细胞培养知识
细胞培养技术中的基础知识与操作技巧
细胞培养技术中的基础知识与操作技巧细胞培养技术是现代生物学和医学领域中不可或缺的技术之一。
利用细胞培养技术，我们可以研究细胞生长、发育、分化、疾病等方面的基本问题，也可以应用于药物筛选、细胞治疗、工程组织等领域。
本文将向您介绍一些细胞培养技术中的基础知识和操作技巧。
一、选择培养物在进行细胞培养之前，首先需要选择合适的细胞种类和培养物。
常见的培养物包括DMEM、RPMI1640、MEM等等，不同的培养物适用于不同类型的细胞，具体应该根据细胞种类和实验需求来选择。
此外，培养物中一般也会添加一些重要的成分，如胎牛血清、人血清、靶向蛋白、激素等等，这些成分的含量和种类也会影响细胞的生长与生理状态。
二、细胞培养的基本步骤细胞培养的基本步骤包括细胞的分离、细胞的培养和细胞的观察与分析。
1. 分离细胞分离细胞是细胞培养中的关键步骤之一，通常采用酶消化法和机械法两种方式。
通过酶消化法，可以使细胞与培养皿表面解离，从而得到单个或小团细胞；而机械法则是通过振荡或刮擦来达到分离细胞的目的。
2. 细胞的培养将分离好的细胞加入到预先涂覆有培养物的培养皿中，并将培养皿置于恒温箱（37℃，5% CO2）中培养。
在细胞生长的过程中需要定期更换或添加培养物。
3. 细胞的观察与分析细胞的观察可以通过显微镜来实现，观察细胞形态、大小、数量、移动等生长状态；而细胞的分析则可以利用细胞计数仪、细胞分选仪、PCR等技术，对细胞进行数量统计和功能评估。
三、细胞培养常见问题及应对方法在进行细胞培养的过程中，常会遇到一些问题。
例如，细胞不能够生长或生长缓慢；细胞死亡严重；细胞感染等等。
以下是一些常见问题以及针对问题的解决方法：1. 细胞不能够生长或生长缓慢这种情况可能是培养物失活或者浓度不足，这时候需要更换新鲜的培养物，或者调整培养物的含量。
2. 细胞死亡严重细胞死亡可能是由于细胞抗性引起的，这时候可以根据细胞类型来调整培养条件和细胞密度；另外，也有可能是由于感染、缺氧等过程中引起的，需要及时采取相应的处理措施。
实验室细胞培养基本知识
细胞培养箱的无菌
• 培养箱是主要的污染源，应每学期做彻底清洁（箱体、架子、 隔板、托盘），可用70%酒精充分擦拭，并完全挥发晾干。
• 培养箱使用时底部湿盘要加入1%硫酸铜。 • 培养细胞时，尽可能选购带渗透盖的培养瓶，不仅可以在CO2
环境中迅速达到平衡，而且不会有污染的危险。
细胞培养中的无菌操作
• 紫外灭菌：洁净台使用前、使用中的间隙、使用后都要用紫外灭菌，但 光束的有效性有限，因为它不能达到缝隙中。
• 70%酒精擦拭：洁净台使用前、使用中有溢出物、使用后都要擦拭，各 种试剂瓶、储液瓶、培养瓶、培养板和培养皿，放入洁净台之前，必须 用 70% 乙醇擦拭其外部，注意要选用抗乙醇的记号笔。
细胞培养中的无菌操作
• 加盖：所有试剂瓶子要用深螺旋的聚丙烯盖子，使用时要将盖 子口朝下放置在工作区域，不用时要及时盖好，但可以不用旋 紧。
• 灼烧：开放工作台才需要灼烧，细胞培养用的洁净台中不需要 也不建议灼烧、明火既破坏了层流又难以除去生物危害物质， 还带来了火灾隐患，明火带来的高温还会影响HEPA过滤的寿命。
• 气流可以呈水平方向，与工作 台面平行吹过，或者也可呈垂 直方向，从通风橱上方吹向工 作台面。
• 细胞培养通风橱通过维持工 作区域上方稳定、单向的 HEPA过滤空气流动，保护工 作环境免受灰尘及其他空气 污染物污染。
准备与灭菌
灭菌方式的选择
• 热稳定的物品（玻璃器皿、金属）用干热灭菌：160℃， 1h；
新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。 • 细胞系：首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。 • 细胞株：如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中
生物动物细胞培养知识点
生物动物细胞培养知识点
1. 培养基：生物动物细胞必须在合适的培养基中生长和繁殖。
常用的培养基包括DMEM、RPMI 1640和MEM等。
2. 细胞传代：当细胞密度达到一定程度后，需要进行传代，即将细胞分离并移植到新的培养皿中继续生长。
3. 培养条件：生物动物细胞需要适宜的培养条件才能正常生长。
包括温度、湿度、氧气含量、营养物质等。
4. 细胞病毒污染：生物动物细胞培养容易出现细胞病毒污染，需要采取相关的预防措施，如定期检测、消毒鉴定等。
5. 细胞凋亡：细胞凋亡是一种自我调节的程序性死亡，常出现在细胞密度达到一定程度后。
6. 细胞形态：生物动物细胞的形态和生长状态需要定期观察和记录，以便及时发现和处理问题。
7. 细胞株的建立：通过限制性稀释或筛选，可以获得单克隆的细胞株，方便后续的实验研究。
8. 细胞的鉴定：眼睛观察、免疫细胞化学等方法可以用于鉴定不同类型的生物动物细胞。
9. 细胞破裂：细胞在处理过程中需要破裂释放细胞内物质，通常使用机械方法或超声波等物理方法来破裂细胞。
10. 细胞冻存：为了保存细胞，需要进行冷冻保存，通常在添加冷冻保护剂后，将细胞悬浮液分装于-80°C冰冻保存。
细胞培养必备知识
常规组织培养法1）初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
2）初代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。
2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。
3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。
细胞培养基本知识
（2） 传代期培养：初代培养的细胞生长到一定 程度，即可连接传代，使其连续生长。一般正常 二倍体细胞，不加附加条件，可传代30-50代， 此时可发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、
停止分裂，进入衰退期，我们称之有限细胞系。
这一转折点有人称之危象临界点（crisis），有 些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞 可通过这一期，获得持久的增殖传代能力，我们 称细胞系，或无限细胞系，即一般通称的细胞系。
（3） 细胞作为生命活动的基本单位的共同特点： 首先所有细胞 表面均有一层脂蛋白成分的生物 膜，即细胞膜，使细胞能与周围环境保持相对独 立性； 其次，所有细胞都有两种核酸，即DNA和RNA 作为遗传信息的复制和转录的物质基础； 第三作为蛋白质合成的“机器”-核蛋白，是一 切细胞不可缺少的基本结构； 第四所有细胞都是以一分为二的分裂方式增殖。 第五，细胞具有多样性，形状、大小悬殊很大， 结构复杂程度也很不一样。
株（Cell strain)
4. 组织（细胞）培养的医学生
物学意义
（1） 培养的组织器官或细胞，能在一定范围和 程度上反映生命活动规律和机体功能特点。培养 的细胞为生命科学和生物医学各种研究奠定了物
质基础
（2） 细胞培养与生物工程：细胞培养技术已经 成为商品化生物技术的核心。如目前可提供的产 品，病毒疫苗：口蹄疫、狂犬疫苗、乙肝疫苗； 非抗体型免疫调节剂：干扰素、白介素、集落刺
（3） 衰退期：传代细胞到达一定代数，即发生 增殖缓慢，逐 渐停止，进而发生衰退、死亡， 多数传代细胞（或叫有限细胞系），不能通过所
谓的“crisis（危象临界点），导致最终死亡，
这一现象可能说明生物学衰老的细胞学基础。人 胚胎成纤维细胞可以进行60代增殖，而80岁老人 的肺成纤维细胞仅传代了16代后便死亡。
细胞培养必备知识
注意：
1.打开培养箱时尽量不要说话； 2.步骤9中培养瓶放入培养箱时，应把盖子拧开少许。
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传代
1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子； 2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在 倒置显微镜下观察细胞生长状况。 3.放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。 4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口； 5.拿出PBS瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞 子取出，烧瓶口（至少10圈）。
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三、在肿瘤学中的应用
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肿瘤细胞生物特性学研究
–比较肿瘤细胞与正常细胞在体外培养条件下生 长行为的差异，研究肿瘤细胞生物学特性的改 变，对于建立诊断标准有益。 肿瘤细胞体外生长形态学研究 肿瘤细胞生长特性 细胞接触抑制实验
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肿瘤发病机制研究
–肿瘤产生诱发因素的研究 –肿瘤细胞侵润机制和过程的研究 –肿瘤与正常细胞 共同培养法
研究肿瘤药物筛选
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异种移植研究
裸鼠发现与应用 建立了动物移植瘤模型
抗肿瘤药物筛选
研究肿瘤细胞调亡以及肿瘤细胞体外分化 又成为新热点
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生物治疗
–活细胞---体细胞---体内
–活化细胞（LAK）---患者
–组织---悬液---培养---回输机体
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细胞培养：
一、原代培养
二、传代培养
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一
原代培养
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6. 烧瓶口，镊子和盖子；盖上盖子， 在倒置显微镜下观察。 7. 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内. 注意： 步骤2中，蒸馏水不要没过冻存管口 所有步骤结束过24小时后一定要换液；
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6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。 7.拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取 出，烧瓶口（至少10圈）。 8.用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子； 9.拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5分钟 后取出；
细胞培养相关知识点
细胞培养相关知识点
细胞培养是指将细胞从体内或体外来源中采集到培养基中，通过提供合适的营养物质和环境条件使其在体外无限制地生长和繁殖的一种生物学实验技术。
常见的细胞培养技术包括原代细胞培养和细胞系培养。
1. 培养基：细胞培养中使用的培养基是包含多种营养物质的液体或固体培养基。
常见的培养基种类包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，并根据细胞的类型和特殊需要进行相应的改制。
2. 细胞分离：通过一系列的操作将组织中的细胞分离出来，常用的方法有机械剪切、酶消化和离心等。
3. 细胞传代：细胞的传代是指将细胞从旧的培养皿中转移到新的培养皿中，以保持细胞的生长状态和增殖能力。
细胞传代的方法有裂解法、胶原酶法和选择性黏附法等。
4. 培养条件：细胞的生长需要适宜的温度、湿度、pH值和气体环境。
常见的培养条件为37℃、5% CO2和95%湿度。
5. 防止细胞污染：细胞培养中常见的污染源有细菌、真菌和支原体等。
常用的防止污染的方法包括消毒培养器具和介质、使用无菌操作等。
6. 细胞检测：常用的检测方法包括细胞形态观察、细胞数量计
数、细胞活力测定、染色体核型分析和细胞分化等。
7. 细胞培养的应用：细胞培养技术在生物医学研究中有广泛的应用，如药物筛选、疾病模型建立、组织工程和基因工程等。
注：以上所列举的知识点为细胞培养的基本内容，具体的细胞培养操作方法和技巧可根据具体实验需求和细胞类型进行进一步学习。
细胞培养技术
二、培养细胞的特性
培养细胞的生长特点
贴附
贴附
贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一 以成纤维细胞为例，一般在细胞接种后，很快
（5-10min）便可见细胞以伪足初期附着，与底物
形成一些接触点；接着细胞逐渐呈放射状地伸展
开，细胞体的中心部分亦随之扁平；最后细胞成
为成纤维细胞的形态。
1. 培养细胞的生长方式及类型
五 细胞冷冻保存
1. 冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO，
冷冻方法： 传统方法8小 时(或隔夜)--> 液氮槽蒸汽相中长期储存。
2. 材料用品
1） 2） 3） 4） 生长良好的培养细胞 新鲜培养基 DMSO (Sigma D-2650) 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)
四、细胞传代培养
1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一 般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异。 2. 材料用品： PBS,0.25%胰酶, 新鲜培养基
3. 步骤：
3.1. 贴壁型细胞 1） 吸掉旧培养液。
2） 用PBS 洗涤细胞一至二次。
3） 0.25%胰酶37℃ 作用数分钟，于倒置显微镜下观察，当细 胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉胰酶溶液。
1. 细胞培养(cell culture)概念
从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境，在 无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存
和生长并维持其结构和功能的技术。
体内、外细胞的差异
体内细胞：
机体神经体液调节 和其他类型细胞影响 基因表达受到外来信号调节 增殖过程中不断发生着分化 （由一般到特殊） 高度特化的结构和功能
3. 操作步骤：
细胞培养基本知识基本技术
医学院 中心实验室 谷景义 85225841
主要内容： •1、细胞培养基本知识 •2、培养细胞生长环境 •3、细胞培养基本技术
•4、培养细胞质量控制
一、 细胞培养
• 把取得的组织用机械或消化的方法分 散成单个细胞，用培养基制成细胞悬 液，在体外适宜条件下，使细胞生长 繁殖，并保留其一定的结构和功能特 性。
二、培养细胞生长环境
Cell Culture Environment
Substrate Gas Medium Serum Supplements
Glass ﹠ Plastic Culture Vessels ……
O2 CO2
……
pH Osmolality Temperature ……
Hormones FBS Growth factors NCS Antibiotic ……
培养细胞的特性1 -生长方式及类型
• 贴附型、悬浮型
培养细胞的特性2 - 增殖特点
• 体外培养的细胞既保持了一定的体内细 胞的基本特性，但也具有本身的一些特 点。 • 贴附-伸展 • 接触抑制-增殖的密度抑制
贴附-伸展
接触抑制
• 当一个细胞被其他细胞围绕导致无处 可去而保持接触时，细胞不再移动， 在接触区域的细胞膜活动将停止。 • 因此，一般正常细胞并不相互重叠于 其上生长。
• 应用： • 软骨和骨组织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨） • 循环系统和心脏（有目的地改变血管形成）
细胞培养技术的特点及应用
优点：
1）研究的条件可以人为控制 2）研究的样本均一 3）研究内容方便观察、检测、记录 4）研究的费用相对于经济
缺点：体外培养的细胞不能完全Байду номын сангаас同于体 内的细胞。
细胞培养基本知识
细胞培养在基因治疗方面也有很大作用。本实验室利用 培养的SY5Y细胞，通过将早老素基因PS-1转染入SY5Y细胞；而后，用RT-PCR证明转染有PS-1基因的细胞内部有PS-1 mRNA转录，用单抗检测细胞PS-1蛋白的表达。而后可用以检测细胞是否有早老现象。再用类似方法，我们可以研究细胞的钙通道以及其它药物作用的膜通道，从而指导临床药物应用，并据此来研究新的药物。
1.2 细胞培养的实验室要求
细胞培养要求较高，目的是使细胞能在无菌条件下存活。提取细胞的手术器具在每次使用之前应高温、高压消毒，配培养液的水要求用灭菌双蒸水并加入双抗。所用培养瓶、离心管等器皿最好为一次性。要在无菌室超净台上操作。每次操作之前，要用紫外灯照射工作台20-30min，然后将手洗干净，换拖鞋进入无菌间，将手用新洁尔灭喷洗一遍再操作。
2 以人血管内皮细胞为例说明细胞培养
由于细胞本身性质不同，其分离和培养方法也会有差异。其来源一般是新鲜脐带的脐静脉（来自于产后24h以内），具体的分离方法是：取新生儿脐带血(25 cm左右)，放入含青、链霉素各100U/mL的灭菌PBS中，4C保存，24h内进行实验。
2.1. 取材和原代培养
2009-05-29 17:35回复
白港人 ☆Gabri液体培养基的保存是冷藏好？还是冷冻好？
要冷藏！！因为液体培养基经冷冻后再经溶化时，其溶液的pH值会发生改变，溶液往往变碱，某些成分溶解也会受到影响对细胞生长不利。故液体培养基一定要存放在冷藏箱中，通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月~ 一年。
2. 液体培养基中谷氨酰胺的作用及使用方法。
几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。所以，各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置-20 ?C冰冻保存，用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基4 ?C 冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。基础医学细胞中心在其服务项目中配制分装了高浓度（100倍）的谷氨酰胺溶液（1ml/支）。每支1ml的谷氨酰胺加到99ml完全培养基中，其终浓度为2mM/ml培养基。包装为粉红色，-20?C保存。
细胞培养基本知识技术
物质溶解其中。 • 4．大气的CO2溶解 （二）纯化水制备应注意事项： • 在准备室选择一处洁净、无尘、清静的地方放置纯
化水的装置。 • 所得的纯化水贮备在专用的干净玻璃瓶内，最好用
硼砂硅玻璃瓶内，标记上制备的日期。
• CO2培养箱是培养细胞的专用设备. • CO2培养箱培养细胞必须满足细胞生长的
三个条件. • 稳定的温度. • 大于95%的相对湿度. • 稳定的CO2浓度 • 三气培养箱是从CO2培养箱基础上发展出来
的新品种,它可同时控制O2浓度.
注意事项
• 1 用螺旋口瓶培养细胞时需将瓶盖微松，以保证 通气。但瓶口过松，易污染。
倒置显微镜
工作原理
一般情况下,人眼只能在光波的波长(颜色)和振幅(亮 度)发生变化时,才能看到被检测物体.但生活状态下的细胞 都呈无色透明,光线通过这些物体时波长和振幅并不发生 变化，因此用普通显微镜无法看清活细胞的形态和结构。 相差显微镜是利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折 射率有差异的原理，即光波在折射率大的物体中比在折射 率小的物体中前进的距离较短，此距离叫光程差，由于光 程差引起光的相位变化称为相位差或相差。使用相差显微 镜可使肉眼不能分辨的相位差变为可分辨的振幅差（即明 暗差），使无色透明的物体在镜下反差显著、影像清晰。
（三）纯化水的常用制备方法
• 1.去离子法和石英双重玻璃蒸馏器法结合
• 水中含有溶解或不溶解的矿物盐、油脂及酸类， 以及O2,CO2,H2S,Cl2等。这些物质通过离子交换 树脂除去。
• 采用阳离子树脂或阴离子树脂处理。常使用强酸 性阳离子交换树脂和强碱基性阴离子交换树脂， 将水流通过离子交换柱即得纯净的去离子水。
细胞培养的基本知识
第一章细胞培养的基本知识第一节前言细胞培养(cell culture)是指细胞的离体培养，包括单个细胞的培养。
具体说来，是指在无菌条件下，把动物或植物的细胞从有机体中分离出来，置于培养器皿中，并在一个合适的环境中，给以营养物质，使之继续生存和生长的方法。
广义上的细胞培养包括器官培养(organ culture)、组织培养(tissue culture)和细胞培养(cell culture)。
但因从组织块生长出来的仍然是细胞，细胞在生长的同时发生移动，使得培养中的组织难以长时间保持其原有的结构，因此三者并无严格的区别。
一般所说的细胞培养，即包括器官培养、组织培养和细胞培养三层含义。
细胞培养的发展历史已近百年。
最初的细胞培养是胚胎学和微生物学的引申，建立于无菌原则的基础上，用天然体液(如胎汁、血浆)来维持从整体切下的组织块，以对细胞进行形态和功能的观察。
Harrison和Careel(1907, 1910)首创了盖片覆盖表玻璃的悬滴培养法，建立了离体培养组织和细胞的基本模式。
后来许多学者在培养容器、培养液和培养操作技术方面加以改进和革新：在卡氏瓶的启示下，设计出多种类型的培养瓶；培养基由天然动物血浆改进为合成培养基；促细胞生长物质从胎汁改为动物血清；Dulbecco(1957)等采用胰蛋白酶消化处理组织，获得了单层培养物，对细胞培养的发展起了积极的推动作用，单层培养遂成为细胞培养普遍采用的技术。
采用单层培养法建立了各种细胞系和细胞株，现在全世界储存的细胞株约有万种以上。
Sanford(1948)创立了单细胞分离培养法，应用这一技术可建立遗传性状相同的克隆细胞株(clone strain)。
今天的组织培养已可把多细胞机体中各种完整的细胞和组织从错综复杂的体内影响和相互关系中分离出来，置于离体因素的直接作用下，长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动过程，并可利用不同的技术方法，如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、同位素标记以及缩时显微电影等观察、记录和研究细胞。
细胞培养基础知识
1.ATCC（细胞株及胚胎干细胞库）： • 2.欧洲细胞实验室列表（大全） http://www.biotech.ist.unige.it/cldb/labs.html
潜伏期
此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。 细胞株潜伏期一般为6～24小时。
对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳， 最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再 分裂
机制：接触抑制、密度依赖性
培养细胞生长的条件
1 细胞的营养需要
2 细胞的生存环境
温度: 37 ℃
压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃 器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒
/cell_catalog.asp 6.中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库
• / • 7.南京中医药大学新药及海洋药物研究中心药理毒理研究室细胞库目录
http://202.195.210.5/web/keyanziyuan/haiyangcell1.htm • 8.中国医学科学院基础医学研究所细胞中心保藏细胞目录
培养细胞的特性
培养细胞的生长方式
贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤
细胞 悬浮生长：
于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。 见于各种造血系统肿瘤细胞
每代贴附生长细胞 的生长过程
游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程细胞培养实验是指将动植物组织或细胞从体内分离并在无菌条件下培养的一种技术手段。
这种技术可以用于研究细胞的生物学特性、疾病的发生机制以及药物的筛选等方面。
以下是细胞培养实验的基本流程和无菌操作的相关知识。
一、细胞培养的基本知识1.细胞培养的种类：常用的细胞培养种类有原代细胞培养、细胞株的维持和传代培养以及细胞系的培养。
2.细胞培养的培养基：细胞培养的培养基可以分为无血清培养基和含血清培养基。
其中，无血清培养基是通过添加一定的生长因子和营养物质来满足细胞生长的需要，而含血清培养基则是使用含有细胞生长因子和营养物质的胎牛血清来供养细胞。
3.传代培养的液氮保存：为了保持细胞株的可用性，可以将细胞株保存在液氮中，以备将来使用。
4.细胞培养中的无菌操作：细胞培养实验需要在无菌条件下进行操作，以防止细胞污染和外源性菌落的输入。
1.工作台和操作区域的消毒：操作前，需要用75％的酒精或其他合适的消毒剂彻底清洁工作台面、培养箱、玻璃器皿等操作区域。
2.培养器具的消毒：需要对培养器具如离心管、移液枪、显微镜等进行高温高压的无菌处理。
3.培养基的制备和滤过：制备培养基时需要将培养基溶液进行高温高压的杀菌处理，并使用0.22微米的滤膜滤过杂质。
4.无菌技术的掌握：在细胞培养实验中，需要学习和掌握无菌技术，如无菌操作台、细菌灯和无菌手套等的正确使用方法。
5.细胞的分离和悬浮：将组织样本放入消化液中，进行细胞的分离和悬浮，并通过离心和过滤的方式获得单个细胞悬浮液。
6.细胞培养的接种：将细胞悬浮液接种在含有培养基的培养皿或离心管中，放入培养箱中进行培养。
7.细胞传代的操作：当细胞达到一定密度后，需要进行细胞传代操作。
传代操作时，需要将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，并加入新的培养基进行细胞的维持和生长。
总之，细胞培养实验是生物学研究中不可或缺的一项实验技术，掌握细胞培养的基本知识和无菌操作流程对实验结果的准确性和可靠性至关重要。
细胞培养基本知识
3.血清
◆常用血清类型：
胎牛血清（剖腹产）
新生牛血清（生后24H内）
小牛血清（10-30天）
兔血清
马血清
(三)细胞培养的无菌要求
1.细胞室的无菌要求 2.细胞培养物品的无菌要求 3.操作人员的无菌要求 4.操作过程中的无菌要求
1.细胞室的无菌要求
结构要求：更衣间、 缓冲间、 操作间三部分组成。 使用前：紫外照射（1小时）
细胞培养板
常见规格 6孔 12孔 24孔 48孔 96孔
细胞培养皿
常见规格 35mm 60mm 100mm
冻存管
常用规格
1.5ml 2ml 5ml
离心管
常用规格 15ml 50ml
滤器
大多数无法高压灭菌消毒的培养用液，如人工 合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。
为细胞操作提供
无菌环境
利用鼓风机
净化空气
观察细胞生长状况
拍摄细胞生长相关资料
细胞生长的主要场所
设定条件为37
℃
95%空气 5％CO2
细胞培养用品的消毒
分离细胞
细胞培养瓶
常见规格: 25平方厘米(50ml) 75平方厘米(250ml) 150平方厘米(550ml)
滤器
四、细胞培养的基本条件
(一)细胞的生存环境
(二)细胞的营养需要
(三)细胞的无菌要求
(一)细胞的生存环境
温度37˚C 氧气 CO25% PH7.2-7.4 渗透压
(二)细胞的营养需要
1.细胞培培养基
分天然培养基和合成培养基两类 天然培养基： 血清 血浆 组织提取液 合成培养基: RPMI-1640 DMEM
细胞培养知识大全
细胞培养实验技术大全第一章细胞培养的基本原理与技术现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。
比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。
基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。
正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。
总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。
第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。
组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。
细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。
器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。
二、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
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细胞培养基础知识细胞培养基本条件1、合适的细胞培养基合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。
2、优质血清目前，大多数合成培养基都需要添加血清。
血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。
3、无菌无毒细胞培养环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。
在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。
因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。
4、恒定的细胞生长温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。
5、合适的气体环境气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。
细胞培养基种类与基本成分细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类。
干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。
1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质：氨基酸氨基酸是组成蛋白质的基本单位。
不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。
其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。
因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。
但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。
已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。
碳水化合物碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。
主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。
无机盐培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。
此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。
培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ～320 mOsm/kg。
标准培养液的渗透压在此范围内波动。
特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。
向培养液中添加HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。
缓冲系统大多数细胞所需pH 在- 。
但是，细胞培养最适pH 值随培养的细胞种类不同而不同。
成纤维细胞喜欢较高pH - , 而传代转化细胞系则需要偏酸pH - 。
由于多数培养液靠碳酸氢钠（NaHCO3）与CO2 体系进行缓冲，因此，气相中的CO2 浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡。
如果气相或培养箱空气中CO2 浓度设定在5％，培养液中NaHCO3 的加入量为1.97g/L；如果CO2 浓度维持在10％，培养液中NaHCO3 的加入量为3.95g/L。
细胞培养瓶盖不应拧得太紧，以保证气体交换。
HEPES 是一种非离子缓冲液，在pH - 范围内具有较好的缓冲能力，但是非常昂贵，在高浓度时对一些细胞可能有毒。
HEPES 缓冲液可与低水平的碳酸钠（0.34g/L）共用，以抵消因额外加入HEPES 引起的渗透压增加。
在这种培养条件下，细胞培养瓶的盖子应拧紧，以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。
大多数培养液中含有酚红作为pH 指示剂，酸性培养液呈橙黄色，碱性培养液呈深红色。
维生素在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源，但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。
其它成分在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分。
如在杂交瘤技术中常用的DMEM 培养液，使用时还需要补加丙酮酸钠和2-巯基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。
2-Me 对细胞生长有很重要的作用。
有人认为它相当于胎牛血清，有直接刺激细胞增殖作用。
2-Me的活性部分是硫氢基，其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖，为非特异性的激活作用。
同时避免过氧化物对培养细胞的损害。
另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA 合成，增加植物凝集素(PHA)对淋巴细胞的转化作用，已广泛应用于杂交瘤技术，另外，也开始用于一些难以培养的细胞。
2-Me 是一种小分子还原剂，极易氧化。
分子量为，纯的2-Me 是一种无色有刺激味的液体，比重为，常用终浓度为5×10-5M。
常配制成0.1M 的储存液，用时每升培养液加。
液体培养基保存：液体培养基应于4℃冰箱避光保存，实验前放入37℃预热。
未加血清液体培养基有效期为12 个月。
液体培养基中的L-谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解。
如果细胞生长不良，可以再添加适量L-谷氨酰胺。
干粉培养基保存：4℃冰箱避光保存，有效期36 个月。
血清细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分为胎牛血清和新生小牛血清。
胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清，价格昂贵。
新生小牛血清是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清，如厂家能做到这一点，新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大。
如小牛出生后已哺乳，从这种小牛中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质，其质量明显不如前两种。
血清的质量，种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同，尤其是对克隆细胞的生长，某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质。
因此，在购买大量血清之前，必须对血清支持细胞生长能力进行检测，然后再大量购买质量好的同一批号的血清，并注意以下几点：（1）需要长期保存的血清必须储存于-20℃– 70℃低温冰箱中。
4℃冰箱中保存时间切勿超过1 个月。
由于血清结冰时体积会增加约10％，因此，血清在冻入低温冰箱前，必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。
（2）一般厂商提供的血清为无菌，无需再过滤除菌。
如发现血清有悬浮物，则可将血清加入培养液内一起过滤，切勿直接过滤血清。
（3）瓶装血清解冻需采用逐步解冻法：-20℃至-70℃低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1 天。
然后移入室温，待全部溶解后再分装。
在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。
切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。
（4）热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清。
加热过程中须规则摇晃均匀。
此热处理的目的是使血清中的补体成分（complement）灭活。
除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显着增多，而且还会影响血清的质量。
补体参与反应有：细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化。
（5）切勿将血清在37℃放置太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中的有效成分会破会而影响血清质量。
（6）血清中的沉淀物絮状物：主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。
可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理。
显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显着增多。
有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。
一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清。
细胞培养环境1、实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。
细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。
细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。
2、常用设施及设备（1）超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。
（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。
操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。
缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。
（3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物（4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。
（5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。
3、培养器皿常用细胞培养器皿有培养瓶、培养板、培养皿等。
常准备量是使用量的三倍。
器皿应选择透明度好、无毒、利于细胞粘附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。
常用的器皿有下面几种。
（1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常用规格有500ml、250ml、100ml 等几种。
（2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等几种。
（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。
分直径30mm、60mm、120mm 等几种。
（4）吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。
其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。
常用1ml 和10ml 两种。
短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。
（5）离心管：离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。
前者分别为50ml、30ml、15ml；后者则多为10ml 和5ml。
（6）其它：如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。
4、细胞培养温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定而适宜的温度。
不同种类的细胞对培养温度要求也不同。
人体细胞培养的标准温度为℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。
培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1 小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1 小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1 小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1 小时，细胞全部死亡。
相反，温度不低于0℃时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用；把细胞放入25－35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度减慢；放在4℃数小时后，再回到37℃培养，细胞仍能继续生长。
细胞代谢随温度降低而减慢。
当温度降至冰点以下时，细胞可因胞质结冰受损而死亡。