食品化学与分析第六章营养成分测定之蛋白质与氨基酸的测定
蛋白质与氨基酸测定
人体可以自行合成，不必从食物中摄取的氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸等。
氨基酸的功能
合成蛋白质
合成其他生物活性物质
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，通 过脱水缩合形成肽链，进而形成蛋白 质。
氨基酸可以作为合成其他生物活性物 质的原料，如嘌呤、嘧啶等。
代谢调节
氨基酸参与多种代谢反应，如糖代谢、 脂肪代谢和氮代谢等，对维持人体正 常生理功能具有重要作用。
生物能源研究
蛋白质和氨基酸在生物能源领域也有应用，如通过测定蛋 白质的分解产物来评估生物燃料的生产效率和可持续性。
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蛋白质含量。
分光光度法
利用特定波长下的吸光度来测 定蛋白质含量，如双缩脲法、 酚试剂法等。
色谱法
利用色谱技术分离蛋白质，通 过测定各组分的含量来计算蛋 白质含量。
质谱法
通过测定蛋白质的质荷比来鉴 定蛋白质，常用于蛋白质组学
研究。
02
氨基酸测定
氨基酸的种类
必需氨基酸
人体无法自行合成，必须从食物中摄取的氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬 氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和组氨酸。
蛋白质在生物体内可以水解成氨基酸， 氨基酸通过合成反应形成蛋白质。
蛋白质与氨基酸在生物体内的代谢过程
蛋白质的合成与分解
在生物体内，蛋白质的合成和分解是 一个动态平衡的过程。合成主要发生 在细胞内的核糖体上，而分解则通过 蛋白酶的催化作用进行。
氨基酸的代谢
氨基酸在生物体内经过一系列的代谢 反应，可以转化为其他有机物质，如 葡萄糖、脂肪等。同时，氨基酸也可 以作为合成核苷酸、激素等物质的原 料。
全国高等教育自学考试课程--食品化学与分析(05753)-第六章1
食品中的蛋白质经盐酸水解成为游离氨基 酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与 茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计 比色测定氨基酸含量。 此法不适合于蛋白质含量低的水果、蔬菜、 饮料和淀粉类食品中氨基酸的测定
$6-3 食品中脂肪及脂肪酸的测定
食品中脂肪的测定
索氏提取法
酸水解法 脂肪的测 定方法 碱性乙醚法 甲醇-氯仿抽提法 皂化法
适用范围：费休法广泛地应用于各种液体、固体
及一些气体样品中水分含量的测定，是水分特别是 痕量水分标准分析方法。
$6-2 食品中蛋白质及氨基酸的测定
食物中蛋白质的测定
在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同
一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品 牛肉：20.0% 猪肉：9.5% 乳： 3.5% 桃： 0.8% 大豆：40% 面粉：9.9% 菠菜：2.4% 鸡肉：20% 稻米：8.5% 黄瓜：1.0%
微波加热法
直接干燥法
原理：基于食品中水分受热后蒸发的原理，将取样后
的称量皿置于电热干燥箱内，在95~105℃下干燥到恒 重，干燥后样品所失去的质量即为水分含量。
适用范围：95~105℃下，不含或含其他挥发成分
极微且对热稳定的各种食品。如谷物及其制品、水
产品、豆制品、乳制品、肉制品、卤菜制品
减压干燥法
蛋白质测定方法
利用蛋白质的共性，即含氮量 、肽键和折射率测
定蛋白质含量；
定氮法、双缩脲法、物理法
利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团 以及芳香基团等测定蛋白质含量。
染料结合法、福林—酚试剂法
凯氏定氮法
凯氏定氮法：将蛋白质或氨基酸消化，测定其
总氮含量，再换算为蛋白质或氨基酸含量。
食品中一般成分分析—蛋白质和氨基酸的测定
反应原理
电位滴定法是靠电极电位的突跃来指示滴定终点。 在滴定到达终点前后，滴液中的待测离子浓度往往变 化很大，引起电位的突跃，被测成分的含量仍然通过 消耗滴定剂的量来计算。
反应原理
因此，电位滴定准确度和精密度高，可用于滴定 突跃小或不明显的滴定反应，也可用于有色或浑浊试 样的滴定，电位滴定装置简单、操作方便，可自动化。 使用不同的指示电极，电位滴定法可以进行酸碱滴定， 氧化还原滴定，配合滴定和沉淀滴定。
食品中通常含有多种氨基酸，因此需要测定氨基酸的总 量，不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的 氮即氨基酸态氮的百分率来表示。
氨基酸含量一直是某些发酵产品如调味品的重要质量指 标，也是目前许多保健食品的质量指标之一。
与蛋白质中氨基酸结合状态不同，呈游离状态的氨基酸 的含氮量可直接测定，因此称为氨基酸态氮。
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营养学分类
（2）半必需氨基酸或条件必需氨基酸 人体虽能够合成精氨酸和组氨酸，但通常不能满足 正常的需要，因此，又被称为半必需氨基酸或条件必需 氨基酸，在幼儿生长期这两种是必需氨基酸。 （3）非必需氨基酸 指能由简单的前体合成，不需要从食物中获得的氨 基酸。例如甘氨酸、丙氨酸等氨基酸。
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化学结构分类
仪器及试剂
仪器及试剂
1.仪器 分光光度计、容量瓶、具塞刻度试管、移液管、恒温水浴锅等； 2.试剂 （1）20g/L茚三酮溶液 称取茚三酮1g置于盛有35mL热水的烧杯中使 其溶解，加入40mg氯化亚锡，搅拌过滤作为防腐剂。滤液放置于棕色 瓶中冷暗处过夜，加水至58.04 磷酸盐缓冲溶液 准确称取磷酸二氢钾4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移入500mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用； 准确称取磷酸氢二钠11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移入 500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用； 取上述配制好的磷酸二氢钾溶液10mL与190mL磷酸氢二钠溶液混匀即为 pH8.04磷酸盐缓冲溶液。
蛋白质与氨基酸的测定
① H2SO4和K2SO4的添加量
有机无分解需要H2SO4量，H2SO4应根据有 机物种类不同而加的量就不同，如果试样含 脂类高，则加H2SO4多，为了提高分解温度， 要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少， 太少则氨化不充分。 K2SO4和H2SO4的添加比例是：
第四节 蛋白质的测定方法
一、 凯氏定氮法 1、 凯氏常量定氮法： （1）消化：
为了加速反应过程，还加入硫酸铜， 氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过 氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂。但为了防 止污染通常使用硫酸铜。 所以有机物全部消化后，出现硫酸铜 的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为 碱性反应指示剂。
第四节 蛋白质的测定方法
一、 凯氏定氮法 1、 凯氏常量定氮法： （1）消化：
在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快 有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可 提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330℃，而 添加硫酸钾后，温度可达400℃，加速了整个反 应过程。此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐 类来提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不 断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增 大，沸点增加。加速了有机的分解。但硫酸钾 加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸 氢铵也会分解，放出氨而造成损失。
元素 C H 7 O 23 N 16 S 0 —3 P 0 —3 百分比% 50
第一节
概 述
一、pro组成与分类
一般来说，pro的平均含氮量为 100/160，所以在用凯氏定氮法定量pro 时，将测得的总氮%乘上pro的换称参数 K=6.25即为该物质的pro含量。
注意：当测定的样品其含氮的系数与上 面100/16相差较大时，采用6.25将会引起显 著的偏差。
蛋白质及氨基酸的测定
• 二、蒸馏
• 1、安装蒸馏装置：按图安装蒸馏装置，装置不能漏气，塞紧 瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内有50mL 40g/L硼酸 溶液及指示剂2~3滴） • 2、蒸馏：放松夹子，通过漏斗加入70mL400g/LNaOH溶液， 并摇动凯氏烧瓶，至瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀， 再从漏斗中加入100mL蒸馏水，加紧夹子，加热蒸馏，约 30min
A.样品消化
浓硫酸对含氮有机物的消化作用主要是氧化还 原作用，使有机物碳化的同时在高温下又有强氧化 性，能将有机物氧化分解成水和二氧化碳，使氮还 原为氨，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在溶液中。
B.蒸馏
在消化完全的样品中加入浓氢氧化钠溶液，加热 蒸馏，生成气态氨。
C.吸收
用硼酸吸收蒸馏所放出的氨气。
D.滴定
•
本法操作简单迅速，适用于测定小麦面粉，糕点， 豆类，蛋黄，及肉制品中蛋白质的含量。 温度对蛋白质水解有影响，操作温度应该控制在 20-30摄氏度之间。 本法由于许多非蛋白质成分在紫外光区有吸收作用， 加之光散射作用的干扰，故在食品分析领域中的应 用并不广泛。
实验原理
蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或 色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的 磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨 蓝化合物），蓝色的深浅与蛋白质的含量 成正比，可用比色法测定。
当脲被小心加热至150-160℃时，可由两个分子间 脱去一个氨分子而生成双缩脲反应方程式如下：
双缩脲在碱性条件下与少量硫酸铜溶液作用生成 紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应
1.标准曲线的绘制
以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质 样按蛋白质含量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、 110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支50mL纳氏比色管 中，然后各加上1mL四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液准确稀释至 50mL，振摇10min，静置1h，取上层清液离心5min，取离心后的 透明液于比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液调节仪器 零点并测定各溶液的吸光度值A。以蛋白质的含量为横坐标，吸 光度值A为纵坐标绘制标准曲线 2.样品的测定 准确称取适量样品（即使得蛋白质含量在40-110mg之间） 于50mL纳氏比色管中，加1ml四氯化碳，按上述步骤显色后，在 相同条件下测其吸光度值A。用测得的A值在标准曲线上即可查 得蛋白质毫克数，进而由此求得样品中的蛋白质含量。
蛋白质和氨基酸的测定课件
第一页，共68页。
（一）蛋白质组成与分类
1 . 组成Composition
蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它的溶液是典型的胶 体分散体系，由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化 合物，它主要组成元素是C 、H、O、N、S、P。另外还有一 些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。对于不同的蛋白质，它的 组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的蛋白质的元 素组成百分比。
2H2SO4 +C＝CO2+2SO2+2H2O
二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫， 氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。
在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短 消化时间，常加入下列物质：
第十四页，共68页。
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点而加快有机物分 解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般 纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾（1689 ℃ ）之后可以提 高至400℃以上。原因主要在于随着消化过程中硫酸不断 的被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点 升高，其反应式如下：
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定
⑴ 消化 总反应式：
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 ＝ （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
一定要用浓硫酸（98%），浓硫酸具有脱水性，使有机 物脱水后被炭化为碳、氢、氮。
浓硫酸又有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化为二 氧化碳，硫酸被还原为二氧化硫：
1.含量 由于食品种类很多，所以蛋白质含量分布是不均匀 的，一般动物组织蛋白质含量高于植物组织，而且动物组 织以肌肉内脏含量较多于其他部分，植物是以种子含量高， 豆类含蛋白质最高。
蛋白质和氨基酸的测定
食品分析概述1蛋白质的定量测定2氨基酸的定量测定3挥发性盐基氮的测定4第十章蛋白质和氨基酸的测定第一节概述1、食品中的蛋白质和氨基酸◆蛋白质是生物界三大基础物质之一，是构成生物体细胞组织的重要成分；◆蛋白质——氨基酸通过酰胺键结合的高分子化合物；◆所含的主要化学元素为C、H、O、N。
区别其他有/%常见食物蛋白质的含量食物名称蛋白质含量/% 食物名称蛋白质含量/% 牛肉20.1 大豆36.3猪肉9.5 大米8.3带鱼18.1 面粉9.9鸡蛋14.7 黄瓜0.8全脂乳粉26.2 苹果0.4◆构成蛋白质的α-氨基酸共有20种。
◆必需氨基酸（EAA）——为了维持机体的正常生长和健康，但人体不能合成或合成量不能满足需要，必需从食物中摄取的氨基酸。
◆包括：赖氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸。
◆FAO/WHO推荐的氨基酸理想模式Lys:Val:Met:Try:Leu:Ile:Thr:Phe= 5.5 : 5.0 :3.5 : 1.0: 7.0 : 4.0: 4.0: 6.02、蛋白质换算系数❖各种不同的蛋白质含氮量不同。
❖一般蛋白质含氮量为16%，即M N/M Pr=16%M Pr= M N/16%=6.25M N蛋白质换算系数不同食物原料的蛋白质换算系数食物原料换算系数食物原料换算系数大米 5.95 大豆及其制品 5.71 大麦、小米 5.83 花生 5.46 小麦粉及其制品 5.70 牛乳及其制品 6.38芝麻、南瓜子 5.40 荞麦、青豆 6.25 高粱 6.24 椰子、核桃 5.30蛋 6.25 畜禽肉及其制品 6.25 根据被测食品种类选择不同的换算系数凯氏定氮法双缩脲法方法紫外吸收法福林-酚法第二节蛋白质的定量测定（一）凯氏定氮法●凯氏定氮法：总氮量×蛋白质换算系数●测定结果：粗蛋白（包含核酸、生物碱、含氮色素等非蛋白质氮）●适用范围：各类食品中蛋白质含量测定●长期改进：常量法、半微量法和微量法等1、常量凯氏定氮法（1）原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中C和H被氧化为CO2和H2O逸出，而样品中的N转化为NH3，与硫酸结合成硫酸铵。
《食品分析》-蛋白质和氨基酸的分析
第二节 凯氏定氮法
新鲜食物中含氮化合物大多以蛋白质为主， 因此在检测中往往以测定总氮量，然后乘以蛋 白质的换算系数来得到蛋白质含量。
W——蛋白质质量分数，g/100g; V1——试样消耗酸标准滴定液的体积，mL； V2——空白试样消耗酸标准滴定液的体积，mL； V3——吸取消化液体积，mL； C ——酸标准滴定液的浓度，mol/L； 0.01401——1mmol酸标准滴定液相当的氮质量，g； m ——试样质量，g； F ——氮换算为蛋白质的系数。
小玻棒及棒状玻塞 螺旋夹
反应室
烧瓶 电炉
反应室外层
橡皮管及 螺旋夹
冷凝管 接收瓶
装水至2/3处，加甲基红乙 醇溶液和硫酸保持水呈酸性
试样2-10mL 氢氧化钠 10mL
蒸馏10min后液面离开冷凝 管下端继续蒸馏1min
10mL硼酸和1-2滴混合指示剂
W (V1 V2 ) c 0.01401 F的功能 基团吸收不同频率的辐射。 对于蛋白质和多肽，多肽键 在 中 红 外 波 段 (6.47µm) 和 近 红 外 (NIR) 波 段 ( 如 3300 ～ 3500nm ， 2080 ～ 2220nm 。 1560～1670nm)的特征吸收可 用于测定食品中的蛋白质含 量。
注意事项
➢配制试剂均采用无氨蒸馏水 ➢消化时应缓慢沸腾，附着在瓶壁上的固体残渣可用冷凝酸
液洗下促其消化 ➢应小火加热并不断摇动含脂肪或糖较多的样品 ➢若干试样超过5g，可按5mL/g比例增加硫酸用量 ➢样品消化液不易澄清透明时，可加入30g/100mL过氧化氢
第六章 蛋白质测定
第六章蛋白质与氨基酸的测定本章由六节内容组成，重点掌握第三节和第五节蛋白质和氨基酸的定量分析。
其中蛋白质重点掌握凯氏定氮法，氨基酸重点掌握甲醛滴定法。
第一节概述1. 蛋白质概况蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。
主要由C、H、O、N元素组成。
某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I 等。
蛋白质是生命物质基础，人体11%~13%总热量来自蛋白质。
无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。
蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。
氨基酸是构成蛋白质最基本物质，有20种，尤其是必需氨基酸对人体代谢具重要意义，常为食品加工及研发的关注指标，因此氨基酸也常为食品及营养保健产品的分析检测对象。
食品安全问题的突现，也使得蛋白质测定尤为重要。
2. 蛋白质的测定方法：一类是利用蛋白质的共性，即从含氮量、肽键和折射率等途径来测定蛋白质含量。
主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘蛋白质换算系数。
这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但非蛋白氮多的要单测）。
另一类是利用蛋白质中的特定氨基酸残基、酸性和碱性基团及芳香基团等测定蛋白质含量。
第二节蛋白质的定性测定（了解）一、蛋白质的一般显色反应（P116）电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。
书中列举了 5 种染料。
以考马斯亮蓝为例讲解蛋白质显色反应。
二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（3种方法）（二）脂蛋白的显色（2种方法）第三节蛋白质的定量测定一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。
例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉9.5%，兔肉21%，鸡肉20%，牛乳 3.5%，带鱼18.0%，大豆40%，面粉9.9%，菠菜2.4%，黄瓜1.0%，苹果1.4%。
一般蛋白质含氮量为15%~ 17.6%，一份氮相当于6.25份蛋白质，这个6.25称为蛋白质的换算系数。
N/16%= N×6.25 = 蛋白质含量蛋白质中元素组成百分比：元素 C H O N S P百分比50 7 23 16 0-3 0-3一般来说，pro的平均含氮量为100/160，所以在用凯氏定氮法定量pro时，将测得的总氮%乘上pro的换称参数K=6.25即为该物质的pro含量。