萝卜带柄子叶高频再生体系的建立

植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2011, 46 (3): 331–337,

doi: 10.3724/SP .J.1259.2011.00331 ——————————————————

收稿日期: 2010-12-07; 接受日期: 2011-02-14 基金项目: 国家科技支撑计划(No.2009BADB8B03-1) * 通讯作者。E-mail: lugangzh@

萝卜带柄子叶高频再生体系的建立

李海萍, 张鲁刚*, 张静, 茹磊, 刘学成, 孙希禄

西北农林科技大学园艺学院, 杨陵 712100

摘要 以11份萝卜(Raphanus sativus )基因型为材料进行子叶离体培养研究, 筛选出具有较高再生率的基因型进行实验, 考察基因型、外植体类型、激素配比和苗龄等因素对萝卜再生的影响。结果表明: 萝卜离体再生的最佳外植体为全子叶-叶

柄, 最适苗龄为4天, 最适培养基为MS+6 mg·L –16-BA+0.05 mg·L –1

NAA, 再生率高达86.95%, 再生系数为1.80。该研究为

进行萝卜遗传转化实验奠定了良好基础。 关键词 离体再生, 萝卜, 6-BA, TDZ

李海萍, 张鲁刚, 张静, 茹磊, 刘学成, 孙希禄 (2011). 萝卜带柄子叶高频再生体系的建立. 植物学报 46, 331–337.

萝卜(Raphanus sativus )又名莱菔、芦菔, 隶属十字花科萝卜属, 是能形成肥大肉质根的二年生草本植物。作为一种蔬菜作物, 萝卜目前在我国南北各地普遍栽培。我国有着丰富的萝卜种质资源, 随着生活质量的提高, 人们对萝卜品质的要求也日益提高。为了适应生产发展和社会需求, 迫切需要选育优质、抗病、丰产的优良新品种。基因工程技术目前已在植物育种中得到普遍应用, 建立一个高效的离体再生体系对于利用基因工程技术进行遗传育种及育种亲本的无性快繁是十分必要的。萝卜为再生顽拗型植物, 再生频率普遍较低(徐文玲等, 2006), 因此建立萝卜的高效再生体系已成为限制其基因转化的一个关键因素。本实验以11个基因型的萝卜品种为试材, 对影响其再生的若干因素进行研究, 旨在建立对萝卜具有较广适应性的再生体系, 为利用生物技术进行育种工作奠定基础。

1 植物材料

本实验所用11份萝卜(Raphanus sativus L.)材料由西北农林科技大学园艺学院大白菜研究室提供。此11份萝卜材料包括5份正常生长发育的材料(正常材料)和6份败蕾材料。正常材料编号为Z1(日喀则1号大萝卜)、Z2(青皮-6)、Z3(07Lb36-9)、Z4(07Lb39)和Z5 (07Lb53-4); 败蕾材料编号为B1(09L8)、B2(09L12)、

B3(A5-4-23)、B4(13-1)、B5(5-1)和B6(A1-3)。

2 培养基成分和培养条件

2.1 无菌苗的获得

挑选颗粒饱满的萝卜种子, 在超净工作台上用70%乙醇处理1分钟, 再用6%次氯酸钠溶液处理15分钟, 无菌水冲洗4–5遍, 然后接种于1/2MS 培养基(含20 g·L –1蔗糖+7.5 g·L –1琼脂, pH 5.8)上。每个三角瓶中接种10–15粒种子(图1A)。置于室温25°C 、光照时间为16 h·d –1、光照强度为2 000 lux 条件下培养, 获得无菌苗。

2.2 不定芽诱导

分别切取4–5天的无菌苗外植体(先横切再纵切分开2片子叶后去除生长点), 接种于改良MS+5 mg·L –1 6-BA+0.2 mg·L –1NAA+0.75%琼脂+30 g·L –1蔗糖培养基上(徐文玲等, 2006)(图1B)。在室温25°C 、光照时间为16 h·d –1、光照强度为2 000 lux 条件下培养15–20天后统计不定芽再生率及玻璃化情况, 筛选出再生率较高的基因型。分别切取这些品种的外植体或选取不同接种方式, 接种至相同成分的分化培养基上, 筛选出萝卜再生的最佳外植体。然后筛选合适的激素(6-BA 、TDZ 及NAA)组合和浓度配比。最后筛选

·技术方法·

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图1 萝卜材料Z3离体再生培养各阶段的生长状况

(A) 接种2天后发芽的萝卜种子; (B) 4天苗龄的外植体; (C) 6-BA 与NAA 组合诱导产生的不定芽; (D) TDZ 与NAA 组合诱导产生的不定芽; (E) 通过绿色愈伤诱导产生的丛生芽; (F) 1/2MS+NAA 诱导产生的不定根

Figure 1 The growth status of each stage in the regeneration culture process of the radish species Z3

(A) The radish seeds germinated two days after inoculation; (B) The explants with the seedling age of 4 days; (C) The adventi-tious buds induced with 6-BA and NAA combination; (D) The adventitious buds induced with TDZ and NAA combination; (E) The multiple shoots induced from the green calli; (F) The adventitious roots induced on 1/2MS medium+NAA

得出诱导萝卜不定芽再生的最适苗龄。

不定芽再生率=(形成再生芽的外植体数/接种的外植体总数) ×100%

不定芽再生系数=再生不定芽数/再生外植体数

2.3 不定芽生根及植株移栽

将2–3 cm 长的丛生不定芽切割成含有1–2个不定芽的小块, 分别接入附加有不同浓度NAA 和IBA 的改良1/2MS 基本培养基上进行生根实验。对NAA 和IBA 的生根效果进行对比或者二者配合使用, 筛选出最佳的生根激素组合及最适浓度。

再生苗移栽至大田之前, 首先将三角瓶上的封口膜去掉, 降低湿度并增加光照, 使苗的生长环境接近于田间, 进行炼苗培养。2–3天后将苗移栽于营养钵

中, 置于炼苗室缓苗培养15天左右, 再移栽到大田, 30天后统计成活率。

3 结果与讨论

3.1 基因型对萝卜再生的影响

切取4天苗龄的带柄子叶接种在改良MS+5 mg·L –1 6-BA+0.2 mg·L –1NAA+0.75%琼脂+30 g·L –1蔗糖培养基上, 2周后不定芽开始由子叶柄的基部长出。不同基因型其不定芽分化率存在较大差异。由表1可以看出, 供试的11个基因型萝卜品种中, 以萝卜败蕾材料B2的不定芽再生率最高, 为64.33%; 再生率最低的是萝卜败蕾材料B5, 只有1.73%。萝卜正常材料中Z3的不定芽再生率较高, 为35.36%。通过基因型筛选实