组蛋白的WESTERN注意事项

Western blot 实验步骤及其注意事项

Western blot 实验步骤及其注意事项注意事项：western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。

这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。

实验中取胶和膜需带手套。

Western可以参考如下步骤进行操作。

1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。

对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

如果使用碧云天生产的Western及IP 细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。

该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE 的配方。

(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。

Western_blot的原理、操作及注意事项

Western_blot的原理、操作及注意事项Western blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移⾄固相⽀持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进⾏检测，蛋⽩质的Western 印迹技术结合了凝胶电泳的⾼分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低⾄1～5ng（最低可到10－100pg）中等⼤⼩的靶蛋⽩。

⼀、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理⽅法：组织洗涤后加⼊3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加⼊5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离⼼，取上清。

加⼊β-ME(9.5ml加⼊0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加⼊0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，⽤时取出，直接溶解上样。

2 细胞：细胞的处理⽅法：离⼼收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加⼊5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离⼼，取上清。

加⼊β-ME(9.5ml加⼊0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加⼊0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，⽤时取出，直接溶解上样。

3 分泌蛋⽩的提取（特例）：直接收集分泌液，加⼊β-ME、溴酚蓝制样。

B：蛋⽩的定量⽅法及影响蛋⽩定量原因1.双缩脲法：双缩脲法是第⼀个⽤⽐⾊法测定蛋⽩质浓度的⽅法。

在需要快速，但不很准确的测定中，常⽤此法。

硫铵不⼲扰显⾊，这对蛋⽩质提纯的早期阶段是⾮常有利的。

双缩脲法的原理是Cu2+与蛋⽩质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝⾊络合物，此物在540nm波长处有最⼤吸收。

双缩脲法常⽤于0.5g/L～10g/L含量的蛋⽩质溶液测定。

⼲扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。

可⽤沉淀法除去⼲扰物，即⽤等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋⽩质，然后弃去上清液，再⽤已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋⽩质进⾏定量测定。

western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项

Western blot检测蛋白质的表达实验的结论通常包括以下几个方面：
1. 蛋白质的表达水平：通过比较目标蛋白质与内参蛋白质的信号强度，可以得出目标蛋白质在样本中的表达水平。

2. 蛋白质的分子量：通过比较标准蛋白的分子量和目标蛋白质的分子量，可以确定目标蛋白质的分子量。

3. 蛋白质的特异性：通过比较阳性对照和阴性对照的信号强度，可以确定目标蛋白质的特异性。

在Western blot检测蛋白质的表达实验中，需要注意以下事项：
1. 样本制备：确保样本的质量和数量，避免样本降解或污染。

2. 抗体选择：选择特异性好、灵敏度高的抗体，避免出现非特异性反应。

3. 实验条件：保持实验条件的稳定和一致性，避免影响实验结果的可重复性。

4. 数据分析：对实验数据进行准确的分析和解释，避免误导实验结果。

总之，Western blot检测蛋白质的表达实验是一种常用的生物化学技术，可以用于研究蛋白质的表达、功能和相互作用等方面。

在实
验中需要注意细节和规范操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。

Western Blot 实验技术操作及注意事项,实验准备,样品制备,实验技巧

常用的转移膜主要有PVDF膜( Polyvinylidene-
Fluoride)和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白质的结
合能力高,灵敏度高,不易破碎,同时也适用于再次标记
(PVDF膜使用前需浸泡在甲醇中以增加膜的亲水性)。
✓其他注意事项
而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。
1. 从负极（黑板）到正极（透明板）方向依次：纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤
✓膜标记正反面转膜后有时会分不清膜的正反面。凝胶电泳时使用
有色分子量 Marker或转膜后在膜上稍微剪断一个角(可自由决定剪断方向),会有利于判断膜的方向。 ✓其他注意事项 1. 封闭时间不宜过长，封闭时间过长会抑制抗原抗体
反应及标记抗体的酶活性。 2. 注意避免让膜变干。
4.一抗反应
✓一抗的选择抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别
1 × TBST缓冲液配制：TBS粉末，溶于2L蒸馏水中，再加入2mL TWEEN - 20。
9. Western Blot实用小技巧
9. Western Blot实用小技巧
谢谢大家
组织取绿豆粒大小（30~50 mg ）组织，加入预冷的RIPA裂解液，按照质量体积比1：10 比例加入RIPA 裂解液（PMSF和PIC 1:100 v/v ）。然后予以组织匀浆机处理，全程在冰上操作。匀浆结束后，将所有样本静置于冰上30 min，
上述裂解液离心，4 ℃ 12 000 rpm 离心 20 min 收集上清（即蛋白原液），避免吸到沉淀。吸取10uL蛋白用于定量，剩余蛋白加入5 x loading buffer 进行充分混匀（5 loading buffer和蛋白组织液比1:4），在98 ℃条件下加热10 min，然后进行分装后保存于-20 ℃冰箱中。

western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项

western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。

下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。

实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。

2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。

3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。

通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。

注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。

使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。

2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。

同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。

3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。

转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。

4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。

需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。

5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。

western blot技术的原理方法注意事项

western blot技术的原理方法注意事项一、原理Westernblot是一种常用的蛋白质检测技术，其基本原理是蛋白质的印迹技术，即把蛋白质从复杂的样品中分离出来，并转移到固相支持物上，再与特异性抗体结合，通过显色或电子显微镜观察鉴定蛋白质的表达和分布情况。

二、方法1.样品处理：首先，需要将蛋白质样品进行提取、分离和纯化。

根据样品性质，可以采用不同的提取方法，如细胞裂解液、组织匀浆液等。

2.凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品转移到分离胶中，通过电泳将不同分子量的蛋白质分离。

3.免疫反应：将膜上的蛋白质与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。

4.显色反应：通过化学反应，使抗原-抗体复合物显色，便于观察和拍照。

5.电子显微镜观察：对于较小的样品，可以采用电子显微镜对蛋白质进行观察和定量分析。

三、注意事项1.样品处理：提取的蛋白质样品应尽可能保持完整性和纯度，避免在提取、分离和转移过程中发生变性或降解。

2.凝胶电泳：分离胶的选择应根据待测蛋白质的分子量大小进行，以确保蛋白质能够完全分离。

同时，应注意电泳过程中的电压、电流和时间等参数，避免过度电泳导致蛋白质失活或降解。

3.免疫反应：应注意抗体滴度的选择，确保抗体能够充分识别目标蛋白质。

同时，应避免使用过期或质量不佳的抗体。

4.显色反应：应注意显色试剂盒的质量和操作步骤，确保显色反应充分且颜色易于观察。

同时，应注意显色颜色的稳定性，避免因颜色不稳定影响结果判断。

5.电子显微镜观察：应注意电子显微镜的操作步骤和设备维护，确保电子显微镜能够正确成像。

同时，应注意样品的制备和处理，确保样品能够被电子显微镜准确观察。

6.实验条件：实验过程中应注意调整实验条件，如孵育时间、洗膜次数、抗体稀释度等，以确保实验结果的准确性和可靠性。

7.重复性：在进行Westernblot实验时，应注意重复性实验的开展，以减少实验误差和提高实验结果的可靠性。

总之，Westernblot技术虽然复杂，但只要掌握了其原理和方法，并注意以上注意事项，就能够获得准确可靠的结果。

Western Blot(WB)操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查

Western Blot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查第一部分 WB操作中需要注意事项一、蛋白样品的准备1、样品质量所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。

这会直接影响到样品浓缩的效果。

此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。

2、细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB一般5×106就足够3、小分子量蛋白10KD需要的注意点1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE 体系2）也可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。

也可以将两张膜叠在一起，再转移。

其他按步骤即可4、大分子量蛋白200KD需要的注意点1）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）3）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高二、制胶1、凝胶质量不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。

因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。

2、在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象1）加水时不能对着胶冲，要沿着玻璃板缓慢流行2）加水满后一定要保证上方水平面是平齐的3）加胶要避免气泡，也要避免加胶太慢而提前凝固等现象4）有其他人的经验是用异丙醇封胶封胶后左右晃一下三、加样1、点样样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。

因此，建议点样最好用长枪头，或者加样器，轻轻的将样品加到孔的底部。

蛋白Western_blot技术

蛋白Western blot技术1.transfer：先用甲醇浸PVDF膜1min（可用铅笔在一角标记，分别正反面），沥干放入transfer buffer（应该要重新配置了，上次配置的液体使用太久），海绵、滤纸也放入transfer buffer浸湿；按以下顺序从下往上放置：黑色塑料板、海绵、滤纸、胶、PVDF膜, 滤纸、海绵、白色塑料板，可用垫片（我个人觉得玻璃棒或者移液管比较好用）刮尽胶与滤纸之间的气泡（一定要刮干净气泡，不然会导致蛋白不能在有气泡处转移），最后可用橡皮筋加固（顺序不能颠倒，橡皮筋固定可以省略）；2.放入仪器时，相同颜色的在同一侧（黑色对黑色，白色对红的）；设置运行参数：200mA，3hr或100 mA过夜；3.Blocking：PBS + 4-10%脱脂奶粉，室温，2hr或4︒C过夜（我们一般是从早上8：00－9：00将摇床与膜置于4︒C冰柜中blocking到下午4：30左右）；4.倒掉封闭液（应将膜的一角用镊子夹起，倒掉奶粉，并用自来水洗涤干净盒子，最好用PBST缓冲液润洗一次，注意膜的正反面千万不能弄错，否则蛋白会从膜上磨下来），PBS--0.05%Tween 20洗三次，各5min，每次加的洗涤液体宜超过100ml；5.Primary Antibody（血清）与PBS--0.05%Tween 20按1∶5000—1∶20000的比例混合浸泡膜1hr；（我们的亚历山大藻用1：5000，东海原甲藻1：2500基本上就应该可以做出不错的结果，具体的滴度可以根据你做实验的情况调节，若背景太高，调低滴度，显示的点太少，调高滴度）6.PBS--0.05%Tween 20洗五次，各5min；（可以不用每次都夹起膜，第一次夹起就好啦）7.Secondary Antibody与PBS--0.05%Tween 20按1∶5000—1∶20000的比例混合浸泡膜1hr；(我们的二抗滴度都是使用1：5000就好)8.PBS--0.05%Tween 20洗七次（如背景太黑，需更多次），各5min；9.Develop color：染色（ECL）、操作注意事项：超作到第7次时，准备ECL的试剂，两个瓶子中的液体千万不能混淆，枪头一定要换！！！否则ECL试剂盒会完全作废。

western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项 -回复

western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项-回复西方博LOT检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项引言：蛋白质是细胞功能的重要组成部分，对于研究蛋白质的表达和功能非常关键。

西方博LOT（Western blot）是一种常用的蛋白质检测方法，可以用于分析特定蛋白质的表达水平、鉴定蛋白质的大小和相对丰度以及判断蛋白质的分子量。

本文将介绍西方博LOT检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项。

一、实验结论：1. 确定目标蛋白质的存在与否：在Western blot实验中，通过探针的特异性结合，可以确定目标蛋白质在待检样品中的存在与否。

如果探针与待检样品中的蛋白质结合，会出现特异的蛋白质带，从而可以确定目标蛋白质的存在。

2. 确定目标蛋白质的大小和相对丰度：通过Western blot实验的结果，可以确定目标蛋白质的大小和相对丰度。

在蛋白质电泳分离后，较大的蛋白质会相对较靠近电极负极，较小的蛋白质会相对较靠近电极正极。

通过与已知分子量蛋白质标准曲线的对比，可以确定待检样品中目标蛋白质的分子量。

3. 分析蛋白质的表达水平：通过Western blot实验的结果，可以分析目标蛋白质在不同样品中的表达水平。

通过比较待检样品中蛋白质带的强度，可以初步判断蛋白质的相对表达量。

进一步，可以使用图像分析软件对蛋白质带的强度进行定量分析，获得更精确的表达量数据。

二、实验注意事项：1. 样品处理：西方博LOT实验的样品处理是关键的一步。

样品的存储和处理方式可能会对实验结果产生影响。

为了保持蛋白质的完整性和稳定性，样品应尽快冷冻保存，并在实验前严格遵循相关处理方法。

2. 磷酸盐缓冲液的配制和pH调整：磷酸盐缓冲液是Western blot实验中的关键试剂，用于制备电泳缓冲液、转膜缓冲液和洗涤缓冲液。

正确配制磷酸盐缓冲液的浓度和pH值是确保实验的准确性和稳定性的重要因素。

3. 蛋白质的电泳分离和转膜：蛋白质的电泳分离要求严格的电泳条件。

western实验步骤与注意事项

葵花宝典致亲爱的师弟师妹：本着不希望你们来到实验面临一些束手无策的窘境，师姐在这里把自己所学和资源略写一二。

一、来到实验室，无论你喜欢不喜欢，乐不乐意，一定要把实验室的师兄师姐的名字都记住，以及实验室里有什么仪器！！！二、关于实验部分1、组织蛋白提取：方法一：（1）4℃下，先生理盐水洗，再加入蛋白提取液，剪刀剪碎，匀质器6000，循环六次，每次都拿下来冰镇，防止蛋白变性，最后14000转，20min，4℃（2）跑western之前，需测BCA，以保证每个组分上样的蛋白总质量一样（此处为定量实验，看目标蛋白的表达量，若仅仅定性则无需做BCA）注意事项：匀质器需要用的小管和玻璃球在郝荣华师姐那里，先加玻璃球一般，目测大概三四毫米高度就行（包括管底小尖尖），且溶液必须装满才振荡效果好，因此，加入细胞裂解液多，容易导致蛋白浓度低。

方法二：（1）取冰（东边实验室，最后面有制冰机）（2）将软骨从﹣80℃冰箱取出，置于冰面上解冻（3）去细胞室的液氮罐里，取出少量液氮置于泡沫箱内，（4）转移至实验室内，取出少量，倒入研钵中，研磨（5）浆糊状，立即转入EP管中，（6）细胞裂解液，2、western blotting（1）抗体购买1. Antigen,也就是抗原名称,最好是英文全称,许多客户只说简称,要知道不同的抗体其简称有可能会一样的.有中文最好也提供一下.2. Reactivity,即反应性,也就是实验用于什么特种,是人,大鼠还是小鼠等3. Host,宿主,就是抗体来源,这个主要和二抗有关系。

一抗来源必须要和二抗搭配,且不能和样本来源相同。

比如,二抗是羊抗小鼠,一抗就要选择小鼠来源的.不少客户常常是先有二抗,再买一抗,受限制得很,其实应该先订一抗,再买二抗,毕竟一抗贵,为了将就一个100元左右的二抗,而把几千元的一抗的订购弄得很复杂,真是不划算.所以,不要为了二抗伤脑筋4. Conjugate,即缀合物或标记物,如是不是需要FITC标记,HRP标记等情况,也最好说明5. Applications,就是应用. 你买这个抗体用于做什么实验,是IHC还是WB,这点一定要说,要知道,抗体开发出来,不是什么实验都能用或都会效果好,抗体公司说明上写着能做的实验是经过验证的,没有写的不是说一定不能做,也可能可以做,但没有验证,厂家不会乱说的,也是科学，负责的态度.例如,你要是想做IHC-P,就是石蜡切处的免疫组化,如果买不到抗体明确说可以做,你要用就得冒风险,好在现在抗体厂家众多一般都找得到了（2）β-actin（内参蛋白）分子质量为43KD，因此，目标蛋白不能和内参蛋白分子质量一致，内参也叫看家基因，在组织或细胞中都会表达，且表达量在不同组织或细胞中几乎是相同的，一般有β-ACTIN，GAPDH等。

western blot 检测相关参数及常见问题

Western Blot（WB）检测注意事项及相关参数发布日期：2009-11-16 来源：生技网信息中心浏览次数：985成功完成Western Blot检测，必须满足4 个条件：（1）转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来,如果蛋白质还截留在凝胶中,将无法在膜成功完成Western Blot检测，必须满足4 个条件：（1）转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来,如果蛋白质还截留在凝胶中,将无法在膜上进行分析（2）在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析（3）在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上（4）被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测此外，成功进行WB检测，必须设置合适正确的对照，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性。

一般需要设置的对照如下：阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性内参对照：检测标本的质量和二抗系统空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果附一：WB检测基本过程及相关参数1、获取细胞或组织裂解物1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer,亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！2、蛋白定量常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。

定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C 备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白3、蛋白质的分离根据目的蛋白的性质，利用电泳方法将其进行分离。

为提高电转移的效率，通常采用SDS/PAGE技术。

分离实验结束后，首先将样品墙的上边缘用小刀去除，然后在胶板的右上角切一个小口以便定位，小心放入转移缓冲溶液中待用。

western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项

western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项西方博(Western blot) 是一种常用的蛋白质检测技术，通过将蛋白质样品经过电泳分离并转移到膜上，再使用特异性抗体检测蛋白质的表达水平。

以下是西方博检测蛋白质表达实验的结论和注意事项。

结论：1. 蛋白质的分子量：西方博通过与已知分子量的标准品比较，可以确定待测蛋白质的精确分子量。

根据蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以使用特定的分子量标准品绘制标准曲线，并在曲线上确定待测蛋白质的分子量。

2. 蛋白质的表达水平：西方博使用特异性抗体来检测特定蛋白质的表达水平。

利用特异性抗体与目标蛋白质的特定区域结合，然后使用辅助抗体标记抗体，并通过光学或化学方法检测抗体标记物的表达水平。

比较待测蛋白质与内参蛋白质的表达水平可以确定其相对表达量。

注意事项：1. 样品的提取和准备：蛋白质的准备和提取是西方博实验的首要步骤。

样品应该被充分破碎，并使用适当的提取缓冲液来维持蛋白质的稳定性。

注意，使用不同类型的组织或细胞时，提取条件和方法可能有所不同。

2. 蛋白质的电泳分离：西方博通常使用SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳) 来进行蛋白质的分离。

凝胶的浓度和隔离电泳条件应选择适当，以分离不同分子量的蛋白质。

3. 转膜：将电泳分离的蛋白质转移到膜上是西方博的关键步骤之一。

选用合适的膜（如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素膜），并选择适当的电泳缓冲液进行转膜。

确保蛋白质能够均匀地转移到膜上。

4. 抗体的选择和试验条件：特异性抗体的选择和充分优化是确保实验准确性的关键因素。

保证抗体的特异性和亲和性，并验证抗体的工作浓度。

此外，充分优化抗体和探针的试验条件，包括反应温度、时间和抗体浓度等。

5. 成像和分析：西方博实验完成后，使用适当的成像方法（如化学发光或荧光成像）检测抗体标记物的表达水平。

使用适当的成像系统记录图像，确保信号处于线性范围内。

使用图像分析软件进行定量分析，比较待测蛋白质与内参蛋白质的表达水平。

蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项

蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。

5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。

western注意事项总结

Western 注意事项总结
1、组织提蛋白可以考虑加入液氮后，迅速研磨成粉末后再裂解；
2、蛋白浓度测定：BCA法+紫外吸收峰同时使用时比较精确；
3、在加入10%的AP时开始混匀；
4、跑胶之前，最好做预电泳:电压10V~20V，跑20-30min，这样
有利于清除凝胶内的杂质；
5、跑电泳时电压越小，条带越漂亮：一般上层胶80V，下层胶120V
即可；
6、25kD-80kD蛋白转膜时间一般为1.5-2h较好；
7、转膜一般用稳流200mA左右；
8、出现膜两侧无条带，而中间条带较清晰的情况：可能是由于一
抗不足，建议将膜裁剪后再孵育一抗；
9、CST抗体网站能找到对应抗体的阳性control：找到对应抗体后，
在右边栏目里面有一个control extract，在里面输入抗体货号即
可找到对应抗体的阳性control，一般会有现成的样品买！！。

wb实验操作注意事项

wb实验操作注意事项[WB实验操作注意事项]实验室是进行科学研究和探索的重要场所。

在实验中，我们需要遵守一系列的操作规程和注意事项，以确保实验的安全性和有效性。

WB实验（Western Blot）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测和分离蛋白质。

本文将一步一步回答关于WB实验操作的注意事项。

I. 实验准备在进行WB实验之前，我们需要进行充分的实验准备。

以下是准备阶段的注意事项：1. 实验室卫生保持实验室的整洁和卫生是实验的基本要求。

在实验开始之前，我们应该清理实验台面，并确保所有实验器材和试剂都经过正确的储存和检查。

2. 实验器材和试剂的准备在准备实验器材和试剂时，我们需要特别注意以下几点：- 仔细阅读试剂和器材的说明书，确保使用正确和合适的试剂和器材。

- 对实验器材进行彻底的清洗和消毒，并确保其干燥和完整。

- 准备好所需的试剂，并按照说明书中的要求进行正确的储存和保存。

3. 实验条件的控制WB实验需要在特定的实验条件下进行，例如温度、湿度和光照。

在实验室中，我们应该设定适宜的温度和湿度，并避免直射光照到实验样品，以防止实验结果的偏差。

II. 样品处理1. 样品选择和制备选择合适的样品是WB实验的关键。

我们应该仔细选择样品，并确保其来源的可靠性和纯度。

制备样品时，需要注意以下几点：- 样品的收集和保存应符合实验要求，以避免样品的异化和污染。

- 样品的制备过程应遵循标准的处理和储存条件，例如样品的快速冻结和保存在低温下，以保持样品的活性和稳定性。

2. 样品处理的技术操作在样品处理过程中，我们需要注意以下技术操作的注意事项：- 操作应在无菌和无尘的环境下进行，以避免样品的二次污染。

- 避免样品的过度处理和长时间的超声处理，以避免蛋白质的降解和损伤。

- 注意避免与有机溶剂和酸碱溶液的接触，防止样品的变性和溶剂残留的影响。

III. SDS-PAGE电泳SDS-PAGE电泳是WB实验的核心步骤之一。

以下是该步骤的注意事项：1. 准备电泳相关的试剂和缓冲液在进行SDS-PAGE电泳之前，我们需要准备好相关的试剂和缓冲液。

蛋白质的Western印迹分析

蛋白质的Western印迹分析一、实验注意事项：1、本实验所有操作避免用手直接接触PVDF膜，同时避免折划PVDF膜；2、实验过程中，要一直保持PVDF膜的湿润状态；二、实验流程1．蛋白质电泳：操作流程及注意事项参见《蛋白质的SDS－PAGE凝胶电泳》；2．SDS－PAGE凝胶转膜：1)将蛋白胶放于玻璃板上，测量大小，剪取相同大小的PVDF膜，做好标记，将膜放于100％甲醇内浸润超过10秒；2)剪取相同大小的六块滤纸，三张一份，与胶和PVDF膜放于转膜缓冲液内平衡；3)在转膜上将三张一份的滤纸放于最底层，依次放上蛋白胶、PVDF膜、另外三张滤纸，对齐用玻璃棒赶去所有气泡；根据目的蛋白大小凝胶浓度选择合适电流和时间恒流转膜(一般一块膜75mA,时间2hr)；3．蛋白质的免疫检测：1）在平皿内加入含5％脱脂奶粉的10ml PBS-T(或TBS-T)，脱色摇床摇动将膜封闭2-3hr；2）加入一抗稀释液10ml (含2.5％脱脂奶粉PBS-T)，一抗的稀释比例取决于所用抗体的效价和转到膜上目的蛋白的量，室温反应2小时或者4度过夜；3）大体积（约20ml）PBS-T洗膜3×5分钟；4）加入稀释好的二抗(含2.5％脱脂奶粉TBS-T)5）20 ml TBS-T漂洗3×10分钟；7）将膜放于碱性磷酸酶反应buffer内摇动平衡2分钟8）在一小培养皿中依次加入10 ml碱性磷酸酶反应Buffer、66ul NBT 、33ul BCIP混匀将膜放入，避光反应，并随时检测膜的颜色变化；9）目的条带出现后，大量自来水洗终止反应（或在50ml PBS-T内加入200ul0.5 mol/L EDTA，用之终止效果更佳），照相保存；三、实验所需试剂：1．转移缓冲液1L：39mM甘氨酸：2.9g48mM Tris：5.8g0.037%SDS：0.37g20%甲醇：200ml2．碱性磷酸酶缓冲液100ml：100mM NaCl5mM MgCl2100mM Tris-Cl pH9.53、PBS-T 1L pH 7.5：1M 磷酸二氢钠31.6ml1M 磷酸氢二钠68.4mlTween 20 0.1% 1ml水900ml，调pH后定容1L4、TBS-T 1L pH 7.6：Tris 2.42gNacl 8gTween 20 1ml水900ml，调pH后定容1L；5、封闭液100ml：100ml TBS-T内加入5克脱脂奶粉6、一抗稀释液100ml ：100ml PBS-T内加入3-5克脱脂奶粉7、二抗稀释液100ml ：100ml TBS-T内加入3-5克脱脂奶粉。

westernblot煮蛋白要点

westernblot煮蛋白要点Western blot煮蛋白是一种常用的蛋白质检测技术，通过分离蛋白质、转移到膜上、染色等步骤，可以检测特定蛋白质在混合蛋白质中的存在和表达水平。

下面将详细介绍Western blot煮蛋白的要点。

第一要点：样品制备在进行Western blot煮蛋白实验前，首先需要提取蛋白质样品。

常用的方法包括细胞裂解液裂解、组织研磨、血清、尿液等来源的蛋白质提取。

在提取过程中需要添加蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂，以保护蛋白质的完整性和活性。

第二要点：SDS-PAGE电泳提取的蛋白质样品需要进行SDS-PAGE电泳分离。

SDS-PAGE电泳是一种以聚丙烯酰胺凝胶为分离介质，通过电场作用将蛋白质按照大小分离的方法。

在电泳过程中，蛋白质会从凝胶上向下迁移，最终形成蛋白质条带。

第三要点：转印完成SDS-PAGE电泳后，需要将分离的蛋白质转移到膜上。

这个步骤称为电泳转印。

常用的转印方法有湿式转印和半湿式转印。

转印过程中，蛋白质会被转移到膜上并固定在上面，为后续的染色和检测提供条件。

第四要点：染色转印完成后，需要对膜上的蛋白质进行染色。

染色可以选择各种染色剂，如Ponceau S染色、Coomassie蓝染色或银染色。

染色后的膜上会出现蛋白质条带，可以根据条带的位置和强度进行进一步的分析。

第五要点：免疫检测Western blot的关键步骤是免疫检测。

在此步骤中，需要将膜与特异性抗体反应，通过抗体与蛋白质的结合来检测特定蛋白质的存在和表达水平。

免疫检测的结果可以通过化学发光或荧光等方法来观察和记录。

第六要点：数据分析最后一步是数据分析。

通过Western blot的结果，可以得到目标蛋白质的表达水平和其他相关信息。

通过比较不同样品之间的差异，可以得出结论并进行进一步的实验设计和研究。

总结：Western blot煮蛋白作为一种常用的蛋白质检测技术，具有高灵敏度和特异性，广泛应用于生物医学研究中。

western 注意事项

Western Blot小问答Ptglab1.什么是western blot?答：WB又称免疫印记法.是将生物大分子物质通过不同途径转移到固相载体的过程。

2.western blot 有什么优点？答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg级。

方便，特异性高。

3.western blot 的具体步骤是什么？答：一. 制样（以提动物组织总蛋白为例），1）组织洗涤后加入3倍体积PBS，0℃研磨。

2）加入5×STOP buffer3）180W, 6mins，0℃超声波破碎4）5000rpm，5mins 离心，取上清。

5）加入REB(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）6）煮沸，10min7）分装，于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。

二．电泳（SDS-PAGE）建议欲检测抗原10－30kd, 用15％胶；30－100kd, 用10％胶；100－200kd，用7.5％胶。

1）配胶（one piece）A.分离胶。

单位：ml。

Total: 8ml7.5％10％15%2×Sep. buffer 4 4 430％Gel.sol 2.0 2.7 4ddH2O 1.9 1.2 0TEMED 8ul 8ul 8ul10%APS 80ul 80ul 80ulB. 浓缩胶。

单位：ml。

Total: 3.5ml3％2×Stacking. buffer 1.730％Gel.sol 0.35ddH2O 1.4TEMED 5ul10%APS 50ul2)点样。

上样蛋白量不应超过30ug/mm2. (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm, 则载荷面为：1mm×5mm=5mm2)，3）电泳。

开始用80V电压，但是当溴酚蓝至分离胶时，用100-120V电压。

4）转移（一块胶）。

A.半干法。

a.取六张滤纸（Bio-Rad，1mm），三张做上层滤纸，三张做下层。

western试验步骤及注意事项

western试验步骤及注意事项W estern实验步骤1．制胶及上样：（1）配制12%SDS-PAGE分离胶，混匀后注入边条厚度为2mm 的两块洁净玻璃板间，其上加一薄层异丙醇，室温下静置至凝固。

（2）待分离胶完全聚合后，倾去其上的水层，以吸水纸吸净残余液体，插入加样梳，缓缓加入浓缩胶，使其充满加样梳间的空隙，室温下静置。

待胶完全聚合。

（3）将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽加入电泳缓冲液。

（4）小心拔去加样梳，使加样孔竖直，以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。

（5）分别取50μg蛋白量的细胞总蛋白样品及蛋白质分子量Marker，按4：1体积比加入5?样品缓冲液，以1?样品缓冲液？配平上样体积（总体积20μ1）后，于沸水浴中煮3min使蛋白变性。

（6）将处理好的样品按照预定的顺序加入分离胶的上样孔中。

2．电泳（1）接通凝胶电泳仪的电源，初始电压70V。

（约30分钟）（2）溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至160V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。

（约60分钟）3．转膜（1）从玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中。

（2）取与胶同样大小的硝酸纤维素膜，以95%乙醇浸泡5秒钟后浸泡于转移缓冲液5分钟以上待用。

（3）按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。

（4）将转移夹放入转移槽，膜在正极、胶在负极，接冷却循环水，90V稳压转移2小时。

4．染色（1）将硝酸纤维素浸入丽春红使用液中，振摇染色5-10min。

（2）蛋白质条带出现后，用去离子水洗去硝酸纤维膜上的丽春红底色。

（3）按照蛋白质分子量Marker指示的位置剪下目的条带所在的硝酸纤维素膜。

5．封闭把硝酸纤维素膜浸入5%脱脂奶粉，室温摇动2小时。

6．洗膜与杂交（1）以T-TBS洗膜，10分钟? 3次。

（2）第一抗体封闭：SPARC单抗以T-TBS 1：200稀释，按0.1ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，4℃振摇过夜。