第六节 支原体药敏

第六节支原体

支原体是一类目前所知能在无生命培养基中独立生活，自行繁殖的最小微生物。支原体感染的范围非常广泛，包括人，动物，植物，昆虫及组织培养的细胞。人体可分离出十几种支原体，其中一些对人有致病性如：肺炎支原体、人型支原体、解脲支原体、生殖支原体、及发酵支原体等。能引起生殖泌尿系感染的支原体主要有两种，即解脲支原体和人型支原体。肺炎支原体主要引起呼吸道的感染。

支原体的体外药敏试验最早是在上世纪60年代提出。在过去的40多年中，很多研究采用肉汤稀释法和琼脂为基础的方法报道了支原体的抗菌活性，但一直没有一个公认的、标准的参考方法。在过去的几年，有关支原体体外药敏试验方法学的研究也有一些报道，但仍存在着一些不足。直至2011年CLSI M43指南出现，规范了支原体体外药敏实验的方法（微量肉汤法和琼脂稀释法）、明确了质控菌株及对不同抗生素的MIC范围、建立了临床用于支原体治疗药物的折点。因支原体培养时间较长，临床治疗支原体感染很难依靠培养及药敏的结果，基本上采用经验抗菌药物的治疗，因此支原体体外药敏试验对于临床分离株的耐药性监测以及新药的研发更具意义。

一、药敏的适应征

1.临床分离的支原体通常不需要进行药敏试验，可经验性使用抗菌药物治疗。

2.当临床经验性抗菌药物治疗效果不好时，而可用于支原体感染治疗的药物又非常的有限，需要进行支原体的体外药敏试验。目前，已知可能的耐药包括：

1）人型支原体、脲原体的某些种对四环素类药物的耐药。

2）人型支原体、脲原体的某些种对氟喹诺酮类药物的耐药。

3）肺炎支原体、脲原体某些种对大环内酯类药物的耐药。

4）人型支原体对克林霉素耐药。

这时就要考虑可用于治疗的药物中那些还可以用于耐药菌株的治疗。

3. 从无菌体液或生殖道以外的部位中分离的人型支原体、脲原体应做药敏，尽管人型支原体、脲原体的某些种常常是泌尿生殖道的致病菌。特别是从有播散性感染的患者如：新生儿或免疫低下患者的无菌部位分离的人型支原体、脲原体应进行体外药敏试验。

二、方法学

（一）肉汤稀释法

1. 微量肉汤稀释法

1）方法

在无菌的96孔板上，加入一定量的液体培养基（含有酚红指示剂），将测试的抗生素倍比稀释。加入终浓度为104～105CFU/ml新鲜培养物到不同抗生素浓度孔中。另外设立3个对照孔：阴性对照（只加培养基）；药物对照（肉汤 + 含抗生素肉汤）；阳性对照（肉汤 + 培养物）。加样完毕，在每孔里面滴加3到5滴无菌液体石蜡，防止长时间培养液体挥发影响实验结果准确性。盖上板盖，在适宜的温度和气体环境中培养，阳性对照孔正常生长后读取MIC。

2）观察结果

一般情况下脲原体16-18小时就会产生颜色的变化，因此24小时内应多次观察颜色的变化。人型支原体48-72小时会产生颜色的变化，而肺炎支原体需要4-6天或更长的时间产生颜色的变化。经常观察结果对检测结果的准确性是非常重要的，特别是生长速度较快的脲原体，因为他们生长快速，MIC终点会随时间变化。

2.支原体的浓度测定

支原体的MIC测定需要恰当的培养浓度，以免支原体代谢产物的积累对MIC准确性的影响。处于对数生长期的支原体细胞做药敏最合适，一般最大生长时每毫升能存活支原体数目一般在108左右，支原体的细胞数目液相以颜色改变单位或固相以菌落形成单位来表示，在做MIC之前应该对培养物进行浓度测定。

（二）琼脂稀释法

1. 琼脂及肉汤培养基

1）人型支原体：支原体琼脂和肉汤

2）脲原体：A8琼脂和10B肉汤

3）肺炎支原体：SP4琼脂和肉汤

2. 方法

采用合适的培养基调节储存的支原体菌液及质控菌液至104～105CFU/mL，然后将菌液1：10、1：100、1：1000稀释成 3个浓度，直接点种在含不同浓度抗菌药物的相应的培养皿，接种菌量为1～10μl/点。室温放置使接种点干燥，但不要超过30分钟，然后37℃，5% CO2的环境中孵育。一定的湿度环境有利于支原体的生长及防止培养皿干燥。

3.观察结果：

脲原体孵育24h-48h，人型支原体孵育48h-72h，肺炎支原体孵育4d-6d或更长。

（三）方法学比较

1. 琼脂稀释法：

因其稳定的终点观察时间曾被认为是支原体药敏试验的参考方法，但这个方法不适用于小批量样本或临床单个分离的菌株。

2. 琼脂扩散法：

因为没有建立起抑菌圈与MIC的相关性，不适用于支原体药敏。而且支原体的生长速度较慢，这个方法今后也将会有很多局限性。

3. 微量肉汤法：是目前广为使用的方法，缺点是比较费力，终点会随着时间而变化。

4. 琼脂梯度扩散法：操作简单、终点不随时间变化，更适用于临床分离的单个菌株的药敏试验。

5. 商品化MIC试剂盒：

目前，欧洲有一些商品化的试剂盒用于支原体的MIC测定，成分主要是含有干燥抗生素

（一般有两个浓度）的微孔板，这些试剂盒的结果与传统MIC方法的结果一致，但临床应用很有限。

6. 耐药基因检测：

肺炎支原体的培养常常需要几天的时间，获得药敏结果再需要几天，从临床治疗角度来看体外药敏试验对指导患者治疗的意义不大。目前，肺炎支原体对于大环内酯类抗生素的耐药比率在不断的增加，临床需要快速准确的药敏结果，因此以分子技术为基础的药物耐药基因的检测方法建立起来，可以从临床标本中直接鉴定肺炎支原体并检测有无耐药基因（目前，肺炎支原体对大环内酯类耐药的机制是rRNA的点突变，还没有其他获得性的耐药机制的报道）。

三、质量控制

1.质控菌株

人型支原体：ATCC 23114；肺炎支原体：ATCC 29342；解脲支原体：ATCC 33175

2.人型支原体、肺炎支原体和解脲支原体的质控范围（MIC，μg/mL）：微量肉汤法

抗生素人型支原体

ATCC 23114

肺炎支原体

ATCC 29342

解脲支原体

ATCC 33175

阿奇霉素- ≤0.06 -

克林霉素0.03～0.25 - -

红霉素- 0.004～0.03 1～8

加替沙星0.015～0.12 - -

左氧氟沙星- 0.12～1 0.5～0.2

莫西沙星0.015～0.12 0.03～0.25 0.5～0.2

泰利霉素- - 0.12～1

四环素- 0.06～0.5 -

3.人型支原体、肺炎支原体和解脲支原体的质控范围（MIC，μg/mL）：琼脂稀释法

抗生素人型支原体

ATCC 23114

肺炎支原体

ATCC 29342

解脲支原体

ATCC 33175

阿奇霉素- - -

克林霉素0.06～0.5 - -

红霉素- -

加替沙星0.06～0.25 0.03～0.25 -

左氧氟沙星0.12～1 0.12～0.5 0.5～4 莫西沙星0.06～0.25 0.03～0.25 0.25～2 泰利霉素- - 0.12～1