基因工程论文

基因工程课程设计

题目：基因工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中的应用

姓名：王晓红学号：20103027

年级：10级3班专业：生物技术专业

指导教师：朱常香

山东农业大学生命科学学院

二014年

一．选题依据

课程设计目的

●了解工业生产中的新型育种技术并比较不同育种技术的优势；

●学习理解基因工程育种技术及其操作原理；

●研究基因工程育种技术在人干扰素生产中的创新。

基因工程作为21世纪的一种新型生物技术，应用基因工程育种技术重组大肠杆菌BL21(pBAI)生产人干扰素a2b, 通过优化补料分批培养时葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表达量和表达速率。

利用这些技术，可以直接地、有针对性地在DNA分子水平上改造生物的遗传性状。通过转入外源基因，微生物和动、植物细胞可以产生出自身原来没有的蛋白质。同样，利用重组DNA技术，也可以使一些原来存在量极低但有重要工业或医学用途的小分子(抗生素)或蛋白质之外的大分子物质得以大量生产。特别是随着重组DNA技术的完善和发展，以基因水平为核心的现代分子定向育种技术越来越受到工业微生物育种学家的关注，并展示了良好的应用前景。

二．文献综述内容

1972年美国的Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV 40DNA、λ噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年，美国斯坦佛大学的Cohen和Boyer等人在体外构建出含有四环素和链霉素连个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，该重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的诞

生。在二十世纪八十年代以来，随着大批大批成果的出现及应用，基因工程带来了一场新的革命。

٧-干扰素具有较强的免疫调节、细胞抑制功能和抗病毒活性功能,在临床上有一定的应用价值。由于天然-干扰素来源有限,产量甚微,因此有关-干扰素的基因工程技术研究[1,2]十分活跃,并带动了重组人干扰素-(rIFN-)下游技术的研究[3]。优化发酵工艺以获得稳定的高质量发酵产物,可以降低下游技术中分离纯化的成本和难度。但是,不能得到稳定的高效表达产物是基因工程中普遍存在的问题[4],除表达系统本身因素外,还涉及诸多其它因素。通过对pBV220IFN-DH5工程菌高效表达rIFN-因素的研究,并选择合适条件分离包含体,获得了rIFN-含量和活性都很高的粗提液。采用高效疏水色谱法(HPHIC)对rIFN-进行一步同时纯化与复性,方法不仅简单、快速,而且避免了采用大量溶剂稀释复性和通过透析除去变性剂的麻烦。

1.基因工程育种

基因工程育种是在基因水平上，运用人为方法将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，与载体连接，然后导入另一细胞，使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达引，与前几种育种技术相比，基因工程育种技术是人们在分子生物学指导下的一种自觉的、能像工程一样可预先设计和控制的育种新技术，它可实现超远缘杂交，因而是最新最有前途的一种育种新技术。基因工程技术的全部过程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段与基因载体的体外连接、外源基因转入宿主细

胞和目标基因的表达等主要环节。

2.运用基因工程进行定向育种的新技术

●定点突变(site—specific mutagenesis或site—directed

mutagenesis)是指在目的DNA片断(例如：一个基因)的指定

位点引入特定的碱基对的技术，其包括寡核苷酸介导的定点

突变、盒式诱变以及以PCR为基础的定点突变。近十年来，

定点突变技术获得了长足的发展，并且在此基础上又发展了

很多新技术。例如：重叠延伸PCR法(Overlap Extension PCR

简称EO—PCR)、大引物PCR法(Megaprimer PCR)、一步重

叠延伸PCR(One—stepOverlap Extension PCR，简称

OOE．PCR)、单管大引物PCR(Single—tube Megaprimer PCR)、

快速定点诱变法、多位点环状诱变法TAMS(Targeted

Amplification of Mutant Strand)定点诱变技术。在这些技术中，

单管大引物PCRTAMS定点诱变技术最为简单和适用，并得

到广泛的应用。

●TAMS定点诱变技术2003年，Young等报道了一种有目的地扩

增突变链的定点诱变技术(Targeted amplification of mutant strand，TAMS)。该技术能够一次引入多个位点的突变，并且能够有目的地扩增突变链，从而使突变效率几乎达到100％。

●定点突变技术已在蛋白质的结构和功能改造上取得了很大成功。

例如，利用定点突变改变酪氨酰-tRNA合成酶的活性中心，从而

使酶活力提高了50倍；此外，在T4溶菌酶中加入二硫键，显著

提高了该酶的稳定性。

3.易错PCR

DNA聚合酶在进行扩增目的DNA时会以一定的频率发生碱基错配，这一现象恰好提供了一种对特定基因进行随机诱变的可能方法。利用PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因随机诱变的技术就称为易错PCR(Error_prone PCR，简称EP—PCR)。此方法的原理与操作如图3，其操作过程是在Taq DNA聚合酶催化的PCR反应体系中，利用Mn替代天然的辅助因子Mg，使Taq DNA聚合酶缺乏校对活性，同时使反应体系中各种dNTP的比例失衡，因此导致碱基的错配率大大增加，通常约为0.1％。另外，还可以在该反应体系中加入dITP等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平。这种方法可以将错配率最大提高至20％。孔荣等利用易错PCR使D-海因酶对底物的水解活性提高了2.4倍；黄瑛等用易错PCR使短小芽孢杆菌YZ02脂肪酶活性提高了1.31倍，Km值由8.24mmol/L降低至7.717mmol/L，在pH>8.0时的稳定性也较野生型脂肪酶有所提高。

3.DAN重排

DNA重排(DNA shufling)技术是一种利用重组文库的体外定向进化技术，Stemmer于1993年首先提出。

Figure 4 The principle and operation process of DNA shuffling Zhao 等在此基础上发明了一种更加简化交叉延伸程序( STEP)。此技术是在一个PCR 反应体系中以2个以上相关的DNA片段为模板进行PCR反应。引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性、短暂复性(延伸)过程。在每一轮PCR循