单克隆抗体制备系统常用液体配制标准SOP操作规程样本
实验室常用液体配制标准操作规程
常用液体配制标准操作规程（SOP）国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心二〇〇八年九月修订目录一、细菌培养系统（责任人：郑子峥）二、DNA操作系统（责任人：罗文新、陈瑛炜）三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕）四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛）五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、）六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉）一、细菌培养系统1、LB培养基:每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨10g，酵母粉5g，用ddH2O 配制，再用10M NaOH调pH至7.4(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。
2、固体培养基:LB培养基中加入琼脂至1.5％，高压蒸汽灭菌15min后使用。
3、10%(g/V) 氨苄青霉素钠（Ap）：注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。
注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。
4、2.5%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan）注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含0.5g卡那霉素。
取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。
注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。
5、细菌培养：配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm 培养。
剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。
6、化学感受态制备：1）原理:：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competent cell）。
单抗制备小鼠免疫SOP
单抗制备免疫一、材料准备：弗式完全佐剂（complete Freunds adjuvant，CFA）弗氏不完全佐剂（incomplete Freunds adjuvant，IFA）实验动物：小鼠（Balb/c）雌性，8周以上,体重20g以上每种抗原蛋白免疫小鼠4只靶抗原：具有免疫原性的抗原或蛋白质、多肽，生理盐水抗原要求：抗原要尽量在无毒无刺激溶液中（PBS或生理盐水），纯度大于80%，浓度1mg/ml以上，总量大于2mg。
抗原尽量是可溶性抗原，溶液为PBS，如必需加入刺激物质，SDS浓度在0.5%以下，尿素在2M以下，不含咪唑，丙烯酰胺等变性剂，要求溶液澄清，无沉淀。
二、实验步骤1.抗原准备：每只小鼠按照100ug/100ul蛋白质或多肽置于生理盐水中制备成抗原。
2.抗原-佐剂的准备：将抗原液与佐剂混合制成乳状液，抗原与佐剂混合按照1：1比例进行，加入搅拌子后于4度搅拌过夜。
注射量为200ul 每只小鼠，抗原量为100ug。
第一次免疫使用弗氏完全佐剂，以后加强使用弗氏不完全佐剂，最后一次加强不加佐剂，免疫前采集阴性血做为对照，乳化因考虑损失，多计算两只小鼠的量。
乳化完全判断标准：挤出一滴乳状液滴于冷水表面以检测乳状液是否稳定，如果液滴散开则继续混合操作直至稳定的乳状液形成。
将乳状液移入1ml注射器。
3.小鼠免疫：将小鼠放在鼠笼上，拉住小鼠尾尖部，背部75%酒精消毒，针头15度角刺入小鼠皮下，挑起注射。
皮下注射共200ul，分5个点（背部皮下任意点）4.冲击免疫：如计划在免疫3d后进行细胞融合实验，则使用水相溶解的游离抗原进行直接脾脏免疫。
过程：将小鼠在固定架上固定，脾脏位置毛剪掉并消毒，快速分别剪开外皮和内皮，将脾脏拉出，吸取100ul/100ug抗原注入脾脏内，并快速用手术线分别缝合内皮和外皮。
5.小鼠阳性血清采集：尾部剪尾采血20ul，用生理盐水稀释10倍，离心收集上清。
6.效价检测：间接法检测小鼠多抗血清效价。
单克隆抗体制备细胞融合实验操作步骤
单克隆抗体制备细胞融合实验操作步骤脾细胞融合培养基：RPMI(500ml)：无血清和其它添加物融合培养基（无HAT）：RPMI（500ml），2mM 谷氨酰胺, 1×NEAA（非必需氨基酸），1×丙酮酸钠，15％FBS（胎牛血清），1×青链霉素溶液，1％杂交瘤克隆因子，1×OPI选择培养基－1（含1×HA T）：RPMI（500ml），2mM 谷氨酰胺，1×HAT，1×NEAA（非必需氨基酸），1×丙酮酸钠，15％FBS（胎牛血清），1×青链霉素溶液，1％杂交瘤克隆因子，1×OPI选择培养基－2（含2×HA T）：(每次融合15个板需150ml)RPMI（ml），2mM 谷氨酰胺，2×HA T，1×NEAA，1×丙酮酸钠，15％FBS，1×青链霉素溶液，1％杂交瘤克隆因子，1×OPI 脾细胞处理：1 应用无菌技术从免疫的兔子身上取出脾2 在100mm 的培养皿中，把脾浸在10ml 不含血清的RPMI培养基中（培养基需是刚从4℃冰箱拿出），并用筛网分离脾细胞。
3 转移所有的脾细胞到一支50ml的离心管中，并用10ml不含血清的RPMI培养基洗培养皿以收取更多的细胞。
4 离心使细胞沉下来，弃去上清，以20ml不含血清的RPMI培养基重新悬浮细胞，让团块下沉下来，并把不下沉的细胞转移至一支新的50ml的离心管中。
5 离心使细胞沉下来，以20ml不含血清的RPMI培养基清洗细胞。
再离心一次，以20ml 不含血清的RPMI培养基重新悬浮细胞，并计数。
6 取300×106脾细胞用于一次融合。
同用于融合的骨髓瘤细胞1 通过离心，收集融合同用的细胞2 弃去上清，并以20ml不含血清的RPMI培养基重悬以洗细胞。
再离心，以20ml不含血清的RPMI培养基重新悬浮细胞，并计数。
单克隆抗体染色方法参考(用于流式)
单克隆抗体染色方法参考（用于流式）一、基本操作流程1. 根据细胞密度，计算出5×105 细胞所要吸取细胞悬液的量，把相应量悬液加到流式管中。
1700 rpm离心5 min，弃去上清。
2. 染色（1）CD8单染：计算出本次CD8单染所需抗体的总量，1:50稀释后，往流式管加入50 μL，4℃避光孵育30 min。
（2）CD4单染：计算出本次CD4单染所需抗体的总量，抗体1:25稀释后，往流式管加入50 μL，4°C避光孵育30 min。
（3）CD8、CD4双染：计算出本次CD4、CD8双染所需抗体的总量，按照CD4:CD8:PBS=2.5:1:50比例稀释液加入到流式管中，4°C避光孵育30 min。
3. 往流式管加入1 mL PBS，1700 rpm离心5 min，去除未结合的抗体，离心后小心吸取上清。
加80~150 μL 流式缓冲液混匀上机检测，流式细胞仪分析染色结果（不超过4 h），当仪器读取到10×104个细胞数就可以分析数据。
如果暂时无法检测，避光储存在4℃。
附：96孔板染色操作步骤：1. 根据细胞密度，计算出5×105 细胞所要吸取细胞悬液的量，把相应量悬液加到96孔板中（U型孔），1700 rpm离心5 min。
2. 抗体稀释按照上述方法，每孔加50 μL抗体稀释液染色，4°C避光孵育30 min。
3. 往孔板中加入200 μL PBS，1700 rpm离心5 min，去除未结合的抗体，离心后小心吸取上清。
每孔加入80 μL流式缓冲液混匀后转移到流式管中。
备注：（1）流式缓冲液：含2% FBS和0.4% 0.5 M EDTA的PBS 溶液；（2）用96孔板板进行染色要注意不同样本要隔开2~3个孔避免交叉污染；（3）染色细胞数量为5×10 5，假设悬液细胞计数为6×106 细胞/1000 μL；（4）我们要取5÷60×1000=83.3 μL悬液才是5×105个细胞数。
实验室常用液体配制标准操作规程
v1.0 可编辑可修改常用液体配制标准操作规程（SOP）国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心二〇〇八年九月修订目录一、细菌培养系统（责任人：郑子峥）二、DNA操作系统（责任人：罗文新、陈瑛炜）三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕）四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛）五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、）六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉）一、细菌培养系统1、LB培养基:每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨 10g，酵母粉5g，用ddH2O 配制，再用10M NaOH调pH至(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。
2、固体培养基:LB培养基中加入琼脂至％，高压蒸汽灭菌15min后使用。
3、10%(g/V) 氨苄青霉素钠（Ap）：注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。
注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。
4、%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan）注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含卡那霉素。
取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。
注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。
5、细菌培养：配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm 培养。
剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。
6、化学感受态制备：1）原理:：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competent cell）。
实验室常用液体配制标准操作规程
常用液体配制标准操作规程（SOP）国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心二〇〇八年九月修订目录一、细菌培养系统（责任人：郑子峥）二、DNA操作系统（责任人：罗文新、陈瑛炜）三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕）四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛）五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、）六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉）一、细菌培养系统1、LB培养基:每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨10g，酵母粉5g，用ddH2O 配制，再用10M NaOH调pH至7.4(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。
2、固体培养基:LB培养基中加入琼脂至1.5％，高压蒸汽灭菌15min后使用。
3、10%(g/V) 氨苄青霉素钠（Ap）：注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。
注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。
4、2.5%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan）注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含0.5g卡那霉素。
取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。
注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。
5、细菌培养：配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm 培养。
剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。
6、化学感受态制备：1）原理:：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competent cell）。
(仅供参考)单抗的制备方法(实验室Protocol)
单抗的制备方法1，免疫BALB/c 小鼠的免疫 BALB/c 小鼠的免疫按常规方法进行，二免后一个星期分别用断尾抽真空法采血200μL 进行抗体检测，二免采血后让小鼠休息两周进行加强免疫，三天后融合。
表1 BALB/c 小鼠的免疫方案（供参考）免疫次数 时间免疫剂量（μg/ mL ） 免疫方法 佐 剂 首免 二免 加强0d21d42d (融合前三天) 100 100 200 颈背部皮下 腹腔注射 腹腔注射 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 不加佐剂2，BALB/c 小鼠的抗体检测2.1 BALB/c 小鼠血清的制备将采集的全血样品于37℃温箱放置30min 后，4℃放置半天，待血清析出后， 4 500r/min ，离心10min ，用移液器吸出血清，4℃放置待检。
2.2 间接ELISA 法的建立BALB/c 小鼠免疫后，用间接ELISA 法对其血清抗体水平进行检测，间接ELISA 法步骤如下：包被： 4℃包被过夜。
洗板：弃去包被液，拍干，向酶标板内加入洗涤液，每孔200μL ，3～5min 后倒掉洗涤液，再拍干。
如此重复三次。
加待检血清：将血清用ELISA 洗涤液从1：10 000开始进行倍比稀释(即 1：10 000、20 000、40 000、80 000、160 000、320 000、640 000、1 280 000)，共8个浓度。
将稀释好的血清按浓度由低至高的顺序加入酶标板内，每孔100μL ，每只小鼠的血清做两列，在37℃温箱内孵育30min 。
同时设阴性血清对照。
洗板：同上。
加HRP 标二抗：工作浓度1：10 000，每孔100μL ，在37 ℃温箱内孵育30min 后，洗板三次。
显色：加底物(TMB-过氧化氢脲)，每孔100μL ，37℃温箱放置10min ，加2mol/L H 2SO 4终止显色反应，每孔50μL ，用酶标仪测定OD 450值。
结果判定：P/N ≥2，判为阳性(P 、N 分别为待检和阴性血清的OD450值)。
DNA操作系统常用液体配制标准SOP操作规程样本
DNA操作系统常用液体配制标准SOP操作规程样本1、溶液 I:葡萄糖50mmol/L，EDTA 10mmol/L，Tris-HCl 25mmol/L，pH8.0。
2、溶液 II:NaOH 0.2mol/L，SDS 1%，用ddH2O现配现用。
3、溶液Ⅲ:取5mol/L NaAc 60mL，冰乙酸11.5mL，混合后加ddH2O至100mL。
4、酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)以25：24：1的比例混匀平衡酚、氯仿、异戊醇，保存于棕色玻璃瓶中，上覆一层Tris-Cl水相，4℃储存备用。
5、TE缓冲液:10mmol/L Tris-Cl (pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，灭菌后使用。
实验室中配有100×的TE母液，用时可用ddH2O稀释成1×使用液，灭菌后使用。
6、0.1mol/L CaCl2:在适量纯水中溶解54g CaCl2.6H2O，定容至100mL，高压除菌后保存于4℃备用。
7、10×DNA上样buffer：母液：以500ml为例：蔗糖：200g，溴酚蓝：0.2g，取去离子水定容至500ml，完全溶解后放置于4℃保存。
*该母液配制完正常颜色为棕红色，颜色与pH值有关；存储时间较长，每次使用时需摇匀，并注意是否长菌。
染料：SYBER Green I（Molecular Probe）10,000×每次取50ul染料加入50ml母液中，充分摇匀。
分装于避光管中，即为10×DNA上样buffer，配制好的buffer均需避光4℃保存。
*配制者需督促使用者及时将避光管放回4℃，并经常检查溶液存量，染料需提前订购。
8、RNase A（DNase free）：RNase A干粉（Ameresco）溶解于0.01mol/L的CH3COONa（pH 5.2）中，使终浓度为1mg/ml，加热至100℃，15min，室温冷却。
用0.1体积的1M Tris-Cl调pH至7.4后，分装，于-20℃冻存。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
二、骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
三、细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程一、免疫准备1）试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂2）常用免疫原：纯化蛋白、融合蛋白、多肽。
3）耗材：1ml、2ml注射器，橡胶管，1.5ml EP管，刀片（或毛细玻璃管），酒精棉球。
4）免疫动物：小鼠（BALB/c,雌性6-8周）5）乳化器（或者手动推）二、免疫过程1）免疫前取血取血方式：酒精棉擦拭尾部后（酒精多了伤口挤压出来的血液易分散），用锋利的刀片在小鼠尾部靠近静脉处划开小口，如下图箭头所示方向从上往下挤压血管，血从伤口处流出后用枪吸取放入EP管中（30ul血够用）离心取上清放冰箱备用。
此方法取血最为简单易行，避免眼球取血毛细管扎瞎老鼠眼睛。
注意点：①避免切断老鼠尾巴②切口劲量靠近尾末端，方便挤压血管③伤口消毒酒精不要太多，不利于伤口血液凝固。
2）免疫原制备：一支2ml注射器吸抗原，另一支注射器吸等量体积佐剂，橡胶管连接两支注射器来回推几下混匀，然后放乳化器上乳化（为防止蛋白变性，乳化器上可放置冰袋），大约来回推1500次左右可乳化完全（滴一小滴到静水中若不扩散说明乳化完全）。
换上1ml注射器针头免疫小鼠（2ml注射器免疫不好控制，可将乳化液转移到1ml注射器中免疫，但这样会损失部分抗原）。
注：①每只老鼠免疫蛋白量10-100ug,初次免疫参考量50ug蛋白/只，加强免疫及融合前冲击免疫25ug蛋白/只。
初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，融合前冲击免疫不使用佐剂可用缓冲液如PBS等稀释抗原（如果需要）。
②免疫量100ul-300ul/每只小鼠。
③多点免疫，一针不要打太多。
3）免疫方式和免疫时间根据免疫原决定免疫方式，皮下免疫和腹腔注射较为常见(纯化蛋白、融合蛋白多肽)。
皮下注射免疫，免疫时间间隔为2周，第三次免疫一周后（8-10d）采血测效价，决定是继续加强免疫还是冲击免疫后做融合。
较好的效价应该在10W以上，附表1 免疫接种时间表天数操作佐剂免疫方式0 初次免疫CFA 皮下14 第二次免疫IFA 皮下28 第三次免疫IFA 皮下36-38 收集血清测效价＿＿42 第四次免疫（如果需要）IFA 皮下50 收集血清测效价＿＿52 融合前冲击免疫＿腹腔55 收获脾细胞和融合＿＿注：如果第四面免疫血清效价仍然达不到要求可以继续加强免疫，如果免疫超过6次仍然达不到要求免疫基本失败。
单克隆抗体制备操作方法及注意事项JEN
单克隆抗体制备操作方法及注意事项JEN无菌室清洁要求：1、进入无菌间，须更换白大褂，口罩、鞋套必须戴上，最好戴上帽子、手套；2、进去后用酒精棉球擦洗手；3、生物安全柜常见酒精棉球擦洗，擦后棉球不显黑；柜内垃圾当日及时清理；柜内所有实验操作应在酒精灯前进行；经常紫外杀菌；4、无菌间物件传递，经窗口紫外照射方可；5、有关试剂使用后及时用封口膜封住；6、细胞培养盖子旋松，以便二氧化碳气体进入；拿瓶、加液体均需注意瓶口，避免污染瓶盖；7、出门后需要用钥匙锁上；8、整个无菌间两周清洁一次；免疫动物：选择与瘤细胞同一品系的动物做为免疫对象，现在常见的是Balbc/c小鼠，6-8周龄，一种抗原一次性注射2-3只小鼠，小鼠不宜过大，雌性相对较好；首次注射抗原100微克与等体积弗氏完全佐剂混匀，在背部两侧皮下与腹腔分别注射，形成几个小泡；间隔两周左右时间（14天）二次免疫注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，一般上次背部小泡依然存在；间隔两周左右时间（14天）三免小鼠注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，一般上次背部小泡依然存在；间隔7-10天左右时间尾部采血测定抗体效价：方法一：手拇指和食指从背部抓住小鼠颈部皮肤，将小鼠头朝下，小鼠保定后将其尾巴置于50°热水中浸泡数分钟，使尾部血管充盈。
擦干尾部，再用剪刀或刀片剪去尾尖1～2mm，用试管接流出的血液，同时自尾根部向尾尖按摩。
取血后用棉球压迫止血并用6%液体火棉胶涂在伤口处止血。
每次采血量0.1ml。
方法二：固定小鼠，一人捏住小鼠耳朵固定小鼠，同时抓住尾梢协助取血，另一个人左手捏住小鼠尾巴根部，右手用酒精棉球擦洗，使尾部血管充盈，食指抵住尾巴，用一次性1ml注射器穿刺血管，用10微升移液枪及时吸取全血2.5微升，加在盛有97.5微升的PBS缓冲液中稀释10倍，再稀释一百倍，之后做倍比稀释测定效价，读数到阴性血清值的 2.1倍，合理效价应高于12.8万倍。
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
细胞培养相关常用液体配制标准SOP操作规程样本
细胞培养相关常用液体配制标准SOP操作规程样本（一）胰酶的配制：（浓度为1‰，1L）1、认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。
2、称取牛胰蛋白酶1.0g；EDTA 2 g；3、用超纯水溶解；4、磁力搅拌器搅拌至胰酶完全溶解，溶液变得澄清；5、超纯水定容至1L；6、不锈钢滤器加0.22um滤纸两张高温灭菌后，在超净工作台过滤；7、在血清瓶中加入少量滤好的胰酶，置于细胞培养箱中检测是否染菌，其余置于4℃待用；8、过滤后洗净滤器再次灭菌，避免残留的胰酶降解蛋白。
（二）DMEM配制：1、所需试剂及材料：试剂：DMEM干粉（GIBCO 10L）、超纯水（Milli-Q）、Na2CO3 （Sigma）材料：10L玻璃瓶、500ml盐水瓶（灭菌）、0.22um滤膜、滤器（事先放好两层滤膜并高压灭菌）、磁力搅拌器大号搅拌子蠕动泵胶塞2、操作步骤：(1)10L玻璃瓶洗涤，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。
(2)在10L玻璃瓶中加入超纯水9.5L，将DMEM干粉倒入，在磁力搅拌器上搅拌溶解。
(3)按照3.7g/L 加入Na2CO3 。
(4)调节pH值至7.2~7.4。
(5)过滤分装，并注明名称及配制日期。
此过程注意无菌操作！(6)最后用血清瓶取10ml左右置于细胞培养箱中检测是否染菌。
(7)清洗滤器，10L玻璃瓶，软管，将所有实验器具归位。
（三）1640、MEM培养基的配制同上，Na2CO3的用量见包装说明（四）细胞间100×双抗（青霉素、链霉素）的配制青霉素及链霉素配制的终浓度为1万单位/毫升。
配制的步骤以400ml为例：1.认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。
2.准备5瓶青霉素（80万单位/瓶）、4瓶链霉素（100万单位/瓶）。
3.加入1-2ml细胞间专用PBS进入青霉素、链霉素的瓶子内，浸泡后吹吸数次至全部溶解，溶解后的液体吸入配制容器内。
单克隆抗体的制备标准流程
单克隆抗体旳制备流程（一）动物旳选择与免疫1．动物旳选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝旳活动范畴小，体弱，食量及排污较小，一般环境干净旳实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术旳实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适旳免疫方案对于细胞融合杂交旳成功，获得高质量旳McAb 至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原旳特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不适宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是某些弱抗原）旳免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原旳免疫原性，另一方面可减少抗原旳使用量。
②变化抗原注入旳途径，基本免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂，提高机体旳免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原旳反映性。
（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得较好旳免疫效果。
以细胞性抗原为例，免疫时规定抗原量为1～2×107个细胞。
初次免疫1×107/0.5ml ip↓2～3周后第二次免疫1×107/0.5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv↓取脾融合（二）细胞融合1．细胞融合前准备（1）骨髓瘤细胞系旳选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散旳细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞，则可增进这些细胞生长繁殖，所加入旳这种细胞数被称为饲养细胞。
单克隆抗体制备资料
3 筛选方法应在细胞融合前建立好，一部筛选 特异单抗的方法最好
七、杂交瘤细胞克隆
在分泌特异性单抗的杂交瘤细胞中，可能 混有不分泌单抗的细胞克隆；另外分泌单抗的克 隆在初代不稳定，有一部分细胞染色体常丢失， 为了防止不分泌抗体的细胞过度生长，在早期应 对细胞进行克隆。常用有限稀释法，一般来说， 杂交瘤经过3-4次克隆后就稳定了。
3 融合的细胞要处于对数生长期
三、饲养细胞的制备
1 取清洁级ICR小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡10min
2 将小鼠四肢固定，腹部朝上 3 在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹部皮肤 4 用20mL注射器吸取15mLMEM营养液，注入 小鼠腹腔
5 轻轻挤压小鼠腹腔，并用注射器来回抽吸几 次， 将小鼠腹腔内的巨噬细胞吸出，置细胞 瓶内待用
9 将细胞悬液加至96孔细胞培养板中，每孔23滴，约0.1-0.15mL
10 将细胞培养板置37℃ 饱和湿度的CO2 培养 箱中培养
11 培养3天后可取出细胞板在倒置显微镜下观 察细胞融合情况
12 培养置第5天时用HAT培养基换液，换1/2 13 7-8天用HT培养基换液，全部换液 14 10-14天后，杂交瘤细胞占孔底1/3以上，
4 一个克隆需亚克隆3-4次，才稳定
5 如有孔污染，可向感染孔及临近孔滴加 1mol/mL的Cu SO4溶液
七、实验室规模抗体制备
体外上清液培养 1 杂交瘤细胞先在25mL 的细胞培养瓶中培养 2 细胞长满瓶底后转至50或100mL的细胞培 养瓶中培养 3 当细胞液变黄后，收集上清液，再加新鲜的 培养液，并重复收集上清2次 4让细胞长至饱和状态，直至死亡，并收集上 清
单克隆抗体制备方案
单克隆抗体制备方案细胞融合前准备一、动物免疫1.1 动物选择与所用骨髓瘤细胞同源的纯系Balb/c小白鼠，雌雄皆可，鼠龄8周左右。
为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
1.2免疫原制备15ml离心管15个、50ml离心管7个、10ml注射器5支、Tip头20个、电子天平、CFA、PBS、CFA（使用前需震摇）50μg /只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入7mlPBS中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
100μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入3mlPBS中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
150μg/只：称取90mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入2mlPBS中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
200μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入1mlPBS中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
250μg/只：称取100mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入1mlPBS 中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
单克隆抗体制备标准化操作方案
单克隆抗体制备标准化操作方案(McAb-sop)第一章: 小鼠免疫第二章: 滋养细胞的制备第三章: 细胞融合第四章: 筛选分泌抗体的杂交瘤细胞 (ELISA法) 第五章: 杂交瘤细胞的亚克隆培养第六章: 杂交瘤细胞系的冻存与复苏第七章：腹水制备第八章：附件第一章小鼠免疫小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。
好的免疫效果：血清效价达一万以上，脾脏粘连且大小是正常鼠的两倍以上。
小鼠的选择：选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠，鼠龄在8～12周。
为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
免疫原：免疫原的纯度一般并不重要。
但有时免疫原纯度也会造成很大影响，若杂质存在使免疫反应减弱，或筛选方法不能区分对特意性成分反应的抗体及对杂质反应的抗体，以及有些抗原的免疫原性十分强，即便痕迹量的存在，也会影响对所识别抗原的免疫反应。
上述诸情况下使用纯化抗原会更有利。
常用的免疫方案：（一）可溶性抗原初次免疫： 50～100μg蛋白抗原加等体积福氏完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠，四周后进行第二次免疫第二次免疫：50～100μg（25～50ug，为初免剂量一半）蛋白抗原（与初免等量），加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠两周后采小鼠尾静脉血离心取血清测效价（用ELISA方法检测）效价达一万以上的小鼠融合前三天取抗原25μg（50～100ug，与初免剂量相同）加强免疫，尾静脉注射，注射体积200μl/只300ul/只，效价在一万以下的小鼠继续第三次免疫第三次免疫：50μg蛋白抗原加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠腹腔注射，注射体积500μl/只，小鼠融合前三天取抗原25μg加强免疫，注射体积200μl/只。
（二）颗粒性（细胞）抗原可用5×106~2×107细胞与完全佐剂混合，作皮下或腹腔注射，2~3周后重复一次，但佐剂改为不完全佐剂，再待2~3周后用同样剂量细胞或半量细胞静脉注射，3~4天后取脾融合。
单克隆抗体制备规范操作
单克隆抗体制备规范操作融合准备工作：融合前3天小鼠追加免疫，用灭菌的2兆水稀释抗原，足掌免疫100微克抗原/鼠，50微克/脚，50微升/脚，注意追加免疫后3-6天内融合，因为此时抗体效价较高。
融合所有用到的实验材料和工具(剪过枪头和分装液体盒)进行高压灭菌，并对小鼠骨髓瘤细胞进行传代处理(要求传入新的培养瓶中，密度达到60-70%，并且选择不同的浓度梯度以确保第二天的融合时有最佳状态的细胞)。
融合操作步骤：实验前，将PEG和100ml R-1640培养液放入37℃水浴锅中孵育。
眼球采血处死小鼠（回收血液制备阳性血清用于下一步的ELISA筛选），75%的酒精浸泡消毒，取出小鼠股内侧沟淋巴结，随后把淋巴结放入4℃R-1640培养液（含2×双抗）（准备3个培养皿，一用来剪除淋巴结上的结缔和脂肪组织；二是用来清洗淋巴结；三是用来剪碎和撕碎淋巴结的，制备免疫小鼠的淋巴细胞）。
把含有淋巴细胞或脾细胞的悬液经过有棉花（好的脱脂棉）的吸管过滤，除去残渣，分离细胞。
过滤好的细胞2000r/min，10min。
制备足够多的骨髓瘤细胞（Ag8.8），1500r/min，10min，（每次用4℃R-1640培养液漂洗骨髓瘤细胞，洗3次以上，目的去除培养骨髓瘤细胞的培养液中的的血清，因为血清中的蛋白成分有抑制融合的作用）。
淋巴细胞和骨髓瘤细胞同时洗涤3次以上，要求2000r/min，10min，用10ml 4℃R-1640不完全培养液悬浮骨髓瘤细胞，第4次洗涤前全取淋巴细胞，按照淋巴细胞：骨髓瘤细胞=1：1的数量比（淋巴细胞：骨髓瘤细胞=1：5的体积比）取骨髓瘤细胞，将两种细胞混匀，加入37℃R-1640不完全培养液至50ml，2000r/min，5min，弃除上清液。
（注意：每次离心完毕要求尽量将上清液吸干净）加入预热的1ml PEG融合剂，加入过程中注意缓慢加入（速度：保持一滴一滴地滴入），并且边加边用吸管头轻轻拨动细胞团。
流式细胞仪操作规程-SOP
流式细胞仪操作规程目录
1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数
2：活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测
3：HLA-B27测定
4：CD55／CD59测定
5：干细胞检测和绝对计数
6：白血病免疫分型测定
7：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定8：细胞周期分析
9：活化血小板检测
10：血小板抗体测定
11：红细胞抗体测定
12：粒细胞抗体测定
淋巴细胞亚群测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号：
200 年月日起实施
第1版
(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期：年月日
复审人：
规程编写者：
审批者：
批准日期：年月日
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
检验科主任：
检验科实验室：
淋巴细胞亚群测定
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（命名，点击save）画图
此图为CD45圈门
填写Flow-Count的浓度
活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的测定
HLA-B27测定
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X-Mean=17.1 negative(-)
X-Mean=1.2 X-Mean=5.8
CD55/CD59测定
2.RBC: abnormal
干细胞检测和绝对计数
白血病免疫分型测定
T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测
细胞周期分析
2.画图
血小板膜表面抗体测定
红细胞膜蛋白结构测定（红细胞抗体）
粒细胞抗体测定。
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单克隆抗体制备系统常用液体配制标准SOP操作规程样本
1、PRMI 1640HT培养基（10L）:
PRMI 1640干粉10包（103.9g/10L），称取丙酮酸钠（Sodium Pyruvate，S）1.1g/10L，适量ddH2O溶解后加入。
称取黄嘌呤(hypoxanthn，H) 136.1mg/10L＋胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）38.8mg/10L +谷氨酰胺（L-Glutamine,L-Glu）3.48g/10L，置适量ddH2O 中在45～50℃条件下溶解后加入。
加ddH2O至10L，补加NaHCO3 20g/10L。
用1mol/L HCl调节pH至6.8～7.0(经验值是3ml/10L)。
过滤除菌。
取少量的培养液置培养瓶中并放入CO2培养箱中，一周后，如培养中未长菌，同一期配制的基础培养液方可使用。
2、PRMI 1640培养基:
PRMI 1640HT培养基配制时不加H（黄嘌呤）和T （胸腺嘧啶核苷）即可。
3、过氧乙酸：
100ml的H2O2加入到200ml的乙酸中，再加入6ml浓H2SO4，放置过夜即可。
4、细胞冻存液：
90mL胎牛血清＋10mL DMSO（二甲亚砜）,4℃冻存。
EIA系统。