四抗菌药物敏感性试验

四、抗菌药物敏感性试验
（一）药敏试验的目的
测定病原微生物对化学治疗药物敏感性的试验称为化疗药物敏感性试验（Drug sensitivity test），简称药敏试验。

药敏试验的主要目的是：①用于测定新的抗菌药物或制剂的抗菌谱；②对病灶分离菌进行流行病学调查，主要应用于测定细菌经过多年后敏感性的变化情况和地区特异性；③在临床治疗感染性疾病时，针对病原菌选择合适的首选药物品种。

（二）药敏试验的原理及种类
药敏试验是通过培养基培养的细菌确定细菌对药物的敏感性方法。

将被检菌接种在适当的培养基上，然后加上不同种类或不同浓度的抗菌药物（或制剂），观察细菌生长发育的速度和程度。

用药后，细菌在培养基上停止生长并且死亡，抑菌圈清晰，说明细菌对药物敏感，药物表现有较强的杀菌作用；用药后，细菌停止生长，但液体培养基经过一定时间后还可能出现浑浊或固体培养基上的抑菌圈不清晰，说明细菌对药物比较敏感，预示药物对被检细菌只是起抑菌作用。

通常判定一种药物对细菌的杀菌或抑菌作用的强度指标是固体培养基中抑菌圈的大小，但这也不是绝对的，因为抑菌圈的大小与药物对培养基的渗透性是密切相关的。

药敏试验方法较多，但在原理上不外乎是稀释法和扩散法两大类。

而扩散法（包括纸片法、管碟法）通常适用于临床治疗选择药物。

（三）常用培养基制作法
1．普通肉汤培养基
牛肉浸膏 3.0克
蛋白胨 10.0克
氯化钠 5.0克
蒸馏水 1000毫升
放在三角烧瓶中，微温溶解后，调节pH值至7.4~7.6，煮沸10分钟，冷却后的pH值为7.2±0.2。

15磅压力下灭菌15分钟（115℃灭菌30分钟）即得。

本培养基可用作为固体、鉴别、选择等培养基制造的基础原料，大部分细菌都能在其中生长。

1．普通肉汤琼脂培养基
照上述普通肉汤培养基的配方及制法，加入15~20克琼脂，加热溶解后，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟，即得。

3．0.5%葡萄糖肉汤培养基
蛋白胨 10克
氯化钠 5克
葡萄糖 5克
牛肉浸膏 3克
蒸馏水 1000毫升
微温溶解后，调节pH值至弱碱性，煮沸后，加葡萄糖溶解，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟，即得。

4．马丁氏（Martin’s）肉汤培养基
蛋白胨液 500毫升
肉浸液 500毫升
冰醋酸 1毫升
醋酸钠 6克
葡萄糖 10克
将蛋白胨与肉浸液混合，加热至80℃，加冰醋酸1毫升，搅拌均匀，再煮沸5分钟，加15%氢氧化钠20毫升，调整pH至7.2。

加醋酸钠6克，再调整pH 至7.2。

继续煮沸10 分钟，用滤纸过滤，每1000毫升滤液加葡萄糖10克，分装于500毫升三角烧瓶，高压蒸汽灭菌（15磅）15 分钟。

本培养基可用作传染性胸膜肺炎病原体等的分离与培养。

5．革兰氏阴性菌（G-N）增菌培养基
胰蛋白胨 20克去氧胆酸钠 0.5克
葡萄糖 1克无水磷酸二氢钾 4克
甘露醇 2克无水磷酸氢二钾 1.5克
枸橼酸钠 5克氯化钠 5克
水 1000毫升将各组分加热溶化，调整pH值至7.0，用滤纸过滤；分装于18×100毫米小试管中，每管约1.5毫升，高压蒸汽灭菌（15磅）15 分钟，置冰箱备用。

用于粪便选择性疾病杆菌，样本接种后，最初6小时无论在室温还是在37℃都有增菌作用。

而在这一时期中，大肠杆菌和变形杆菌等生长很少，故在6小时后，再作用平板分离。

（四）临床用药选择药敏试验法——扩散法（Diffusion method）
扩散法是在琼脂培养基（多采用平板培养基）上接种被检菌，将药物（药剂）配成一定浓度加在培养基上，培养一定时间后观察接种菌是增殖还是抑制.这是测定药物（药剂）对被检菌抗菌力强度的方法，本法可用于多种药物（药剂）对一种细菌的抗菌作用进行同时测定，有利于为临床选择药物。

首先把可流动的固体培养基（加热后的固体培养基）平铺在平皿内冷却使其凝固，在其表面上将菌液（被检菌）均匀地涂抹开（也可将培养基溶解后在其凝固前将菌液与之稀释制成双碟，见后）。

然后在其中以适当的间隔放置已知浓度的药物（药剂）（例如含有药剂的纸片、片剂、滤纸、小钢管等），药液（药物）向培养基内及其周围渗透扩散。

将上述的平皿放在一定的条件下（通常为37℃）的培养箱中培养一定时间（通常为16~24h）。

以是否形成抑菌圈或抑菌带及其抑菌圈大小来判定被检菌对药物的敏感性，测定药物（药剂）的抗菌强度。

1．敏感性圆片法（Sensitivity disc method）
本法所使用的圆片即含有一定量的抗菌药物的干燥圆形滤纸（或片剂）。

使用这些圆片检查病料中细菌的敏感性的方法有间接法和直接法两种。

间接法是将脓汁、血清、粪便滤液等临床材料在不含药物的分离培养基中进行分离培养后，采取分离培养的典型菌落进行敏感性试验。

直接法是将病料直接涂抹在琼脂培养基上，在其上放置含药纸片进行培养观察细菌对药物的敏感性方法。

在接种有病原菌的琼脂培养基上，放置含有药剂的纸片的地方，如果其药物对病菌有抑制作用，则在其纸片的周围会出现抑菌圈或抑菌带，测量其抑菌圈（带）的有无及其
大小就可能判定菌株对药物的敏感性。

直接法以非混合感染只含有某一种细菌的脓汁、血清、粪便滤液等作为被检材料时，其优点是它比间接法能更快地得到结果，缩短药敏试验的时间。

但若在被检材料中除目的病原菌以外，还混有其他细菌则会给结果判定带来困难。

间接法虽然需要时间，但能从临床病料中较准确地测定目的病原菌对药物的敏感性。

（1）单一药物浓度圆片法
即采用含有一种药物浓度的圆片所进行的药敏试验法。

其操作过程如下：琼脂平板用培养基制备要求培养基中不含使药物抗菌力降低的成分，而且应选择对多种细菌都能生长发育良好的培养基（见普通肉汤培养基）。

平板的制备将融化的琼脂培养基约20毫升倒入内径为85~90毫米的玻璃或塑料平皿中制成平板，操作应在水平的平面上进行，使培养基均匀水平地分布在平皿内（有要求血液的被检菌时，如链球菌、肺炎球菌、白喉菌、巴氏杆菌等）应在普通肉汤琼脂培养基中加5%的血液。

琼脂平板凝固后，在接种前应放在孵化器中30 分钟使琼脂表面水汽干燥。

菌量及接种法被检菌液，用灭菌生理盐水等制备成5×108个/毫升的菌液，用1白金耳（约0.05毫升）在琼脂培养基表面上接种，接种采用直径为4~6毫米的灭菌玻璃球20个滚动使菌液均匀涂布在整个平皿琼脂平板的表面（约使琼脂表面的菌数为1~10×104/cm2）。

圆片的放置与培养用灭菌镊子轻轻地夹起含药圆片，放置在培养基的表面，使圆片与琼脂面紧密相贴，通常可在一个平板培养基上等间隔放置3~6个圆片，放置圆片后立即放到37℃的培养箱内培养（16~24小时，平皿应盖上陶瓷盖）。

结果判定培养后，测定圆片周围抑菌圈的直径，将该药剂对被检菌敏感性的抑菌圈直径与敏感标准的抑菌圈相比较，判定结果分为4级：最敏感（+++）；相当敏感（++），稍敏感（+）；耐药（-）。

另外，用本法，根据其抑菌圈的出现可求出最小抑菌浓度（MIC）。

由于各种因素如培养基种类、平板培养基厚度、接种的菌量、药物在培养基中的扩散能力、培养时间，均能影响试验结果。

因此测定时应尽可能将试验条件保持一致，降低测定误差。

（2）三种浓度圆片法
本法是采用一种药物（药剂）含有高、中、低3个等级药物浓度的圆片组成的药敏试验法。

操作过程与上述一种浓度法基本相同，但在判定时不需再测定抑菌圈直径，因此，培养基的种类、培养基量、接种菌量对结果的判定影响不是十分明显，且在一个平板上可放置3种（9片）纸片。

判定方法根据含药圆片周围有无抑菌圈来确定其敏感性。

具体地说，从圆片周边算起有1毫米以上的抑菌圈时均为阳性，1毫米以下为阴性。

高中低三种浓度圆片都有抑菌圈时为（+++）极敏感；仅中高浓度有抑菌圈时为较敏感（++）；仅高浓度有抑菌圈时为比较有耐药性；高浓度圆片也无抑菌圈时为有耐药性。

2．管碟法
（1）器械琼脂平皿、无菌吸管、无菌小钢管（牛津杯）、无菌镊子、无菌滴管、游标卡尺。

（2）分离并培养被检菌种将病料如脓汁、血液、粪便滤液、组织放在分离选择培养基上培养，挑起典型目的菌落，增殖培养制取菌液并对被检菌液进行
细菌计数。

（3）双碟制备肉汤琼脂培养基底层：将肉汤琼脂培养基液化，取10毫升倒入灭菌玻璃平皿内，放在水平平面上，使培养基水平均匀地铺在平皿内；肉汤琼脂培养基菌层：吸取被检菌液（106~108个/毫升）0.1~1毫升分别与100毫升冷至45—50℃的肉琼脂培养基混匀，取5毫升均匀摊布在底层培养基上。

即得双碟。

（4）待双碟中培养基凝固后，在每碟中均匀放置小钢管（即牛津杯，内径6.0±0.1毫米，高10.0±0.1毫米，外径7.8±0.1毫米）4~6个，用陶瓦盖复盖。

（5）然后将不同种类不同浓度的药液用无菌滴管加入小钢管中（不同浓度的药液以100微克/毫升为起点，用2倍稀释法，使其药液效价为100、50、25、12.5……0.025微克/毫升）。

用蒸馏水作对照。

（6）置37℃恒温箱中培养16~24小时，用游标卡尺量取抑菌圈的大小，判定其结果：
①如果抑菌圈清晰，即表示为杀菌作用；
②如果有抑菌圈，但不清晰，即表示为抑菌作用；
③在一定的范围，抑菌圈的大小一般与药物作用（抗菌）成正比例；
④如果抑菌圈比小钢管（牛津杯）的外径7.8毫米大1毫米，即表示有抑菌作用，因此可根据这一标准，通过试验找出某一药物对某一病菌的最小抑菌浓度（MIC）；
⑤如果没有抑菌圈即表示耐药。

(操继跃)。