16s rDNA 经典材料

Normally, we used following primers to amplify bacterial 16S rRNA genes (27F and 1492R pair) and sequencing them (using other primers). The primer sequencs are all listed in the reference:

- Lane DJ (1991) 16S/23S rRNA sequencing. In: Stackebrandt E, Goodfellow M (eds) Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Wiley, Chichester, pp 115-175

27F 5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3' PCR and sequencing, most eubacteria

357F 5' CTC CTA CGG GAG GCA GCA G 3' Most eubacteria

530F 5' GTG CCA GCM GCC GCG G 3' Most eubacteria and archaebacteria

926F 5' AAA CTY AAA KGA A TT GAC GG 3' Most eubacteria and archaebacteria

1114F 5' GCA ACG AGC GCA ACC C 3' Most eubacteria

342R 5' CTG CTG CSY CCC GTA G 3' Most eubacteria

519R 5' GWA TTA CCG CGG CKG CTG 3' Most eubacteria and archaebacteria

907R 5' CCG TCA A TT CMT TTR AGT TT 3' Most eubacteria and archaebacteria

1100R 5' GGG TTG CGC TCG TTG 3' Most eubacteria

1492R 5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3' PCR and sequencing, most eubacteria

1525R 5' AAG GAG GTG WTC CAR CC 3' PCR and sequencing, most eubacteria

M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1

Any primer's reverse complement sequence is its revers prime. For example:

519R 5' GWA TTA CCG CGG CKG CTG 3' then

519F 3' CWT AAT GGC GCC GKC GAC 5'

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以16S rRNA基因为靶基因设计或比较通用引物，用blast效果不太好。因为该基因含有很多高度保守区（9-10），且在很多细菌中都是多拷贝的，文献或设计的primers往往都能扩增出几乎所有的真细菌，因此，blast时会得到很多同源序列，尽管如此，还是有更多的序列或细菌被省略了。

我设计或验证该UP时，是有目的地根据实验需要，从genebank中确定一些常见细菌的属，每个属选几个菌种，每个菌种选2-3个菌株，但一定要包括标准株（可参考文献），然后用MEGLINE进行序列，并与UP进行比较。设计完成后在拿UP与随意查的其他细菌进行比较验证。尽管需要分析的序列可能达近百个，可现在的计算机内存和速度，及宽带都很大，应该是很快的。

细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成。其分子内存在的可变区，显示出细菌不同分类等级水平上的特异性。

16S rRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析

首先，16S rRNA 普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是18S rRNA ）中。rRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物

亲缘关系的研究。第三，16S rRNA 的相对分子量大小适中，约 1 540 个核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。分离菌株16S rRNA 基因的分离较为简单。从平板中直接挑取一环分离菌株细胞, 加入100μL 无菌重蒸H 2 O 中, 旋涡混匀后, 沸水浴2min, 12 000r min -1 离心5min, 上清液中即含16S rRNA 基因，可直接用于PCR 扩增。分离菌株16S rRNA 基因的PCR 扩增和序列测定的一般步骤为：16S rRNA 基因的PCR 引物：5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3' ；5'-AAGGAGGTGA TCCAG CCGCA-3' 。扩增反应体积50 m L ，反应条件为95 ℃预变性5min ，94 ℃变性1min ，55 ℃退火

1min ，72 ℃延伸2min ，共进行29 个循环，PCR 反应在PTC-200 型热循环仪上进行。取5 m L 反应液在10g L -1 的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。PCR 产物测序可由专门技术公司完成。测序得到分离菌株16S rDNA 部分序列，此序列一般以*.f.seq 形式保存，可以用写字板或Editsequence 软件打开，将所得序列通过Blast 程序与GenBank 中核酸数据进行比对分析( /blast ) ，具体步骤如下：点击网站中Nucleotide BLAST 下Nucleotide-nucleotide BLAST [blastn] 选项，将测序所得序列粘贴在“ search ”网页空白处，或输入测序结果所在文件夹目录，点击核酸比对选项，即“ blast ”，然后点击“ format ”，计算机自动开始搜索核苷酸数据库中序列并进行序列比较，根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，从而初步判断16S rDNA 鉴定结果。遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用DNAStar 软件包中的MegAlign 程序计算样本间的遗传距离。由GenBank 中得到相关菌株的序列，与本研究分离菌株所测得序列一起输入Clustalx1.8 程序进行DNA 同源序列排列，并经人工仔细核查。在此基础上，序列输入Phylip3.6 软件包，以简约法构建系统发育树。使用Kimura 2-parameter 法，系统树各分枝的置信度经重抽样法（Bootstrap ）500 次重复检测，DNA 序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。

16S rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rDNA 都具有多个拷贝，5S、16S、23S rDNA的拷贝数相同。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。细菌的16S rDNA的结构如下：

5¡¯ V1V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 3’

540bp 970bp 1540bp

图6-1 16S rDNA的结构

可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将