《盐析法分离蛋白质》PPT课件
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生物化学实验PPT课件 3蛋白质的盐析分离和凝胶排阻层析脱盐
珠内部反复穿行，缓慢流出。
流 动 相
固 定 相
实验简述
1. 通过盐析法使鸡蛋卵清蛋白和卵球蛋白分离；通过盐溶法 使沉淀析出的卵球蛋白再次溶解 2. 制备葡聚糖凝胶SephadexG-25凝胶排阻层析柱 3. 通过凝胶排阻层析分离卵球蛋白和盐离子 4. 检测层析后收集的各管样品中的盐离子（醋酸钡法） 5. 检测各管样品中的蛋白质含量（UV法）
用移液枪去除上清（含卵清蛋白） 加50%硫酸铵溶液1.5ml 洗涤 3000rpm，离心3分钟 用移液枪去除上清
实验二 凝胶柱的制备和蛋白脱盐
1. 垂直固定层析柱，并安装乳胶管、止水夹
2. 向层析柱中加入1/3体积的水，以平衡、排出基质和乳胶管中的 气泡；若层析柱流水不畅，应反复正反冲洗柱基质！！
实验三 脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1. 硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。 从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀
实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(醋酸钡检测溶液) 用++/+/-记录每管硫酸钡沉淀情况
6. 分析结果：盐析分离蛋白及凝胶排阻层析脱盐是否成功？
实验一 卵球蛋白的盐析分离
0.7ml 卵清 + 0.7ml 饱和硫酸铵溶液 （每组2个EP管） 混合均匀 （避免产生气泡） 静置3-5分钟，蛋白质析出
将两管上清合并， 即为样品 3000rpm, 离心3分钟
1ml水充分溶解 卵球蛋白沉淀
3000rpm，离心3分钟
凝胶排阻层析
(分子筛层析、分子排阻层析、凝胶过滤层析)
固定相：常用交联葡聚糖凝胶，如Sephadex系列，有不同凝胶
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定(共14张PPT)
而增加
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
蛋白质沉淀反应ppt课件
精选ppt课件2021
6
（三）重金属盐类沉淀蛋白质
❖ 溶液pH在蛋白质等电点以上时，重金属盐类 (如 Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等)易与蛋白 质结合成不 溶性盐而沉淀。
❖ 重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常 用重金 属盐除去液体中的蛋白质。但应注意， 在使用某些 重金属盐(如硫酸铜或醋酸铅)沉 淀蛋白质时，不可 过量，否则将引起沉淀再 溶解。此时的溶解为生成 憎水胶体的缘故。
❖ 溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸 的作用最为灵敏而且特异。因此被用于蛋白质的首 选沉淀剂，只能沉淀蛋白质，不能沉淀其水解产物， 加热可除去。
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8
三、实验材料
❖ 实验材料： 鸡卵清蛋白液，吸管（1mlx4， 2mlx4，0.5mlx1， 5mlx2），试管 （1.5x15cmx14），水浴锅，滴管，电炉
❖ 实验试剂： 苯酚（0.5%），硫酸铜（1%）， 硫酸铵固体，95%乙 醇，NaCl，醋酸铅，鞣 酸，苦味酸，冰醋酸
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9
四、操作步骤
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五、问题与讨论
❖ 1、本次实验结果如何？ ❖ 2、蛋白质可逆沉淀和不可逆沉淀有什么区别？
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11
?蛋白质的变性与沉淀之间没有必然联系蛋白质沉淀反应蛋白质沉淀反应一蛋白质的盐析作用二乙醇沉淀蛋白质三重金属盐类沉淀蛋白质四生物碱试剂沉淀蛋白质蛋白质沉淀反应一蛋白质的盐析作用?加盐类如硫酸铵硫酸钠氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜同时又中和了蛋白质分子的电荷因此使蛋白质产生沉淀这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析
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《盐析法分离蛋白质》课件
盐析法分离蛋白质的步骤
制备盐溶液并调节pH值
选择合适的盐浓度并准确调节溶液的pH值。
加入待分离的蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液添加到盐溶液中。
分离出蛋白质
通过盐析作用，蛋白质会从溶液中沉淀下来形成团块，可以进行进一步的纯化和分析。
实验注意事项
1 卫生和安全
实验过程中应注意卫生和安全，佩戴实验室 个人防护装备。
《盐析法分离蛋白质》 PPT课件
# 盐析法分离蛋白质 本课程将介绍盐析法分离蛋白质的基本原理、步骤及实验注意事项。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 简介
盐析法是一种常用的蛋白质分离方法。通过利用盐对蛋白质溶解度的影响，可实现蛋白质的有效分离与纯化。
盐析法的原理
盐析法利用盐对蛋白质溶解度的影响，达到分离蛋白质的目的。盐对蛋白质 溶解度的影响是因为盐对水分子的结构及运动方式产生影响。
2 盐溶液浓度
制备盐溶液需要注意选择合适的盐浓度，以 保证盐析效果。
3 pH值的调节
4 蛋白质检测
调节pH值时，应注意正确使用pH计，确保pH 值的准确度。
分离出的蛋白质需要进行检测，可使用凝胶 电泳等方法，以确认纯度和分子量。
结束语
掌握盐析法分离蛋白质的基本原理及操作步骤对于生物学研究具有重要意义。 希望本课程能为大家提供有益的指导和帮助。
《蛋白质分离、纯化》PPT课件
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
16
凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
整理ppt
43
蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
整理ppt
44
• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
整理ppt
12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
整理ppt
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带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
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凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
整理ppt
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蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
整理ppt
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• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
整理ppt
12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
盐析法除蛋白质
盐析法除蛋白质盐析法是在中药水提液中,加入无机盐至一定浓度,或达饱和状态,可使某些成分在水中溶解度降低,从而与水溶性大的杂质分离。
常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。
原理：蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。
当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。
同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
1 中性盐沉淀（盐析法）在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。
除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。
盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备。
λ②操作简单、安全。
λ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
λ⑴中性盐沉淀蛋白质的基本原理λ蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。
亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。
因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
盐析示意图如下页“图4”所示。
λ⑵中性盐的选择λ常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：λ1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。
由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。
盐析法分离蛋白质ppt(共27张PPT)
盐析机理示意图
盐析的机理
①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解 蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏 了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；
②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；
③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的 极化，使水活度降低。
盐析沉淀基础
3 等电点沉淀实例
①从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝，可先于左右 进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3．O)。工业 生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至除去碱性蛋白质，再调pH至除 去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。
②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调后出现含碱性磷酸酯酶 的沉淀物，离心收集沉淀物。用的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液重新溶
解，加入20～40%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀TrisHCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。
4 有机溶剂沉淀原理图
有机溶剂沉淀实例
5 选择性热变性沉淀实例
酵母干粉中加入0.066 mol/L磷酸氢二钠溶液， 37℃水浴保温2 h，室温搅拌3 h，离心收集 上清液，升温至55℃，保温20 min后迅速冷 却离心去除热变性蛋白，上清液中多为热稳 定性较高的醇脱氢酶。
图7 不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25℃） (○)NaCl; (▼)KCl; (◘)MgSO4; (▲)NH4)SO4; (●)Na2SO4; (□)K2SO4; (■)柠檬酸三钠
温度的影响
pH对β的影响
蛋白质起始浓度的影响
二次盐析
盐析操作
①从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝，可先于左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3．O)。 ③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。 ①从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝，可先于左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3．O)。 ①从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝，可先于左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3．O)。 ②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。 不同蛋白质的溶解度曲线 图7 不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25℃） (○)NaCl; (▼)KCl; (◘)MgSO4; (▲)NH4)SO4; (●)Na2SO4; (□)K2SO4; (■)柠檬酸三钠 3)时，先调pH至除去碱性蛋白质，再调pH至除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。 ②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。 3)时，先调pH至除去碱性蛋白质，再调pH至除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。 ②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。 工业生产胰岛素(pI＝5. ②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。 ②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。 3)时，先调pH至除去碱性蛋白质，再调pH至除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。
蛋白质的分离纯化ppt课件
质 ►每一个蛋白质分子都因为结合了许多
的 纯 化 方 法
的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白 质分子原有的电荷则可以忽略。该法 主要利用了蛋白质分子量大小不同而 分离蛋白质。
►用已知分子量的蛋白质作为标准，则
可以估算出不同蛋白质的分子量。
等电聚焦
►将两性电解质(eg:pH3-9，pH5-7)
同蛋白质样品一起加入到已经灌好
►亚基个数的测定：采用SDS聚丙烯 酰胺凝胶电泳方法测定。
也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。 ► 具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。 ► 常用分子筛：
葡聚糖凝胶（Sephadex）
型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐
琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）
塑料离心 管
大分
子
4%
量
由
8%
小
12 蔗糖浓度
%16 %
—————
%20
% 蔗糖密度梯度
（介质还可用：氯化铯、甘油等）
电泳法
► 类型：பைடு நூலகம்、区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、
细丝电泳、凝胶电泳。 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅
胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电
2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白 质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分 子量的大小成正比变化。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
► 由于不同蛋白质的SDS复合物具有相同的荷质 比，并具有相似的构象，因而有如下公式：
lgM=K1—K2μR
（K1、K2为常数，μR为相对迁移率）
第六章-蛋白质的分离、纯化PPT课件
a． 分散相质点1-100nm b． 分散相质点带有同种电荷，互相
排斥不聚成颗粒而沉淀 c． 分散相的质点能与溶剂形成溶剂
化层
2021/3/12
16
蛋白质：
a. 胶体质点的范围
c． 丁达尔效应 d． 布朗运动 e． 不能透过半透膜
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2．蛋白质的沉淀
2021/3/12
18
沉淀蛋白质的方法：
因此，所有SDS-蛋白质复合物， 电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极 移动。
② 改变了蛋白质单体分子的构象。
2021/3/12
8
• SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴 直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的 分子量而成正比例地变化。 电泳迁移率μ与多肽链分子量的对数有 下列关系
2021/3/12
① 盐析法：
中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等）－→ 蛋白质脱去水化层
优点：不引起蛋白质变性 ② 有机溶剂沉淀法：
极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）－→ 脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点 间的相互作用
条件：低温操作 缩短时间
2021/3/12
பைடு நூலகம்
19
③ 重金属盐沉淀法
当溶液pH>pI,蛋白质颗粒带负电荷, 易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)－→生成沉淀
∵在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响 F．蛋白质可看作一个多价离子
2021/3/12
3
• 蛋白质等电点--在某一pH值，蛋白质所 带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷 为零。这一pH称为蛋白质等电点
2021/3/12
4
• 等离子点--没有其他盐类干扰时，蛋白质 质子供体基团界离出来的质子数与质子 受体基团结合的质子数相等时的pH称等 离子点。特征常数。
排斥不聚成颗粒而沉淀 c． 分散相的质点能与溶剂形成溶剂
化层
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蛋白质：
a. 胶体质点的范围
c． 丁达尔效应 d． 布朗运动 e． 不能透过半透膜
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2．蛋白质的沉淀
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18
沉淀蛋白质的方法：
因此，所有SDS-蛋白质复合物， 电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极 移动。
② 改变了蛋白质单体分子的构象。
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8
• SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴 直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的 分子量而成正比例地变化。 电泳迁移率μ与多肽链分子量的对数有 下列关系
2021/3/12
① 盐析法：
中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等）－→ 蛋白质脱去水化层
优点：不引起蛋白质变性 ② 有机溶剂沉淀法：
极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）－→ 脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点 间的相互作用
条件：低温操作 缩短时间
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பைடு நூலகம்
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③ 重金属盐沉淀法
当溶液pH>pI,蛋白质颗粒带负电荷, 易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)－→生成沉淀
∵在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响 F．蛋白质可看作一个多价离子
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• 蛋白质等电点--在某一pH值，蛋白质所 带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷 为零。这一pH称为蛋白质等电点
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4
• 等离子点--没有其他盐类干扰时，蛋白质 质子供体基团界离出来的质子数与质子 受体基团结合的质子数相等时的pH称等 离子点。特征常数。
蛋白质分离技术(全)PPT课件
• 为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加 入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入KCl、NaCl、 NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的极性。
14
• 2) pH值：蛋白质、酶的溶解度和稳定性与pH值有 关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=6 ～8范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定 范围内，通常选择偏离等电点的两侧。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
26
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
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⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
29
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
•
0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃
（NH4)2SO4 70.6 75.4
95.3
103
Na2SO4 4.9 18.9
43.3
42.2
NaH2PO4 1.6
14
• 2) pH值：蛋白质、酶的溶解度和稳定性与pH值有 关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=6 ～8范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定 范围内，通常选择偏离等电点的两侧。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
26
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
25
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
29
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
•
0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃
（NH4)2SO4 70.6 75.4
95.3
103
Na2SO4 4.9 18.9
43.3
42.2
NaH2PO4 1.6