。

在各种蛋白酶中，微生物蛋白酶在生物技术的加工过程中具有重要作用。

其中，碱性蛋白酶是一种重要的工业用酶，它们被广泛应用于洗涤剂、食品、药品以及皮革的生产制造，蛋白质的水解、电影工业以及工业废水的处理等领域。

碱性蛋白酶是指在pH 值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类，其最适pH 值一般为9～11，属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，除可催化蛋白质水解为氨基酸外，在有机溶剂中还可催化多肽的合成。

碱性蛋白酶外观为褐色粉末，有酵曲的特殊臭味，能够分解蛋白质分子中的肽键成为小分子的氨基酸和肽。

碱性蛋白酶在配置洗涤剂中，50℃时，除去蛋白质的污渍、汗迹以及蛋白质类的食品污渍。

粉状洗涤剂用的颗粒碱性蛋白酶的质量要求为无粉尘、安全卫生，同洗涤剂相容性好，在洗涤剂中稳定性好等。

3研究的方法与技术路线虽然有许多微生物可以分泌碱性蛋白酶，但只有那些产酶活力高的菌株受到关注。

因为只有碱性蛋白酶产量高的菌株才可能在实际的工业生产得到应用。

目前提高菌株碱性蛋白酶产量的途径主要有两条，一是对菌株进行改造，地衣芽孢杆菌经各种理化因素诱变，原生质体诱变和菌种加热选育等方法，选育出高产菌株。

1．获得高产菌株的诱变过程对C121 31E行了2O余次各种理化因素处理，摇瓶发酵进行初筛和复筛，获得高产菌株的诱变过程见表1．因紫外线、亚硝基弧抗链霉素等诱变后，表现出正交效果而未列出。

03 实验三产中性蛋白酶芽孢杆菌的发酵复筛

一、目的意义
通过液体发酵法产生中一株高产中性蛋白酶的菌株。
二、材料方法
关键技术:
标准曲线的制作液体发酵产酶 Folin-酚法测定中性蛋白酶活性
技术路线：
标准曲线的制备
出发菌株（纯化）突变株分离
初筛（水解圈法）复筛（发酵法）
酵培养基中；
培养：37℃，180rpm摇床振荡培养；取样：分别取24h、48h发酵液测定其酶活。
第三次实验：
（一）酶活测定：参照《GB/T 23527-2009 蛋白酶制剂》
第三次实验：
（二）菌种鉴定方案讨论：（三）菌种鉴定试验准备
三、数据结果
四、讨论分析
标准曲线 Folin-酚法测酶活 ……
生产性能实验菌种鉴定菌种鉴定
第一次实验：
讨论并设计实验方案；实验材料准备：活化培养基、发酵培养基
等；活化：LB培养基，37℃摇床振荡16-24h
活化液体培养基
蛋白胨：10.0g；酵母膏：5.0 g；氯化钠：10.0g；蒸馏水：1000ml pH到 7.0。
发酵液体培养基
葡萄糖：2.5g；蛋白胨：5.0g；酵母膏：2.5 g；氯化钠：2.5g；蒸馏水：1000ml pH到 7.0。
第二次实验：
（一）标准曲线的制备：参照《GB/T 23527-2009 蛋白酶制剂》蛋白酶制剂：
第二次实验：
（一）标准曲线的制备：蛋白酶活性定义：
第二次实验：
（一）标准曲线的制备：标准曲线：
第二次实验：
（一）标准曲线的制备：标准曲线：
第二次实验：
（二）发酵：接种：将活化好的菌液按照2%接种量，接种至发
微生物学实验技术

产蛋白酶菌株的分离

产蛋白酶菌株的分离一、教学目标及基本要求1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法二、实验原理枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。

枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。

由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。

但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。

例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。

又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。

1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。

由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。

2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。

利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。

根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。

3. 枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。

有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。

菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。

在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。

菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。

4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。

蛋白酶的生产和应用

注：PFP．二异丙基磷酰氟甲基磺酰氟 Ph 马铃薯蛋白酶抑制剂 EDTA：乙二胺四乙酸
PCMB：对氯汞苯甲酸 PMSF．"苯 DAN：重氮乙酰正．DL．亮氨酸甲酯 OP：郯二氮杂菲)(菲绕啉)
2．关于微生物蛋白酶的生产
蛋白酶是用途最广泛的酶制剂之一，主要用于洗涤剂，制革、毛皮、蛋白水解物、酿酒、酱油，以及纺织、医药品、化妆品等的生产上。全球蛋白酶的销售额占酶制剂市场的60％，我国2005 年全国(外资合资企业不计)微生物酶制剂产量约48 万吨，总销售额约20 亿人民币，其中蛋白酶约10 万吨，销售额近9 亿人民币。
15表4我国碱性蛋白酶的研究菌种研究者说明地衣芽孢杆菌上海合成洗涤荆厂从进口洗衣粉中分离得到27091965地衣芽孢杆菌复旦大学新型发酵厂发酵罐40h产酶50006000umi27091971短小芽孢杆菌沈阳林土所1974土壤分离lom3发酵罐20h产酶6000umi289短小芽孢杆菌河南省皮革研究所土壤分离10m3发酵罐25h产酶5000uml209短小芽孢杆菌天津酶制剂厂1975209地衣芽孢杆菌上海市工业微生物研原生质诱变25m3发酵罐30h产酶2709a5究所19914000um1地衣芽孢杆菌天津市工业微生物研人工诱变产酶21000uml2709c1213究所天津酶制剂厂19841993地衣芽孢杆菌中科院微生物研究所土壤分离经人工诱变获得发酵产酶553f13那淑敏等19880000uml短小芽孢杆菌突中科院微生物研究所广西甘蔗渣分离经人工诱变获得3m3变株smip邱秀宝等1990发酵罐产酶18000uml地衣芽孢杆菌兰州大学薛冯等分离菌种no53经原生质诱变得到摇瓶533861997104uml提高到22080uml工程菌bp071无锡轻工业大学唐雪产酶24480uml明等2002工程菌a16河北大学潘延云等由地衣芽孢杆菌2709与含碱性蛋白酶基因2002克隆载体pdw2的工程菌枯草杆菌bdl05进行细胞融合得到产酶30000uml黄海杆菌突变株张云波等2000以黄海杆菌ys9412130的突变s形r104ys9412130sw140原生质体作复合诱处理获得的碱性低温蛋白酶20测定酶活3912uml短小芽孢杆菌杨文博等1994ntg处理原生质得到产酶13977umlc1724153酸性蛋白酶酸性蛋白酶首先由日本吉田文彦于1954年所报道1963年黑曲霉酸性蛋白酶产品molsin问世

一株高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌及其应用[发明专利]

专利名称：一株高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌及其应用专利类型：发明专利
发明人：江伟,于佳俊,耿晓杰,裴海生,张晓蒙,闫寅卓,金玮鋆申请号：CN202010874221.7
申请日：20200827
公开号：CN111909880B
公开日：
20220329
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一株高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，命名为解淀粉芽孢杆菌Q4(BacillusamyloliquefaciensQ4)，于2020年4月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNO.60998。

本发明还提供由上述解淀粉芽孢杆菌Q4制备而成的青稞小曲，以及利用上述解淀粉芽孢杆菌Q4或由其制备的青稞小曲对青稞进行发酵来制备青稞酵素的方法。

本发明的解淀粉芽孢杆菌Q4可作为制作西藏地区特色青稞小曲的功能性菌株，并应用于西藏特色的青稞酵素产品，本发明应用价值高，具有一定的社会和经济效益。

申请人：农业农村部规划设计研究院,中国食品发酵工业研究院有限公司
地址：100125 北京市朝阳区麦子店街41号
国籍：CN
代理机构：北京智绘未来专利代理事务所(普通合伙)
代理人：郭红燕
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产角蛋白酶芽孢杆菌的分离筛选与鉴定

产角蛋白酶芽孢杆菌的分离筛选与鉴定
韩学易;陈惠;胥兵;赖欣
【期刊名称】《农技服务》
【年(卷),期】2008(025)004
【摘要】从长期堆积腐烂羽毛的土壤中分离出一株能降解羽毛角蛋白的细菌,经形态学观察和生理生化试验,初步鉴定为短小芽孢杆茸,且命名为短小芽孢杆茵B-15.【总页数】2页(P121-122)
【作者】韩学易;陈惠;胥兵;赖欣
【作者单位】四川农业大学生命科学与理学院,四川雅安,625014;四川农业大学生命科学与理学院,四川雅安,625014;四川农业大学生命科学与理学院,四川雅
安,625014;四川农业大学生命科学与理学院,四川雅安,625014
【正文语种】中文
【中图分类】X703
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3.响应面法优化芽孢杆菌CJPE209产角蛋白酶发酵培养基的研究 [J], 蒋彪;王常高;杜馨;林建国;蔡俊
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一株生产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其应用[发明专利]

专利名称：一株生产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其应用专利类型：发明专利
发明人：路福平,房红磊,周翠霞,张会图,李玉,刘逸寒
申请号：CN202010857565.7
申请日：20200824
公开号：CN112239742A
公开日：
20210119
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：发明属于基因工程领域，具体涉及一株生产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其应用。

所述菌株采用的宿主细胞是在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)2709的基础上，通过敲除eps、pgs、sigF、chiAB、pulA、amyA、lchAC、upp基因，并删除9个基因组岛以实现宿主细胞的基因组精简来构建的。

在经过改造的宿主菌种构建整合aprE表达盒，双拷贝的重组菌比宿主的酶活力提高37.45％，三拷贝的重组菌比双拷贝的重组菌酶活力提高9.36％。

申请人：天津科技大学
地址：300457 天津市滨海新区经济技术开发区第十三大街29号
国籍：CN
代理机构：北京瑞盛铭杰知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：栗华楠
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林芝产弹性蛋白酶嗜碱芽孢杆菌的分离及鉴定

ｓｕｈｅｏｓ ’ ｓｉａｄｓｗｇｆａｉｏｎｉｙｇｈ，ｎｏｔ．ｈｔ（ＣｏｙｒｌｓｆｌｓｎｆｒｄｌｇｔｒｕｅＳｏｎｅａｅｏｙＴｗＮｉｃｉａｄｉｌｅｉＴｅｒｉＨ）ｆｄｙｉｏａｔｍｅａｈｌＢｎｎｓａｄｔａｏＨｏｓｅｉｏｔｎｐｒｎｉｌｄａｅｅｅｄａｅｒｆｔｏｎｅｌｇｓａｓａｃｂｅｔＴａｓａｅｔｉｌｄａｅｒａｄｒｓａｅｔｒｅｉｔｔｔｉｍｔｅｃｌｙｉｔａｅｔｓｅｅｒｈｏｊｃ．ｒｎｐｒｎｒｅｉｍｔｎａｃｃｍｒｏｈｅｏｈｏｓｈｒｒｃｃｅ
第４７卷（第１５研）昆６
马长中等：林芝产弹性蛋白酶嗜碱芽孢杆菌的分离及鉴定
５３
业的发展具有重要的意义。
１材料与方法
１１材料．１．主要试剂．１１
株在平板上的弹性蛋白水解圈和菌落，把平板上的菌落直径和弹性蛋白水解圈直径之比值（Ｃ）大Ｈ最的菌落编号为Ｂ以它作为研究对象，Ａ，进行形态学
２结果与分析
２１形态学鉴定结果．
２１１个体形态特征．．
菌株ＢｚＡ的个体形态如图１。该菌为革兰氏阳
分离培养基［用Ｈｒｏｈ培养基，ａ１改６３采ｏｉｓｉｋＮＣ量
为５／。ｇＬ
性菌，菌体呈直杆状，两端钝圆，宽Ｘ为０５ｘ～长．１ｍ０８￣１３．ｐｍｘ．ｍ～ｍ。芽孢中生、圆状。无荚膜。２椭

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北方民族大学学生实验论文论文题目:产蛋白酶芽孢杆菌的分离、纯化与选育
院(部)名称:生物科学与工程学院
学生姓名:杨嘉怡
专业:生物工程学号:20103371班级:102班
指导教师姓名:刘雅琴
实验小组成员:高瞻，邢艳东，刘帅，阳波
组别:第五组
实验成绩:
北方民族大学教务处制
产蛋白酶芽孢杆菌的分离、纯化与选育
摘要
酶（英语：Enzyme，又称酵素），指具有生物催化功能的高分子物质。

几乎所有的细胞活动进程都需要酶的参与，以提高效率。

酶作为催化剂，本身在反应过程中不被消耗，也不影响反应的化学平衡。

酶具有高度的专一性，只催化特定的反应或产生特定的构型。

酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。

目前已知的可以被酶催化的反应有约4000种。

在生物体内，酶发挥着非常广泛的功能。

由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。

目前，能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。

通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。

许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。

本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。

也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。

生物的遗传信息的改变是通过基因突变、基因重组和基因转移来进行的。

基因突变，又称点突变（point mutation），包括自发突变和诱发突变，前者是未经人为施加诱变剂处理而发生的突变，后者是经人为施加诱变剂处理而获得的突变。

两种突变都是由于一个或几个碱基的增加、缺失或置换而引起的，因此本质相同，不同的只是诱发突变的频率比自发突变的频率要高得多。

这一部分的实验是以紫外线和亚硝基胍为例介绍了物理因素和化学因素对微生物的诱变作用。

本实验中，将筛选出的蛋白酶的产生菌株作为出发菌株通过紫外线对微生物诱变作用，对菌株进行选育工作。

关键字：芽孢杆菌，分离，突变，筛选
1．实验仪器和材料
1.1仪器
显微镜，恒温水浴锅，酒精灯，接种针，无菌移液管，无菌涂布器，无菌试管，量筒，1mL无菌吸管，烧杯，磁力搅拌器，培养皿，高压灭菌锅，玻璃涂棒，游标卡尺血，紫外线等（15W），细胞计数板。

1.2材料及试剂
土壤样品，牛肉膏蛋白胨培养基平板，酪蛋白平板，无菌生理盐水，芽孢染色液。

2实验方法
2.1分离
[1]培养基和试剂的配置
酪素培养基：牛肉膏0.3g,Nacl0.5g，酪素1.0g，琼脂2.0g，蒸馏水100ml，PH7.6-8.0。

产蛋白酶发酵培养基：玉米粉6.0g，豆饼粉4.0g,Na2HPO40.4g，KH2PO40.03g，
Na2CO30.1g，自来水100ml，PH9.0（灭菌前）。

[2]制备土壤稀释液
称取土样1g，放入盛10ml无菌水的三角瓶中，振摇约20min，使土样与水充分
混合，将细胞分散，用一支1ml无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水
的大试管中，充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一个盛有9ml
无菌水的试管中，充分混匀，以此类推制成10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释
度的土壤溶液。

注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管。

将
稀释度为10-4,10-5,10-6的试管放入80℃的水浴锅中处理10min,以杀死非芽孢杆菌。

[3]倒平板
将灭过菌的培养基分别倒平板，倒入培养皿大约15ml培养液。

[4]涂布
在每个平板底部分别用记号笔写上10-4，10-5，10-6三种稀释度，然后用无菌吸管
分别由10-4，10-5，10-6三种稀释液各吸取0.2ml，小心的滴在对应的平板培养基表
面中央，右手拿无菌涂布器放在平板培养基表面，将菌悬液沿同心圆方向轻轻的
向外扩散，使之分布均匀，室温下静置5-10min，使菌悬液浸入培养基。

[5]培养
将培养基平板倒置于32℃温室中培养3天。

[6]挑菌落
将培养后长出的单个菌落进行编号，选择表面干燥，粗糙，不透明的菌落，挑取少
许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。

2.2纯化
[1]从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，接种酪素斜面培养基，32℃
培养3d,测定平板上菌苔直径和水解圈直径。

[2]菌苔直径和水解圈直径比值小的菌株对应的斜面培养物可以作为进行诱变选
育的菌株。

2.3选育
（1）菌悬液的制备：①取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面4-5支，用10ml无菌生理盐水将菌苔洗下，倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌
块。

②用血球计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。

（2）平板制作：将琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板18套，凝固后待用。

（3）紫外线处理：①将紫外线灯开关打开，预热约20分钟。

②取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3ml，并放入一根无菌搅拌棒于
平皿中。

③将上述2套平皿先后置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离为30cm，
功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟和3分钟。

盖上皿盖，关闭紫外灯。

（4）稀释：在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-5
（5）涂平板：取10-3、10-4、10-5三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。

以同样操作，取未经紫外线处理的
菌稀释液涂平板作对照。

（6）培养：将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。

注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。

（7）计数：将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。

同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数
及其致死率。

3实验数据与分析
3.1实验结论
3.1.1紫外线诱变结果：
3.1.2诱变效应
3.2实验结论
（1）在含酪蛋白的平板上，产蛋白酶的芽孢杆菌可形成蛋白质水解圈。

（2）由诱变效应记录表的数据知诱变时间为1min稀释度为10-5的菌落的HC比值大于诱变时间为3min稀释度为10-4的菌落的HC比值，故诱变时间为1min 稀释度为10-5的菌株对应的斜面培养物可以作为进行诱变选育的菌株。

（3）由紫外线诱变结果可知对照组的菌落数为94，诱变时间为1min的存活菌落数为624，可算出其存活率为94/624=64.26%，同理诱变时间为3min的存活菌落数为1600，其存活率为94/1600=17.02%。

（4）各诱变时间的不同存活率不同，且诱变时间短的存活率高，诱变时间长的存活率低。