纸片扩散法药敏试验

纸片扩散法药敏试验一、原理纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。

在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。

不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。

二、进行药敏实验指征为保证治疗效果，对引起感染的任何病原菌，若不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。

尤其当病原菌属于对常用抗菌药物能产生耐药时，就更需进行药敏试验。

若感染是公认的对某一高效抗菌药物敏感的微生物引起的，就很少需要进行药敏试验了。

三、标本要求参加药敏试验的菌株包括从临床标本中分离的常见的、快生长的菌株，如肠杆菌科菌、葡萄球菌、肠球菌、非发酵糖菌；还包括某些苛养的病原菌，如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌及其他链球菌、淋病奈瑟菌等。

标本内的正常菌群，通常不作药敏。

对每一种可能致病的细菌进行敏感试验时，使用的单个菌落都应选自原始的琼脂平板，鉴定种属的过程常与此同时进行。

不同菌种的混合物不能在同一药敏平皿上进行试验。

除非在临床急症患者的标本（如阳性血培养物）经涂片革兰染色提示单一的病原菌，一般应避免直接用临床标本（如无菌体液和尿液）做药敏试验。

若用临床标本作了直接药敏试验，也必须按标准方法重复第二次药敏。

四、选药原则详见临床实验室标准化研究所（CLSI）对各种非苛养菌和苛养菌进行常规药敏试验和报告时的选药指南表。

表中的抗菌药物可满足绝大多数临床实验室的常规需要，在此表中各种抗菌药物针对具体的菌种或菌群被分成许多纵列，每一列又根据不同的选择要求分成A、B、C、U等不同的组，其中A组药物用于常规和首选试验，其结果也应常规报告。

B组包含一些临床上重要、特别针对医院感染的抗菌药物，可用于首选试验，但只是选择性地报告临床。

例如当细菌对A组同类药物耐药时，可选择性报告B组中的一些结果。

B组其他报告指征包括以下几点：特定的标本来源（如三代头孢菌素对脑脊液中的肠杆菌科菌，或者磺胺甲唑/甲氧苄啶对泌尿道的分离菌株）；多种细菌感染；多部位感染；对A组药过敏、耐受或无效的病例；以流行病学调查为目的向感染控制部门报告。

C组包括替代性或补充性抗菌药物，可在以下情况进行试验：某些单位潜在有局部或广泛流行的对数种基本药物（特别是同类的，如β-内酰胺类或氨基糖苷类）耐药的菌株；治疗对基本药物过敏的患者；治疗少见菌的感染（如氯霉素对肠道外分离的沙门菌属或耐万古霉素的肠球菌）；以流行病学调查为目的向感染控制部门报告。

U组包含某些仅用于治疗泌尿道感染的抗菌药物（如呋喃妥因和某些喹诺酮类药物），这些药物对除泌尿道以外的感染部位分离的病原菌不应常规报告，其他具有较广治疗指征的药物也可包括于U组，其主要针对一些特定的泌尿道致病菌（如铜绿假单胞菌）。

表中的小框中是一些类似的药物，同一框内的药物的结果解释和临床效力都很相似，因此不必重复试验，而“或”字表示一组相关的药物，其抗菌谱和结果解释几乎完全相同，所以通常在每个小框中只选择一种抗菌药物进行试验。

五、仪器普通孵箱，纸片接种器（英国Oxoid公司或美国BD公司的BBL 产品），镊子，5%CO2孵箱，细菌比浊仪（美国BBL产品）或0.5麦氏标准比浊管。

六、试剂1.Mueller-Hinton琼脂（MHA），嗜血杆菌敏感试验用琼脂（HTM），含5%羊血的MHA。

2.各种临床常用的含有特定量抗菌药物的干燥纸片，纸片中抗菌药物含量参照CLSI的规定。

七、操作步骤从孵育了18～24小时的非选择性培养基（如血琼脂）平板上，挑取单个菌落，直接用肉汤或盐水制成菌悬液作为接种物，将浊度调整至0.5麦氏标准。

此法称之为直接菌落悬液法，是检测苛养菌，如嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌和链球菌等推荐的方法，也适用于检测葡萄球菌对甲氧西林或苯唑西林潜在的耐药性和非苛养菌。

非苛养菌还可采用生长法（详见CLSI文件）进行接种物的制备。

MHA平板最好在接种物悬液浊度调整后15分钟内接种。

流感嗜血杆菌采用嗜血杆菌试验用培养基（HTM含15μg/ml血红素、15μg/mlβ-NAD、5μg/ml酵母粉的MHA），淋病奈瑟菌采用奈瑟菌专用培养基（GCA）；肺炎链球菌及其他链球菌使用加5%羊血的MHA。

用无菌棉拭蘸取菌液，在管内壁液面上方旋转挤压，将多余的菌液挤去，然后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60°以确保接种菌的均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。

接种好的平板可敞开盖子在室温下干燥3～5分钟（不要超过15分钟），然后用纸片接种器或无菌镊子将纸片放入琼脂表面并轻压，使纸片与表面完全接触。

各纸片中心相距应大于24mm，由于某些药物在纸片放入琼脂平板后几乎立即扩散，所以一旦纸片放入后就不能再移动，若要重新放置，可用一个新的纸片放在平板的另一位置。

在纸片贴好后15分钟内将平板倒置放入35℃孵箱。

非苛养菌的药敏解释标准是建立在这些菌株置空气中孵育的基础上，一些药物（如氨基糖苷类、大环内酯类和四环素）的抑菌圈直径受CO2的影响会有较大的改变，所以非苛养菌不能孵育在CO2浓度高的环境中。

但苛养菌（如嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌）则应孵育在CO2环境中。

葡萄球菌和肠球菌必须孵育24小时以检测对头孢西丁和万古霉素的耐药性，其他的非苛养菌可在孵育16～18小时后读取结果。

流感嗜血杆菌、肺炎链球菌及其他链球菌、淋病奈瑟菌应在5%CO2 中孵育，流感嗜血杆菌需16～18小时，肺炎链球菌及其他链球菌需20～24小时，淋病奈瑟菌需20～24小时。

八、结果判读如果接种准确，抑菌圈呈均匀的环状，细菌生长的平面是连续的，若可见明显的单个菌落生长则说明接种菌的浓度太小，应重新进行试验。

抑菌圈的直径（包含纸片的直径）可用直尺或游标卡尺测量，读取最近的毫米整数。

测量时将尺子放在倒置的平板上，置平板在黑色无反射背景上方几寸处并用反射光照明。

对于加入血的琼脂平板（如链球菌），则将平板的盖子移去，在琼脂表面的上方测量并以反射光照明。

检测头孢西丁和万古霉素对葡萄球菌或肠球菌的抑菌圈需要用透射光（将平板对着光线）。

抑菌圈的边缘应不见细菌的明显生长，若只有用放大镜才可发现的微弱生长的细小菌落则可以忽略。

当检测葡萄球菌或肠球菌时，在头孢西丁纸片（葡萄球菌）或万古霉素纸片（肠球菌）周围的抑菌圈内有任何可辨的菌株生长（包括针尖样菌落）则提示耐药。

对其他细菌，若在清楚的抑菌圈内有独立的菌落生长，则提示可能接种的菌种不纯，需要重新分离、鉴定和药敏试验，但此菌落也可能为抗菌药物选择出的高频突变耐药株。

变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物的抑菌圈内，所以在明显的抑菌圈内有薄膜样爬行生长可以忽略。

对于链球菌应检测生长抑制圈而不是溶血抑制圈。

对甲氧苄啶和磺胺，拮抗物可使细菌轻微生长，所以抑菌圈直径的检测应不考虑细微生长的部分（生长菌苔的20%或以下）而测量比较明显的边缘。

抑菌圈直径结果的判度也可采用自动化药敏测量仪，此仪器已经过评估，发现与手工法测量结果一致性很高。

九、报告抑菌圈直径的解释标准参照CLSI标准，可报告细菌对测试的抗菌药物敏感、中介或耐药，某些抗菌药物只能报告敏感，因为目前还未发现对这些药物耐药的菌株。

CLSI中所推荐的药物目前认为是适合于常规药敏试验和报告的药物，这些针对每一菌群所推荐的药物都具有确切的临床疗效，其体外试验的结果也可以接受，为了提高试验报告与临床的相关性，减少滥用广谱抗菌药物造成的多重耐药菌株的流行，每个实验室都应决定表中的哪些药物用于常规报告（A组）和哪些药物仅选择性报告（B 组），不过当临床需要时，也应该提供B组常规不报告的药敏结果。

一般情况下，报告的药物必须是试验过的，但若另外一种药物的试验可提供对该药更为准确的结果则可以例外，而且通常所试药物应与医院处方手册中的药物相匹配，或者在报告时附加脚注，指明哪些未试药物与所试药物有相似的解释结果，而对不常见的药敏结果则应考虑报告（如肠杆菌科细菌对三代头孢菌素或亚胺培南耐药）。

某些菌种或菌群在进行药敏试验时对抗菌药物的选择和报告有特殊要求，如：对产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）肠杆菌科菌株药敏试验结果应报告对所有青霉素类、头孢菌素及氨曲南耐药；对于沙门菌属和志贺菌属的分离株只有氨苄西林、一种喹诺酮类药物和磺胺甲唑/甲氧苄啶可用于常规试验和报告，一、二代头孢菌素和氨基糖苷类体外可能对这些菌株有活性，但临床却无效，所以对上述药物不应报告为敏感。

此外沙门菌属的肠道外分离株应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素的敏感性；对于肠球菌属，头孢菌素类、氨基糖苷类（仅筛选高水平耐药性）、磺胺甲唑/甲氧苄啶和克林霉素在体外可能有活性，但在临床上耐药，所以不能报告对这些药物敏感；对于甲氧西林耐药的葡萄球菌（MRS）应报告对所有β-内酰胺类（除外头孢吡普、头孢罗林等新型头孢菌素）、氨基糖苷类、大环内酯类、克林霉素和四环素耐药；从患有威胁生命的感染（脑膜炎、菌血症、会厌炎和面部蜂窝织炎）的患者血和脑脊液中分离的流感嗜血杆菌，常规只报告氨苄西林、一种三代头孢菌素和氯霉素的药敏结果。

苯唑西林的抑菌圈直径≥20mm的肺炎链球菌对青霉素是敏感的（MIC≤0.06μg/ml）。

当苯唑西林纸片筛选试验的直径≤19mm时，可能是对青霉素耐药、中介或某些敏感的菌株，因此对于苯唑西林抑菌圈直径≤19mm的肺炎链球菌菌株应检测其MIC。

仅靠苯唑西林抑菌圈直径≤19mm不能报告该菌株对青霉素耐药或者中介。

检测肺炎链球菌之外的其他链球菌对青霉素的敏感性时，并不推荐使用苯唑西林纸片试验。

从通常无菌的部位（如脑脊液、血液、骨等）分离到的草绿色链球菌，应检测其青霉素的MIC，因为青霉素（和苯唑西林）纸片扩散法敏感试验对草绿色链球菌是不可靠的。

十、质控1.目的监测抗菌药物敏感试验的精密度和准确度；监测试剂的质量；监测操作者的药敏试验水平。

2.质控菌株粪肠球菌ATCC29212（用于监测MHA中嘧啶的含量是否在可接受范围，同时也可用做高浓度氨基糖苷类抗生素纸片的质控菌）；大肠埃希菌ATCC25922；大肠埃希菌ATCC35218（仅用于酶抑制剂复合药物，如含棒酸、舒巴坦或三唑巴坦药物的质控）；肺炎克雷伯菌ATCC700603（ESBLs试验质控）；铜绿假单胞菌ATCC27853；金黄色葡萄球菌ATCC25923。

3.质控菌株的保存若长期保存，可将菌株置于合适的稳定剂中（如含50%胎牛血清的肉汤，含10%～15%甘油的胰酶消化大豆肉汤、脱纤维羊血或脱脂乳），再储存于-20℃或更低（液氮），或处于冻干状态，这样就不会显著改变其抗菌药物的敏感性。