酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究
酪氨酸酶
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酪氨酸酶(EC 1.14.18.1,Tyrosinase)是一种含铜的金属酶,广泛分布于微生物、动植物及人体中[1]. 在植物中,酪氨酸酶一般称为多酚氧化酶;在昆虫中,则称为酚氧化酶;在微生物和人体中,才称为酪氨酸酶.酪氨酸酶主要参与两个反应过程:催化L-酪氨酸羟基化转变为L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌,多巴醌经一系列反应后,形成黑色素.酪氨酸酶在生物体中具有重要的生理功能.同时,它也与人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉积等疾病的发生有关,并与昆虫的蜕皮和果蔬的褐化有很大关系[2].自从发现了人黑色素细胞可以以L-3,4-二羟基丙氨酸(L-多巴)为底物合成黑色素,这个反应成为酪氨酸酶活性和定位检测的基础.在之后的研究中,酪氨酸酶成为第一个用亲和色谱纯化的酶,酪氨酸酶也是最早发现能将酶分子内部氧原子参入到有机物中的酶;并为酶自杀性失活提供了早期实例.现今,人们已经从微生物、植物及多种动物中提取并纯化了酪氨酸酶.目前,对酪氨酸酶的研究主要集中在酶的分离纯化、催化机制、活性调控以及酪氨酸酶基因及其在生物体内的生理作用等方面,在结构方面,其三维结构仍未得到.鉴于此,对编码酪氨酸酶基因的结构、表达及其调控,酪氨酸酶的合成和运输的研究也在不断发展.酪氨酸酶的理化性质高等脊椎动物、低等脊椎动物和原核生物的酪氨酸酶的理化性质不同.由表1可以看到,从Strepto- myces antibioticus的272个氨基酸到Homo sapiens的529个氨基酸,不同生物中的酪氨酸酶氨基酸数目差异很大.虽然它们在生物体内具有相似的生理功能,但它们的理化性质却有不同程度的差异性.酪氨酸酶在同工酶的研究也占有非常重要的地位,是生物体内具有同工酶的一大类酶.据研究,哺乳动物、原核动物、真菌的酪氨酸酶一般为单聚体或二聚体;而昆虫、两栖类的酪氨酸酶一般为二聚体、四聚体或五聚体等多聚体.3 酪氨酸酶的活性中心结构酪氨酸酶的活性中心是由两个含铜离子位点构成.在催化过程中,双核铜离子位点以3种形态存在,分别是氧化态(Eoxy)、还原态(Emet)和脱氧态(Edeoxy). 研究表明与酪氨酸酶结合的双核铜离子活性中心与在血蓝蛋白中发现的活性中心非常相似[16,17].由X射线吸收光谱(XANES, X-Ray Absorption Near Edge Structure)分析,酪氨酸酶和血蓝蛋白含铜活性中心主要的构象变化基本相同,铜离子位点的几何构型是可变的.血蓝蛋白氧化态结晶学和延伸X射线吸收结构光谱(EXAFS, Edge X-ray Absorption Fine Struc-ture)的研究结果表明[18],Cu-Cu键长约为0.35 nm,每个二价铜离子构型为正四棱锥状,受到两个强的赤道面配位原子的调控和一个相对较弱的轴向NHis配基的调控,形成5个配位键(结构可见图1).其电子构象为3d9.即与蛋白上的组氨酸残基上的氮原子形成3个配位键,外源氧分子作为过氧化物与铜离子形成两个配位键占据了铜离子的两个赤道面位置,并可作为两个铜离子之间的桥联配体.所以Eoxy活性中心可以写成Cu(I) -O2-Cu(I),但通常更适合用过氧化态Cu(II) -O2-Cu(II)表示[16].过氧化物的电子结构对于Eoxy的生物功能很重要.由于受强的R*受体作用,过氧化物带有较少的负电荷,而P电子受体与过氧化物的R*轨道上的电子作用,大大的削弱了氧氧键,使图1 酪氨酸酶活性中心的双核铜中心结构Fig.1 The structure of the active center containing Cu of ty- rosinase之容易断裂.酪氨酸酶被认为是血蓝蛋白的祖先蛋白,因为酪氨酸酶在非常原始的生物体中也有发现.Eoxy的结构比血蓝蛋白的结构更紊乱,因此酪氨酸酶相对于血蓝蛋白存在更多构象不同的底物与其活性中心结合.还原态酪氨酸酶与氧-铜离子态的酶相似,都含有两个四角形的反磁铜离子,不同的是,桥联配体是氢氧化物而不是过氧化物.每个亚铜离子电子构象为3d10,分别与两个吲哚上的氮原子形成两个键长为0.19 nm的配位键,与第三个吲哚上的氮原子形成键长为0.27nm的配位键,环绕Cu-Cu轴形成近似C3V的对称结构.当加入过氧化物,酶从Emet变为Eoxy;当缺少过氧化物时,酶由Eoxy变为Emet.纯化后得到的酶是由\85%的Emet和[15%的Eoxy组成的混合物.半亚铜离子态酪氨酸酶含有一个2价铜离子和一个1价铜离子.2价铜离子含有未配对的电子,由电子顺磁共振分析,未配对的电子占据一个dx2 -y2轨道.根#732#厦门大学学报(自然科学版) 2006年据两个铜离子之间电子离域的电子顺磁共振和可见光谱特征,证明在两个铜离子之间同样有桥连配体的存在.通过对铜离子态血蓝蛋白的研究表明:Edeoxy的活性中心由两个一价铜离子组成.1938年Kubowitz证明了这种酶形态的存在.图2 酪氨酸酶催化生成黑色素过程Fig.2 The process of the melanin biosynthesis catalyzed by tyrosinase。
酪氨酸酶
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酪氨酸酶概念:酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一种含铜的氧化还原酶,它与生物体合成色素直接相关.(长的黑有很大的一部分原因在自己)在人体中,它与色素障碍性疾病及恶性黑色素肿瘤的发生与治疗有关(酪氨酸酶的分布与动物的生理功能息息相关,不同动物的酪氨酸酶在体内分布的部位不同.多数昆虫在正常生理状态下,酪氨酸酶以酶原的形式存在,不同类型的酪氨酸酶存在于昆虫的特定部位,以完成特定的生理功能.美洲蜚蠊存在于血红细胞内,而麻蝇则仅存在于血浆中,并且在表皮中主要以活化形式的酪氨酸酶存在.昆虫酪氨酸酶除参与黑色素的形成外还是唯一参与角质硬化的酶.昆虫高度硬化的角质能阻断微生物和异物的入侵,并为柔软的元脊椎动物身体提供了保护.在节肢动物中,酪氨酸酶还参与其他两种重要的生理过程——防御反应和伤口愈合.哺乳动物酪氨酸酶催化产生的黑色素被分泌进入到表皮和毛发的角质细胞中,使体表着色,从而起保护皮肤和眼睛、抵御紫外线的辐射和防止内部组织过热等作用.哺乳动物酪氨酸酶常见于黑素细胞中,黑素细胞是存在于皮肤,发囊和眼睛中并产生色素的高度特异性的细胞[1“].酪氨酸酶功能减退或缺失时,即会影响黑色素代谢,从而发生疾病如白癫疯和白化病.动物与人的常染色体隐性疾病也与酪氨酸酶的缺失或活性下降有关.)作用机制:酪氨酸酶主要参与两个反应过程:催化L.酪氨酸羟基化转变为L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌,多巴醌经一系列反应后,形成黑色素,与人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉积等疾病的发生有关,并与昆虫的蜕皮(蝉蜕可以入药)和(苹果)果蔬的褐化有很大关系(黑色素生物合成过程可大体分为两个阶段,第一阶段是由酪氨酸酶催化酪氨酸被羟化反应形成L_3,4一二羟基丙氨酸(L_多巴)(单酚酶活性),并进步将L_多巴氧化生成多巴醌(二酚酶活性)。
这两步反应都是由酪氨酸酶催化的,酪氨酸酶在这里显示了独特的双重催化功能.第二阶段从多巴醌(DOPAqui—non)为原料从两个不同途径分别生成真黑素和褪黑素的过程.真黑素生成,多巴醌经多聚化反应等一系列反应生成无色多巴色素,极不稳定的无色多巴色素被另一分子多巴醌氧化为多巴色素,多巴色素经异构、脱羧生成5,6一二羟基吲哚(DHI),5,6一二羟基吲哚(DHI)由酪氨酸酶催化氧化为真黑色素的前体吲哚一5,6一醌(IndQu);褪黑素生成,多巴醌(DOPAquinon)与半胱氨酸(Cys)反应生成产生5-Cys一多巴及5-Cys一多巴醌,然后成环、脱羧变成苯肼噻嗪的衍生物,最后形成褪黑素.在第二阶段,只有少数几步反应由酪氨酸酶、异构酶或金属离子催化,大部分反应都是自发的,因此酪氨酸酶是整个黑色素生成反应的限速酶,第一阶段的两步反应是限速步骤.)活性中心:酪氨酸酶的活性中心是由两个含铜离子位点构成.在催化过程中,双核铜离子位点以3种形态存在,分别是氧化态、还原态和脱氧态.研究表明与酪氨酸酶结合的双核铜离子活性中心与在血蓝蛋白中发现的活性中心非常相似、白化病概念:白化病是由黑色素合成相关基因突变导致黑色素沉着减少或缺失引起的一类遗传性疾病的总称。
酶的提取及其活性影响
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青 岛 科 技 大 学本 科 毕 业 设 计(科 技 论 文)题目 __________________________________ __________________________________指导教师__________________________ 辅导教师__________________________ 学生姓名__________________________ 学生学号______________________________________________院(部)____________________________专业________________班 ______年 ___月 ___日酪氨酸酶的提取及其催化活性研究 影响唾液淀粉酶活性的因素化学 应用化学 112 2014 11 14酶的提取及其催化活性研究摘要绝大多数酶的化学本质是蛋白质,本文从酶活性的定义出发,论述了酶的种类、特性以及影响酶活性的因素,酶在人们的生产、生活中均有广泛应用,探讨酶的特性对研究酶的人工合成有积极意义,通过与酶促反应速率的影响因素的比较,阐释影响酶活性的因素,来帮助我们正确理解酶活性以及理解酶活性的影响因素。
The chemical nature of most enzymes are proteins, from the definition of enzyme activity of enzyme, discusses the types, characteristics and factors affecting enzyme activity, enzyme are widely used in people's production and life, has a positive meaning to explore the properties of the enzyme to study enzymatic synthetic, through influence and enzymatic reaction the rate of factor comparison, explains the factors affecting enzyme activity, to help us to correctly understand the enzyme activity and enzyme activity factor influence understanding.关键词:酶;活性;影响因素1.综述1.1酶的简介酶(enzyme)是由生物细胞合成的、对特定底物(substrate)起高效催化作用的蛋白质,是生物催化剂。
酶的种类,活性及影响因素
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【摘要】:酶广泛存在与生物体中,对生命的生化反应至关重要
,本实验主要探究不同浓度下催化活性的不同,以及温度,pH值,抑 制剂对于酶活性的影响。
【关键词】:酪氨酸酶,唾液淀粉酶,活性,pH,温度
,抑制剂
【酶的特性综述】
酶是一种具有生物活性的蛋白质,有单纯酶和结合酶 两种。单纯酶只含蛋白质,不含其它物质,其催化活性 仅由蛋白质的结构决定。结合酶则由单纯蛋白质和辅基 组成,辅基是结合酶催化活性中不可缺少的部分。 (1)酶的催化效力远远超过化学催化剂(高108~109倍)。 (2)酶催化剂具有高效化学选择性,能从混合物中选择特 定异构体进行催化反应。 (3)酶催化剂对反应条件要求苛刻,如pH值、温度都各有 特定的界限,超出界限即可引起酶蛋白的变性与分解。
根据实验数据所画图及求出的活度来看,分别加入0.1ml、0.2ml、0.3ml、 0.4ml的活性是不一样,按照实验推测,应该是逐渐上升的,但是从实验结果 反应的情况上来看,并不是如此,而是上升之后下降,原因在于酶提取液提 取之后保存方法不得当,并没有冰浴,所以导致酶失活,从而导致活性下降 的情况
酶活性影响因素的研究
结论
(1)酶是一种活性蛋白质,因此,一切对蛋白质有影响的因 素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性,受温度、pH值、 酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影 响。 (2)提取物在放置过程中变黑,是由于他们的组织中都含酪 氨酸和酪氨酸酶,酶存在于组织内部,当内部物质暴露于空 气中,在氧的参与下将发生反应,生成黑色素。 (3)酶的催化作用,只有在一定温度下才能体现出来。酶在 低温下活性暂时被抑制,高温时会永久失活。
酪氨酸酶简介
酪氨酸酶的催化作用
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酪氨酸酶的催化作用[原理]酪氨酸酶是一种以铜为辅基的结合蛋白酶,这种氧化酶可直接作用于底物多巴生成多巴醌,然后经过一系列的反应,最终生成黑色素。
在多巴转变为多巴醌的反应中,酪氨酸酶使多巴中的氢原子的两个电子传递给分子氧,使后者转变为氧离子,游离在溶液中的两个质子与氧离子化合生成水。
其催化的主要反应及电子传递过程如下:酪氨酸是甲状腺素、肾上腺素和黑色素的前体。
人类皮肤、毛发和眼睛虹膜的黑色素是酪氨酸在酪氨酸羟化酶催化作用下生成了3,4-二羟苯丙氨酸(简称多巴,DOPA ),后者在酪氨酸酶的作用下生成多巴醌,而后经过一系列中间反应,最后聚合成黑色素。
白化病(albunism )是一种表现为皮肤、毛发和虹膜变白,因为缺乏酪氨酸酶而不能合成黑色素的先天性代谢缺陷性疾病。
酪氨酸酶也广泛分布于植物界,例如新鲜蘑菇、马铃薯(外层含量尤多)和谷物等。
[试剂]1.酪氨酸溶液 0.1g 酪氨酸溶于100ml 0.1%碳酸钠溶液中。
2.马铃薯抽提液 切碎马铃薯约6g 置于研钵中,加少量净砂,研成匀浆,再加蒸馏水l0ml 充分研磨;最后通过棉花过滤,即可获得含有酪氨酸酶的马铃薯抽提液。
3.煮沸过的马铃薯滤液 取2ml 试剂2于试管内,在酒精灯上加热至沸以破坏酶的活性。
4.液体石蜡[主要器材]研钵、恒温水浴箱CHCOOH NH 2 酪氨酸 2[操作步骤]取试管3支按表10进行操作表10试剂(滴) 1 2 3煮沸过的马铃薯液20 ——马铃薯抽提液—20 20酪氨酸液20 20 20充分混匀各管液体石蜡—— 5置35℃~40℃水浴约30分钟,观察并记录各管颜色,试解释所得的结果。
[注意事项]1.煮沸马铃薯液时,小心勿使液体溅出。
2.加液体石蜡时宜斜执试管,沿管壁缓缓加入,不要产生气泡;加入的液体石蜡必需完全覆盖液面,以隔绝空气。
2013-14学年第一学期应用化学专业实验讲义
![2013-14学年第一学期应用化学专业实验讲义](https://img.taocdn.com/s3/m/ae69e4de76a20029bd642df0.png)
1、完成一篇关于酶的特性(或活性)的综述,要求:1)不少于2000字;2)手写或电子稿都可;3)要求至少有3篇中文文献;2、已酪氨酸酶的提取及其催化活性研究和影响酶的活性的因素的实验数据为依据,撰写一篇科技论文;3、将上述的科技论文做成ppt;10.1开学后第一周内以班级形式上交,手写版或打印版交到117,电子版发到chenlei1972@应用化学专业实验讲义苯丙乳液的制备一、实验目的:1、掌握用乳液聚合法制备高分子材料的一般原理和合成方法;2、了解目标乳合物的设计原理。
二、实验原理(概述):乳液聚合是以水为连续相(分散剂),在表面活性剂(乳化剂)存在下,使聚合反应发生在由乳化剂形成的乳胶粒内部(即表面活性剂形成的胶束作为微反应器),制备高分子材料的一种方法。
目前,因为在世界范围内采用乳液聚合法制备大量的、各种类型的乳液聚合物和聚合物乳液产品,因此乳液聚合被广泛应用于各个技术领域,成为不可缺少的材料或工作物质。
特别是人们环境保护意识的加强,乳液聚合技术已成为制备“环境友好材料”的主要方法。
在工业生产中有多种用途:(1)用乳液聚合法可大量生产合成橡胶如丁苯橡胶、丁腈橡胶、氯丁橡胶、聚丙烯酸酯橡胶等。
(2)用乳液聚合法生产合成塑料、合成树脂。
如聚氯乙烯树脂、ABS树脂、聚四氯乙烯树脂、聚丙烯酸树脂等。
(3)用乳液聚合生产各种用途的聚合物乳液,如各种粘合剂(聚醋酸乙烯脂乳液—白胶等)、涂料(如建筑涂料、金属涂料、木制器涂装涂料等)。
乳液聚合技术较本体聚合、溶液聚合、悬浮聚合相比较,有许多重要特点、优点,既可制备高分子量的聚合物,又有高的聚合反应速率。
反应体系易散热,有利于聚合反应的控制。
生产设备和工艺简单,操作方便,灵活性大,代表了环境保护技术的发展方向,很多场合下,聚合物乳液可直接利用。
因此,近年来乳液聚合技术发展很快,特别是在聚合技术上派生、发展了多种新技术、新方法。
乳液聚合体系主要有四大组分:单体、分散介层(水)、乳化剂、引发剂,其次还有用了pH调节并改善乳液流动性的电解层,pH调节用的中和剂等。
海藻酪氨酸酶的分离纯化及性质研究【开题报告】
![海藻酪氨酸酶的分离纯化及性质研究【开题报告】](https://img.taocdn.com/s3/m/62da2fb64693daef5ef73db3.png)
毕业论文开题报告生物技术海藻酪氨酸酶的分离纯化及性质研究1. 课题研究意义及国内外研究现状酪氨酸酶又称多酚氧化酶,广泛存在于微生物、动植物和人体,它具有单酚酶活性和二酚酶活性。
在机体内它能将L2酪氨酸羟化,产生邻位二羟基苯丙氨酸( L2多巴) ,再将多巴氧化成多巴醌,进而生成一系列引起褐化的色素类物质。
是皮肤黑素生物合成的关键酶,不仅决定黑素合成的速率, 还是黑素细胞分化成熟的特征性标志。
酪氨酸酶是一种含铜的金属酶, 每1个亚基含2个金属铜离子,2个铜离子分别与蛋白质分子中组氨酸结合,另有1 个内源桥基将2个铜离子联系在一起,构成酪氨酸酶催化氧化反应活性中心。
酪氨酸等物质与酶形成过渡态络合物时,主要是羟基与酶的活性中心上的原子键合而发生作用。
它的活性与黑色素的生成有密切的关系。
酪氨酸酶的分布与动物的生理功能息息相关,不同动物的酪氨酸酶在体内分布的部位不同。
多数昆虫在正常生理状态下,酪氨酸酶以酶原的形式存在,不同类型的酪氨酸酶存在于昆虫的特定部位,以完成特定的生理功能。
哺乳动物酪氨酸酶催化产生的黑色素被分泌进入到表皮和毛发的角质细胞中,使体表着色,从而起保护皮肤和眼睛、抵御紫外线的辐射和防止内部组织过热等作用,哺乳动物酪氨酸酶常见于黑素细胞中,黑素细胞是存在于皮肤,发囊和眼睛中并产生色素的高度特异性的细胞,酪氨酸酶功能减退或缺失时,即会影响黑色素代谢,从而发生疾病如白癫疯和白化病,动物与人的常染色体隐性疾病也与酪氨酸酶的缺失或活性下降有关。
近年来黑色素在防紫外线辐射、清除自由基、作为无定形半导体、化妆品、以及生物杀虫剂的光保护剂等方面都具有广阔的应用前景。
酪氨酸酶的抑制剂可被作为化妆品中的增白剂如熊果甙和曲酸,因此可以以酪氨酸酶作为研究对象寻找更好的美白剂。
同时,人们一直在研究酪氨酸酶活性的抑制剂和激活剂,为色素沉着、黑色素瘤以及白癜风等色素疾病的预防和治疗寻找新的手段。
目前,对酪氨酸酶的研究主要集中在酶的分离纯化、催化机制、活性调控以及酪氨酸酶基因及其在生物体内的生理作用等方面,并且人们已经从微生物、植物及多种动物中提取并纯化了酪氨酸酶。
苹果中酪氨酸酶的提取及其催化活性研究
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1 实 验 部 分
1 1 实验仪器 与试剂 . 仪 器 : i 7 0 B可 见分 光 光 度计 ( 尼柯 仪 器 有 限 公 司 )C r 0 ~ s l se t p oo tr Unc 2 2 o 尤 , ay 3 0UV Vii e p cr h tmee b o
1 5 酶 的 活性 测 量 .
取 2 5mL上 述提取液 用 p . H=7 2的缓 冲溶 液稀释 至 1 . 0mL比色管中 , 摇匀. 0 1 取 . mL稀 释过的提取 液于 1 0mL比色管 中 , 入 2 9mL p 加 . H一6 0的缓 冲溶液 , 加入 2mL邻苯二 酚溶 液 , . 再 同时 开始计时 , 用分 光光度计在 4 1n 处测定 吸光度 . 1 m 开始 6mi n内每分钟读一 个数 , 以后 隔 2mi n读一个数 , 直至吸光度 变化
反应式 如下 :
HO
O 酶 ,
H0
因此可 以测定邻 苯 二酚转 化为邻 苯 醌 的速 率 而测定 酶 的活性. 用 吸光度 对时 间作 图 , ( 从所 得 的直线 斜 率求 出酶 的活性 )一 般定 义在 优化 的条件 下 , 5 . 2 C时在 1mi n内转化 1 mo L底 物所 需要 的量 为酶 的活 性 单位. 酶的活性计 算公 式 : 为加入 的酶体积 . 进 一步计算 出所用 原料 中的酶 的活性 : 口一 A kV × 1 A/t 0
第 4期
李好 样 等 : 果 中酪 氨 酸 酶 的提 取 及 其 催化 活 性 式中 : 为原料 中酶 的活性 , 为原料 所得的酶溶 液的 总体积 , 为原料 总质量. A 。
酪氨酸酶提取及活性研究
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荧光光谱法
总结词
荧光光谱法是一种利用荧光物质与酪氨酸酶相互作用产生的荧光信号变化来研究酶活性 的方法。
详细描述
荧光光谱法通过测量荧光信号的强度和波长变化,可以分析荧光物质与酪氨酸酶的结合 情况以及酶的催化过程。该方法具有高灵敏度和选择性,适用于生物体系中的酪氨酸酶
活性研究。
紫外可见光谱法
总结词
紫外可见光谱法是通过测定酪氨酸酶在紫外可见光区的吸收光谱来研究酶活性的方法。
有机溶剂萃取法
• 有机溶剂萃取法:利用有机溶剂将目标物质从水相中萃取 出来。常用乙醚、氯仿等。
离子交换法
• 离子交换法:利用离子交换剂将目标物质与溶液中的其他离子进行交换,从而实现分离。常用DEAE-纤维素 、CM-纤维素等。
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药物研发
基于酪氨酸酶的催化机制,开发具有治疗作 用的新型药物或药物前体。
生物工程
利用酪氨酸酶在酶工程领域进行蛋白质改造 和优化,提高酶的催化效率和稳定性。
感谢您的观看
THAபைடு நூலகம்KS
在食品工业领域的应用
• 酪氨酸酶在食品工业中主要用于生产 食品添加剂和调味品。例如,它可以 催化产生茶多酚和咖啡色素等天然色 素,为食品提供丰富的色泽。此外, 酪氨酸酶还可用于生产香精和调味剂, 提高食品的口感和风味。
酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究
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酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究作者摘要关键词一.实验目的1.认识生物体中酶的存在和催化作用,便于我们了解生物体系中酶存在下的合成或分解与普通的有机合成的不同和相同之处,认识一些生物化学过程的特殊性。
2.掌握生物活性物质的提取和保存方法,学会使用仪器分析的手段研究催化反应特别是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。
二.实验原理许多复杂的有机物合成与分解反应需要在高温、高强酸碱或减压等苛刻条件下才能进行,而在生物体内,即使在十分温和的条件下,如常温、常压和近中性溶液中,许多复杂的化学反应却能顺利进行,其根本原因就是由于生物酶的存在。
生物酶是一种生物催化剂,按照它的组成,可分为两类,一类是简单蛋白质,其活性取决于它的结构,如脲酶、淀粉酶等;第二类的结合蛋白质酶,它需要加入某些非蛋白质组分(称为辅助因子)后,才能表现出酶的活性。
酶蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶。
例如酪氨酸酶是以铜离子为辅助因子的全酶。
通常反被酶作用的物质称为该酶的底物,一种酶催化特定的一个或一类底物的反应,具有很高的选择性和灵敏度,因而引起广大分析工作者的重视和兴趣。
酶已作为一种分析试剂得到应用。
特别是有生化、医学方面有很高的应用价值。
例如生命物质和流体中的特殊有机成分,用其他方法测定有困难,用酶法分析却有其独到之处。
本实验从土豆中提取酪氨酸酶,并测定其催化活性。
当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的,这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶,酶存在于物质内部,当暴露在空气中后,在氧气的参与下,会发生一系列反应。
以下是主要的反应过程。
由于多巴转变成多巴红的反应速率较快,再转到下一步产物速率则慢得多,故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。
因多巴红具有特殊的颜色,故可用分光光度法测定,在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度,用吸光度对时间作图,从所得的直线斜率求酶的活性。
酪氨酸酶的提取及其催化活性研究
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实验:酪氨酸酶的提取及其催化活性研究一、前言:生物酶的基本知识酶(enzyme)是由生物细胞合成的、对特定底物(substrate)起高效催化作用的蛋白质,是生物催化剂。
生物体内所有的化学反应几乎都是在酶的催化作用下进行的。
只要有生命活动的地方就有酶的作用,生命不能离开酶的存在。
在酶的催化下,机体内物质的新陈代谢有条不紊地进行着;同时又在许多因素的影响下,酶对代谢发挥着巧妙的调节作用。
生物体的许多疾病与酶的异常密切相关;许多药物也可通过对酶的作用来达到治疗的目的。
随着酶学研究的深入,必将对人类社会产生深远影响和作出巨大贡献。
酶与一般非生物催化剂相比,具有以下几个特点:1、酶的主要成分是蛋白质。
它具有表现活性和专一性所必需的空间结构,以提供反应中心。
由于蛋白质遇高温、强酸、强碱、重金属盐或紫外线等容易变性而失活,所以酶促反应都是在比较温和的条件下进行的,如人体中的各种酶促反应,一般都为37℃)和pH约为7的条件下进行。
2、酶促反应所需的活化能较低。
如使1mol蔗糖水解所需活化能高达1.34MJ,用H+离子作催化剂时活化能降至87.9 KJ,若用蔗糖酶催化时只需39.4 KJ。
3、酶的催化效率非常高。
酶的催化效率通常比非催化反应高108 ~1020倍,比一般非生物催化剂高107~1013倍。
如存在于血液中能催化H2CO3分子分解的碳酸酐酶,它的催化效率非常高,每一分子每分钟可以催化数万个H2CO3分子分解。
正是因为血液中有这样高效率的酶,才能及时完成排放CO2的任务,维持血液的正常生理pH值。
4、酶具有高度的专一性。
酶对所作用的底物有严格的选择性,每一种酶只能对某一类物质甚至只对某一种物质起催化作用,这是一般非生物陈化剂所无法比拟的。
影响酶作用的因素有酶的浓度、底物浓度、pH值、温度和抑制剂等。
在酶浓度恒定的情况下,增加底物的浓度,可以提高酶促反应的初速度。
当底物浓度增至某一限度后,反应初速度就不再随底物的浓度而变化,而是逐渐趋近某一极限值,这个极限值称为最大速度(V max)。
【word】马铃薯中酪氨酸酶的提取及其活性的研究
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马铃薯中酪氨酸酶的提取及其活性的研究第25卷,第6期2008年11月光谱实验室ChineseJournalofSpectroscopyLaboratoryV o1.25,No.6November,2008马铃薯中酪氨酸酶的提取及其活性的研究李好样吕海燕董金龙①(太原师范学院化学系太原市黄陵路19号030031)摘要采用缓冲溶液法提取马铃薯中的酪氨酸酶,以邻苯二酚溶液为底物,测定了不同体积的酶的活性,研究了在不同pH值,温度和无机盐的条件下对酶活性的影响.确定了酶活性的最适温度为40C和最适pH值为6.78.关键词酪氨酸酶,活性,提取.中图分类号:0561.3;0657.32文献标识码:A文章编号:1004—8138(2008)06—1040—041前言2实验部分旱①联系人.电话:(0351)2275129;E—mail:***********************.cn作者简介:李好样(1965一),女,山西省运城市人,副教授.从事有机化学教育和科研工作.收稿日期:2008—04—01;接受日期:2008—0618第6期李好样等:马铃薯中酪氨酸酶的提取及其活性的研究一般定义在优化的条件下(pH,离子强度等),25℃时在lmin内转化lt~mol底物所需要的量为酶的活性单位.通过下式可计算出所用的酶的活性:a=AA/ktV×10式中:——所用溶液的酶的活性,△——最大吸收处吸光度的变化,f——时间,是——邻苯二酚的摩尔吸收系数,——加入的酶体积.进而计算处所用原料中的酶的活性:A—aV0/m式中:——原料中酶的活性,.——原料所得的酶溶液的总体积,——原料总质量.2.3酶的提取L7在研钵中放入10g切碎了的土豆,加入7.5mIpH=7.2的磷酸缓冲溶液,用力挤压.用两层纱布滤出提取液,立即离心分离(约3000rmp,5min),倾出上层清液保存于冰浴或冰箱中.提取液为棕色,在放置过程中不断变黑[8].2.4邻苯醌溶液的吸收光谱取0.5mI土豆提取液,加入4mIpH=6.0的缓冲溶液,再加入0.5mI邻苯二酚溶液,摇匀,反应约10min后,使用lcm比色池于扫描分光光度计上,进行重复扫描,可获得邻苯醌溶液的吸光度达到最大值0.624时,最大吸收波长为41lnm.2.5酶活性的测定取2.5mL上述提取液用pH=7.2的磷酸缓冲溶液稀释至10mI比色管中,摇匀.取0.1mI稀释过的提取液于10mI比色管中,加入2.9mIpH=6.0的缓冲溶液,再加入2m[邻苯二酚溶液,同时开始计时,用分光光度计在41lnm处测定吸光度.开始6min内每分钟读1个数,以后隔2rain读1个数,直至吸光度变化不大为止.取0.2mI,0.3mI,0.4mI已稀释过的提取液重复上述实验.[注意总体积为5mI,每次换溶液洗比色皿只能倒很少量溶液洗1次.]以吸光度对时间作图,从直线斜率求出酶的活性[9].2.6不同pH值对酶活性的影响取2.5mI上述提取液用pH=7.2的磷酸缓冲溶液稀释至10mL比色管中,摇匀.取0.2mI稀释过的提取液于10ml比色管中,分别加入2.8mIpH=6.0,6.32,6.78,7.2,7.5的缓冲溶液,再加人2mI邻苯二酚溶液,同时开始计时,用分光光度计在41lnm处测定吸光度.开始6min内每分钟读1个数,以后隔2min读1个数,直至吸光度变化不大为止.2.7温度对酶活性的影响取2.5mI上述提取液用pH=7.2的磷酸缓冲溶液稀释至10mI比色管中,摇匀.取0.4mL稀释过的提取液于10mI比色管中,加入2.6mIpH=6.0的缓冲溶液,分别在10lC,20C,30’C,40~C,50C,60”C,70’C的水浴中及沸水浴预热10min左右,再加入2mI 邻苯二酚溶液,同时开始计时,用分光光度计在411nm处测定吸光度.开始6min内每分钟读1个数,以后隔2rain读1个数,直至吸光度变化不大为止.2.8无机盐对酶活性的影响取0.4m1稀释过的提取液于10mI比色管中,加入2.6mIpH=6.0的缓冲溶液,加少量固体配成Na:S.O.溶液观察现象.光谱实验室第25卷3结果与讨论3.1酶活性的测定以吸光度对时间作图,由直线部分得出邻苯二酚的转化速率,即为酶的活性.依次得出不同体积提取液的活性,如表1所示.表1酶的活性计算由表1可以看出随着加入提取液体积的增大(即酶的浓度增大),酶的活性增大,但计算出原料中的酶的活性却减少了.3.2不同pH值对酶活性的影响酶是一种生物活性物质,调节pH值能有效地改变酶的活性.以吸光度对时间作图,由直线的斜率得出邻苯二酚的转化速率即为酶的活性,结果如图1所示:以酶的活性为纵坐标,pH为横坐标作图,如图1所示可看出不同pH 值对酶活性的影响情况.O.140字0.tOOa0.060忙避0.0206.OO7.OO8.OOpH图1pH值对酶活性的影响//\\,建l\,避O.000L————————r—————,1温度t/’C图2温度对酶活性的影响由图1可看出,酪氨酸酶的活性达最佳的pH值为 6.78.pH值为6.32—7.2时酪氨酸酶的活性较高,pH值小于6.0时活性很低,而pH值大于6.78后活性又缓慢降低.3.3温度对酶活性的影响不适宜的温度会破坏活性部位三维结构的完整性,而它又是保持酶活力的关键,因此温度是影响酶活性的一个重要因素.分别在不同温度测定酶的活性,结果如图2所示:以酶的活性为纵坐标,温度为横坐标作图,如图2所示,可看出不同温度对酶活性的影响情况.由图2可看出,酪氨酸酶的最适温度为40’C.随着温度的升高,酪氨酸酶的活性不断提高,达到最大值后,酶的活性又逐渐降低.当温度达到70’C,可近似地认为酶已没有活性,即酶失活.因此,调节温度特别是低温条件能有效地抑制酶的活性.3.4无机盐对酶活性的影响一些无机盐会抑制酶的活性,在提取液中加入NaSO.,测酶的活性结果如表2所示.第6期李好样等:马铃薯中酪氨酸酶的提取及其活性的研究1043 由表2可知:在加入无机盐Na.sO.后酶的活性失去,且不可恢复是永久性失活.参考文献[13胡源,刘克武,喻东.刘鑫,黄新河,唐成康,姜骅,季雯娟.马铃薯酪氨酸酶的性质口].化学研究与应用,2005,17(1):5s一57.[2]柳荣,刘祥云,张云贵,李天俊.酪氨酸酶的基础研究及其在生化教学中的应用[J].天津农学院,1994.1(1—2):56—6O.[3]S~nehezF.RodriguezL6pezjN,GarciaCAnovasF.Tyrosinase:ACompr ehensiveReviewofitSmeeha2nism[J’].Biochim.BiophysActa.1995.1247:l—l1.[4]薛超彬,陈清西,王勤.菜青虫不同虫态及虫龄的多酚氧化酶性质比较口].昆虫,2004,47(3):305—3o9.[5]潘兴华.黑素细胞及黑素的生成与调节[J].生理科学进展,1998.29(2)t179一l81.[63孟雅.李刚.崔焱,张龙.马铃薯多酚氧化酶的提取纯化条件对其活性影响的研究EJ].化学与生物工程,2006,23(10):77—78.[73李立祥.吴红梅.提取方法对茶多酚氧化酶活性的影响[J].中国茶叶加工.2001,(4):26—31.[8]李敏.文U磊.郭玉蓉.陈德蓉,李永才.马铃薯多酚氧化酶的特性研究[J].甘肃农业大学.2005,40(2):2l~24.[9]宋康康,邱凌,黄璜.熊果甙作为化妆品添加剂对酪氨酸酶抑制作用[J].厦门大学:自然科学版.2003,42(6):9l一94. TheStudyofExtractionandtheActivityofTyrosinasefromPotato LIHao—Y angLUHai-YanDONGJin—Iong (DepartmentofChendstry?Taiy11a~1NormalUniversity,Taiyuan030031, P.R.China) AbstractThepotatotyrosinasewasextractedbybuffersolution,andtheenzy meactivitytocatecholassubstratewasstudied.TheeffectsofpHtemperatureandtheinorga nicsaltontheimpactoftheactivitywerestudied.Theoptimumtemperatureof4OCandpHof6.78w ereobtained.KeywordsTyrosinase,Activity,Extract.这真是令人啼笑皆非——重大发明创造被视为”旧货”!欢迎作者将被退稿佳作,再投本刊在2O世纪的科技成就中,激光可算是重大发明创造之一.第一台激光器是1960年由美国物理学家梅曼(见《邮票上的科学家——佼佼者之路》中之M4)研制出来的.然而《物理评论快报》却拒绝刊登梅曼的论文.理由是:这是微波激射物理学方面的文章,对快速出版物不再有价值.这真是令人啼笑皆非j接着.梅曼将论文寄到了英国《自然》杂志,这篇300字的简短文章立即被接受.发表后引起全世界轰动.后来,梅曼被列入了美国发明家名人堂.为了吸取历史教训.本刊收到的论文,即使其观点与审稿人有尖锐的意见冲突.只要是言之有理,也给予发表.因为”仁者见之谓之仁,智者见之谓之智”(《周易?系辞上》),不同人从不同角度看问题,难免不同.我们欢迎作者将被退稿佳作,再投本刊.《光谱实验室》编辑部。
酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究
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一、底物浓度对酶促反应的影响
随反应物浓度S的增大,酶促反应速度V 增大。当底物的浓度较低时,V随〔S〕 增大而急剧增大,二者成正比关系;随 着〔S〕的继续增大,V继续增大,而增 幅逐渐减小,若再继续增大〔S〕,则V 将不再变化, 达到一个极 限值Vmax。
酪氨酸酶对多巴的催化氧化原理
影响酶促反应速度的因素: 酶的浓度[E] 底物的浓度[S] 溶液的pH值 温度 酶的抑制剂 酶的激活剂
二、实验原理
酶催化剂的特点
1.具有表观活性和专一性所需要的结构空间,反应能在比较 温和的条件下进行; 2.酶促反应的活化能较低; 3.酶的催化能极高; 4.酶具有高度的专一性。
3.抑制剂的影响:按表2的所列的数据进行溶 液的配制,以0号溶液为参比溶液,按步骤2 的方法测量各个溶液的吸光度随时间的变化。
数据记录表1
项目 00
缓冲溶 液 多巴溶 液 酶提取 物
0 3.8 1.0 0.2
1 3.8 1.0 0.2
2 3.3 1.5 0.2
3 2.8 2.0 0.2
4 2.3 2.5 0.2
1 2
3
4
5
时间 1吸光度 浓度
2 3 4 5
1.根据朗伯-比尔定律,将测得的吸光度计算 转化为浓度,以浓度为纵坐标,时间为横坐 标作图,求得直线的斜率即为反应的速度v; 2.根据双倒数米氏方程,以1/v为纵坐标, 1/[S]为横坐标作图,求得直线的截距和斜率 即可计算反应的最大速度vmax和米氏常数Km; 3.抑制剂的影响:求出未加入和加入抑制剂 的反应速度,以反应速度为纵坐标,抑制剂 浓度为横坐标作图,判断抑制剂对反应的影 响。
土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究 (终稿)
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本科毕业论文(设计)题目:土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究学生:蒋泽琦学号: 201040320111学院:生命科学学院专业:生物科学入学时间: 2010 年 09 月 15 日指导教师:张秋研职称:助理实验师完成日期: 2014 年 05 月 04 日诚信承诺我谨在此承诺:本人所写的毕业论文《土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究》均系本人独立完成,没有抄袭行为,凡涉及其他作者的观点和材料,均作了注释,若有不实,后果由本人承担。
承诺人(签名):年月日土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究不同因素对酪氨酸酶活性的影响学位申请人:蒋泽琦导师:张秋研摘要酪氨酸酶从目前的研究看来是一种由Cu+ 或Cu2+作为辅助因子构成的全酶,空气中的氧对多巴的氧化反应就是由其催化的[1]。
而我们可以通过多巴转换反应过程中的颜色变化检测其中的催化过程,所以酶的活性我们可以通过对于吸光度随时间的变化的测定来求得。
本论文则是首先从土豆中提取出酪氨酸酶,而后采用分光光度计法对其的活性进行测定,大约于480nm处使用紫外分光光度计测定土豆提取液的吸光度,将吸光度对于时间的变化率(△A/△V)作为反应的速率,并以此建立对于多巴溶液的转换动力学曲线,得出酪氨酸的活性[2]。
关键词酪氨酸酶;提取;活性;活性动力学曲线Extraction and catalytic activity of Tyrosinase potatoes Abstract:From tyrosinase appears to be a current study of Cu + or Cu2 + as a cofactor holoenzyme composed of the oxygen in the air is oxidation of dopa by catalysis. We can convert the catalytic process and reaction process wherein the color change is detected by dopa, the enzyme activity that we can change with time for the measurement of absorbance to obtain. This paper is the first extract from potato tyrosinase, followed by the spectrophotometer its activity was measured at approximately at 480nm using a UV spectrophotometer absorbance potato extract, the absorbance changes with respect to time rate (△ A / △ V) as the reaction rate, and thus create a solution for the conversion of dopa kinetic curve derived tyrosinase activity.Key words:Tyrosinase; extraction; activity; activity kinetics目录1引言 (1)2 材料与方法 (3)2.1 材料 (3)2.2 方法 (3)2.2.1 酪氨酸酶的提取 (3)2.2.2 酪氨酸最大吸收波长确定 (3)2.2.3 酪氨酸酶的活性测定 (3)2.2.4 酶活性因素测量 (3)3 结果与分析 (4)3.1 酪氨酸最大吸收波长确定 (4)3.2 建立酶的动力学曲线 (4)3.3 计算酶的活性 (6)3.4 影响酶的活性的因素研究 (7)3.4.1 pH值对酶活性的影响 (7)3.4.2 温度对酶活性的影响 (7)3.4.3 抑制剂EDTA对酶活性的影响 (8)4结论 (9)5参考文献 (10)1 引言酪氨酸酶(Tyrosinase),简称TYR,是一种75kD含铜的多酚氧化酶,酪氨酸酶非常普遍的存在于微生物、动植物及人体中[3]。
中国地质大学应用化学综合实验报告
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应用化学综合实验报告——明矾的制备及其单晶培养——酪氨酸酶的提取及催化活性的研究031102班XXX XX实验一 明矾的制备及其单晶培养一、明矾的基本性质与用途明矾,学名为十二水合硫酸铝钾,又称明矾、白矾、钾矾、钾铝矾、钾明矾,是含有结晶水的硫酸钾和硫酸铝的复盐。
其分子式是KAl(SO 4)2·12H 2O ,加合式是K 2SO 4·Al 2(SO 4)3·24H 2O ,相对分子质量为474.39,无色立方,单斜或六方晶体,有玻璃光泽,密度为1.757g/cm 3,熔点92.5℃。
在64.5℃时失去9个分子结晶水,200℃时失去12个分子结晶水,溶于水,不溶于乙醇。
明矾性味酸涩,寒,有毒。
故有抗菌作用、收敛作用等,可用做中药。
明矾还可用于制备铝盐、发酵粉、油漆、鞣料、澄清剂、媒染剂、造纸、防水剂等。
明矾净水是过去民间经常采用的方法,它的原理是明矾在水中可以电离出两种金属离子:KAl(SO 4)2= K + + Al 3+ + 2SO 4 2-,而Al 3+很容易水解,生成胶状的氢氧化铝Al(OH)3:Al 3+ + 3H 2O = Al(OH)3(胶体)+ 3H +,氢氧化铝胶体的吸附能力很强,可以吸附水里悬浮的杂质,并形成沉淀,使水澄清。
所以,明矾是一种较好的净水剂。
二、实验目的(1)学会利用身边易得的废铝材料制备明矾的方法;(2)巩固溶解度概念及其应用;认识铝和氢氧化铝的两性性质;(3)练习和掌握溶解、过滤、结晶以及沉淀的转移和洗涤等无机制备中常用的基本操作和测量产品熔点的方法。
(4)学习从溶液中培养晶体的原理和方法。
三、实验原理1、明矾的制备将废铝样品溶解于稀氢氧化钾溶液中,值得偏铝酸钾:↑+=++222H 32KAlO O H 2KOH 2Al 2在偏铝酸钾溶液中加入过量的浓硫酸,使其生成溶解度较小的复盐明矾(KAl(SO 4)2·12H 2O )反应式为:在不同温度下明矾、硫酸铝、硫酸钾的溶解度(单位:g/100gH 2O )如下表所示:表1.1 明矾、硫酸钾、硫酸铝在不同温度下的溶解度温度(K ) 273 283 293 303 313 333 353 363明矾 3.00 3.95 5.90 8.39 11.7 24.8 71.0 109 硫酸铝 31.2 33.5 36.4 40.4 45.8 59.2 73.0 80.8 硫酸钾7.49.311.1 13.0 14.8 18.2 21.4 22.92、单晶的培养要使晶体从溶液中析出,从原理上有两种方法。
酪氨酸酶的提取及其催化活性研究(课件)
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1. 2材料: 供试原料为市售马铃薯。仪器: V IS 7220 型可见分光光度计(北京瑞利分析 仪器公司); 电热恒温水浴锅( 天津市中环试 验电炉有限公司); 离心机; 秒表。药品: 0. 01 mol/L 二羟基苯丙胺酸( 多巴) 溶液, 0. 10 mol/L N a2HPO4 缓冲溶液( pH 值7. 2和pH 值6. 0) , 盐酸。
2 结果与分析
2. 1酶的动力学曲线的建立 以表1中的吸光度为纵坐标, 时间为横坐标, 可得出在加入酶的作用下, 多巴溶液的转换 动力学曲线, 再由曲线的直线部分得出直线 斜率(即转换速率), 由斜率可求出酶的活性。
2.2 酶的活性计算
根据公式 (其中k是斜率, 由图1可知), 将不同的k、 V值代入公式, 可求得提取液中酪氨酸酶的 活性, 由公式A = a V0 /m(其中V0 = 6. 0 ml、m = 10. 0 g, 即马铃薯原料的总体积 和质量)可得原料马铃薯中酪氨酸酶的活性。
1. 3 方法
1. 3. 1 酪氨酸酶的提取:在研钵中放入10. 0 g切碎的马铃薯, 加入7. 5m l pH值7. 2的缓冲溶液, 研磨挤压。滤出提取液, 离心分离。倾出上层清液保存于冰浴或冰箱中。 1. 3. 2 酶的活性测定:取6. 0 m l上述提取液, 用pH 值 7. 2的缓冲溶液于10. 0 m l比色管中稀释至刻度, 摇匀。取 0. 1 m l稀释过的提取液于10. 0 m l比色管中, 加入2. 9 m l pH 值6. 0的缓冲溶液, 再加入2. 0 m l多巴溶液, 用分光光 度计在480 nm处测定吸光度。开始6m in内每分钟读1个 数, 以后隔2m in读1个数, 直至吸光度变化不大为止, 得吸 光度为A1。取0. 2, 0. 3, 0. 4 m l已稀释过的提取液重复上 述试验, 得吸光度分别为A2、A3、A4。
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酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究
作者
摘要
关键词
一.实验目的
1.认识生物体中酶的存在和催化作用,便于我们了解生物体系中酶存在下的合成或分
解与普通的有机合成的不同和相同之处,认识一些生物化学过程的特殊性。
2.掌握生物活性物质的提取和保存方法,学会使用仪器分析的手段研究催化反应特别
是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。
二.实验原理
许多复杂的有机物合成与分解反应需要在高温、高强酸碱或减压等苛刻条件下才能进行,而在生物体内,即使在十分温和的条件下,如常温、常压和近中性溶液中,许多复杂的化学反应却能顺利进行,其根本原因就是由于生物酶的存在。
生物酶是一种生物催化剂,按照它的组成,可分为两类,一类是简单蛋白质,其活性取决于它的结构,如脲酶、淀粉酶等;第二类的结合蛋白质酶,它需要加入某些非蛋白质组分(称为辅助因子)后,才能表现出酶的活性。
酶蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶。
例如酪氨酸酶是以铜离子为辅助因子的全酶。
通常反被酶作用的物质称为该酶的底物,一种酶催化特定的一个或一类底物的反应,具有很高的选择性和灵敏度,因而引起广大分析工作者的重视和兴趣。
酶已作为一种分析试剂得到应用。
特别是有生化、医学方面有很高的应用价值。
例如生命物质和流体中的特殊有机成分,用其他方法测定有困难,用酶法分析却有其独到之处。
本实验从土豆中提取酪氨酸酶,并测定其催化活性。
当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的,这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶,酶存在于物质内部,当暴露在空气中后,在氧气的参与下,会发生一系列反应。
以下是主要的反应过程。
由于多巴转变成多巴红的反应速率较快,再转到下一步产物速率则慢得多,故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。
因多巴红具有特殊的颜色,故可用分光光度法测定,在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度,用吸光度对时间作图,从所得的直线斜率求酶的活性。
其反应过程如下图所示
酶的活性计算方法:一般定义在优化的条件下(包括pH 值、离子强度、温度等),25℃时在1min 内转化1μmol 底物所需要催化剂的量为活性单位。
通过下式可计算酶的
活性:610⨯∆=
ktV
A
a ,式中,a 为所用溶液的酶的活性,A ∆为最大吸收波长吸光度的变化,t 为时间(min ),k 为多巴红的摩尔吸收系数,V 为加入酶的体积,进而计
算出原料(土豆)中酶的活性:m aV o /A =。
式中A 为原料中酶的活性(注意此处A 不是吸光度A ),V 0为原料所得的酶溶液的总体积,m 为原料总质量。
三.实验仪器与试剂
1、仪器:分光光度计、离心机、研钵、水浴、秒表
2、试剂:二羟基苯丙胺酸(多巴)、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸、土豆
四.实验步骤
1.溶液配制
0.10mol/L磷酸缓冲溶液(pH=7.2):50ml 0.20mol/L磷酸二氢钠+8ml 0.1mol/L盐酸,定容至200ml;
0.10mol/L磷酸缓冲溶液(pH=6.0):50ml 0.20mol/L磷酸二氢钠+22ml 0.1mol/L盐酸,定容至200ml;
0.10mol/L多巴溶液:0.195g多巴,用pH=6.0的磷酸缓冲溶液定容至100ml(现用现配)。
2酶的提取
取新鲜土豆,清洁后切碎,称取10.0g置于研钵中,加入7.5mL pH=7.2的磷酸缓冲溶液,用力挤压,两层纱布滤出提取液,立即离心分离(3000rpm,5min),倾出上层清液保存于冰浴中,提取液为棕色,在放置过程中不断变黑。
3.酶的活性测量
取2.5ml上述提取液用pH=7.2的缓冲溶液稀释到10ml比色管中,摇匀
分别取0.1mL稀释过的提取液于10mL比色管中,加入2.5mL pH=6.0的缓冲溶液,再加入2ml多巴溶液,同时开始计时,用分光光度计在480nm处测定吸光度。
开始6min内每分钟读一个数,以后隔2min读一个数,直至吸光度变化不大为止。
取0.2ml,0.3ml。
0.4ml已稀释过提取液重复上述实验(总体积为5ml)。
以吸光度对时间作图,从直线斜率求出酶的活性。
五.实验数据记录及讨论
数据记录
图表 1 吸光度随时间变化
影响酶活性的因素的研究
(1)取0.40ml稀释过了的提取液在沸水浴中加热5min,冷却后配成测定溶液,观察现象。
(2)取0.40ml稀释过的提取液,加入少量的固体Na2S2O3配成测定溶液,观察现象。
(3)取0.40ml稀释过的提取液,加少量EDTA振动混合,反应一段时间后配成测定溶液,观察现象。
六.实验结果讨论
1、影响酶活性的因素有哪些?
答:酶是一种活性蛋白质。
因此,一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。
酶与底物作用的活性,受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。
2、提取物在放置过程中为何会变黑?
答:它们的组织中都含有酪氨酸和酪氨酸酶,酶存在于物质内部,当内部物质暴露于
空气中,在氧的参与下将发生反应,生成黑色素。
3、热处理后酶的活性为何会显著降低?
答:酶的催化作用,只有在一定温度下才能表现出来。
酶的作用速度与温度的关系为:当酶蛋白没有因受热而变性时,温度每升高10℃,反应速度增加一倍左右。
通常酶的作用速度随温度升高而加速,但温度升高到一定限度后,酶的活性就要钝化,直至完
全失活。