组蛋白的WESTERN注意事项

以下为组蛋白电泳与转膜的一些注意事项，其它步聚同一般的western操作。

上样量：0.75mm 厚的 10孔梳所制胶孔的最多上样量为20ul。0.5-1ug 总组蛋白/孔。如果用1mm厚的10孔梳，上样量可能多一些，25ul。【BioRad】

电泳【BioRad电泳设备】：SDS-PAGE时，分离胶浓度为 14-16%。选恒压：150V, 约电泳50min-70min.。蛋白分子量标准：低分子量

转膜：

用NC膜，转膜缓冲液含20% 甲醇, 0.04% SDS。湿法转膜，75V, 4h-6h, 为了防止发热，我们当时转膜时把转膜电泳槽放在冰盒中进行。

如果用PVDF膜，则省去上述转膜缓冲液中的SDS。恒压100V、2小时能够转移一半蛋白到膜上。更长的转膜时间可能能够提高转移的量。

转膜后，将膜取下用Pouseau S染色，检查是否转膜成功、样品间蛋白量是否一致。

同时用考玛氏亮蓝对胶进行染色，检查胶上的蛋白殘留量。如果转移充分，应看不到明显的蛋白带。

Bulk Histones 通过 SDS-PAGE分离，会由上至下显示出以下蛋白带: H1, H3,

H2A/H2B, H4。但这些带靠得非常近。