SDS-PAGE电泳的基础原理和试验步骤
sds-page蛋白电泳分析
实验二SDS－PAGE 蛋白电泳分析一、目的掌握 SDS-PAGE 电泳原理与方法二、电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。
这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。
由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。
三、试剂配制1．30% 丙烯酰胺：将29g 丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml 的水中。
加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。
用过滤器（0.45μm 孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温(丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。
称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料)。
2．1M Tris-Cl: 称取12.191g Tris 碱溶于80ml 蒸馏水中，用浓HCl 调到所需pH 值，定容至100ml。
(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。
在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。
由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。
蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。
基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。
二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。
分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL10%SDS溶液 4.0mL甘油 2.0mL巯基乙醇 2.0mL溴酚蓝 0.02g，混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。
SDS-PAGE电泳1.
❖ Acr（acrylamide）/Bis 储备液 ❖ 10% (w/v) SDS ： ❖ TEMED(四甲基乙二胺) ❖ 过硫酸铵 (AP):10%现配现用 ❖ Tris－HCL缓冲系统， ❖ 分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl, pH 8.8） ❖ 浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl, pH 6.8 ❖ 电极泳缓冲液：使用的Tris－甘氨酸缓冲系统：pH
带负电荷的SDS-蛋白质复合物
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的 迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：
logMW=K-bX， 式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为 常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白 质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移 率即可在标准曲线上求得分子量。
常用的催化剂（包括催化剂和加速剂）
（1）过硫酸铵 (AP) – TEMED （四甲基乙二 胺）系统
在 Acr 和 Bis 的溶液中放入这个催化系统 后，过硫酸铵 [（NH4）2S2O8 ] 产生出游离 氧原子使单体成为具有游离基的状态，从而 发生聚合作用。聚合的初速度和过硫酸铵浓 度的平方根成正比。这种催化系统需要在碱 性条件下进行（pH8.8)。
6.染色和脱色：
❖当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘 1 cm 时， 电泳结束。 ❖将胶剥离，放入容器中，用蒸馏水清洗2-3 遍，倒入染色液染色2-3h或静置过夜。 染色结束后，用蒸馏水冲洗胶2-3遍，以清除 多余的染料，倒入脱色液，置于脱色摇床上 脱色，中间换1-2次脱色液，直至背景色完全 脱掉。
❖ 附： 样品的制备
❖ 称取植物材料 1 g ，放入研钵内，加 pH8.0 提取液 1 mL ，于冷水浴中研成匀浆，然后 以 2 mL 提取液分几次洗入离心管，在高速 离心机上以 8000 rpm 离心 10min 。
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一，可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。
下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。
SDS-PAGE电泳的原理：SDS-PAGE电泳是一种基于PAG（聚丙烯酰胺凝胶板）的矩阵上运行的直流凝胶电泳。
相对分子质量（MW）是以电泳迁移距离为单位来表示的。
蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动，因此，蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。
通过使用外部标准，可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。
这种分离方法受到电荷和大小作用的影响，电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。
SDS-PAGE电泳的过程：SDS-PAGE电泳的过程主要包括：样品加载、电泳和染色步骤。
（1）样品加载：样品的制备：蛋白质样品通常经过还原和变性，以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。
这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液，然后在热水浴或高压下暴露于还原剂，例如2-硫代乙酸（DTT）或β-巯基乙酸（MEA）。
（2）电泳：将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。
随着电场的施加，蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移，从而分离出蛋白系列。
（3）染色：电泳结束后，将凝胶板进行染色。
目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。
SDS-PAGE电泳的应用：SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。
其中，蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。
通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳，可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。
SDS-PAGE电泳的基本原理和应用
SDS-PAGE电泳的基本原理和应用1. SDS-PAGE电泳的基本原理1.1 电泳原理SDS-PAGE是一种基于凝胶电泳的蛋白质分析技术。
其中SDS是十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate）的缩写，是一种表面活性剂，能够使蛋白质样品中的蛋白质在电场作用下带负电荷，同时也能够给蛋白质提供线性结构。
1.2 凝胶电泳凝胶电泳是一种利用膠體凝膠將生物物质分开的电泳技术。
在SDS-PAGE中，常使用聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）作为电泳介质。
聚丙烯酰胺凝胶是一种聚合物凝胶，通过调整聚丙烯酰胺单体和交联剂的比例，可以调整凝胶的孔径。
1.3 SDS-PAGE的步骤SDS-PAGE主要包括以下几个步骤：•准备样品：将待测蛋白质样品添加SDS、还原剂和草酸，使蛋白质样品变性和解离。
•准备凝胶：制备聚丙烯酰胺凝胶，将之倒入电泳槽中，插入电泳板。
•加载样品：将准备好的样品加入凝胶双孔板中，注意标记样品位置。
•电泳：将准备好的样品盖在电泳槽上，接上电源进行电泳分离。
•显色染色：将分离出的蛋白质进行显色染色，以观察结果。
•图像分析：利用成像仪或凝胶图像分析系统对染色的凝胶图像进行定量分析。
2. SDS-PAGE电泳的应用2.1 蛋白质分析SDS-PAGE电泳是蛋白质分析的基础技术，通过对蛋白质样品进行电泳分离，可以获得蛋白质的表观分子质量、纯度和组成信息。
这对于研究蛋白质结构、功能以及与疾病的关系等具有重要意义。
2.2 分子生物学研究SDS-PAGE电泳在分子生物学研究中有多种应用。
例如，可以用于检测基因表达的变化，比较不同条件下的蛋白质组分等。
此外，SDS-PAGE也可以用于鉴定蛋白质的亚细胞定位、研究蛋白质与其他分子（如核酸、小分子化合物等）的相互作用等方面。
2.3 药物研发SDS-PAGE电泳在药物研发领域也有广泛应用。
例如，可以用于药物候选化合物与蛋白质之间的相互作用研究，评估药物的结合能力和亲合力。
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一.实验目的学习SDS-聚丙烯跌胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。
二、实验原理蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。
当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pl)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点吋，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少.蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺礙胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。
本实验釆用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表現出不同的迁移率。
由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子董大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。
这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。
同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，釆用两种缓冲体系；上层胶pH二一，下层胶pH=; Tris—HCI缓冲液中的Tris 用于维持溶液的电中性及pH,是缓冲配对离子：Cl-是前导离子。
在时，缓冲液中的Gly为尾随离子，而在卩日=吋，Gly的解离度增加：这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。
不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。
由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子拜效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。
A B如果在聚丙烯酰胺;疑胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDS带有大董的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如疏基乙醇存在下，蛋白质分子內的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质一SDS复合物：此时，蛋白质分子上所带的负电荷董远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。
sds-page蛋白凝胶电泳原理
在进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳原理的讨论之前，我们首先需要了解蛋白质和电泳技术的基本概念。
蛋白质是生物体内功能最丰富的大分子化合物，它们参与了生命的方方面面，包括结构、酶活性、信号传导等。
而电泳技术则是一种基于电场作用将带电粒子分离的方法，它在生命科学研究中有着广泛的应用。
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳原理是一种常用于分离和鉴定蛋白质的技术，其原理基于蛋白质在电场中的迁移速度与其分子质量成反比的关系。
现在让我们深入探讨SDS-PAGE蛋白凝胶电泳的原理和相关细节。
1. SDS-PAGE蛋白凝胶电泳的基本步骤在进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳实验时，首先需要将待测样品中的蛋白质在含有SDS（十二烷基硫酸钠）的缓冲液中进行变性处理，使得蛋白质呈线性结构并且带有负电荷。
之后，将处理过的蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶中，并施加电场使得蛋白质开始迁移。
根据蛋白质的分子质量，它们将在凝胶中以不同的速率迁移，最终实现分离。
2. SDS的作用原理SDS是一种带有负电荷的表面活性剂，它的主要作用是使得蛋白质呈线性构象，并且使得蛋白质的带电量与其分子质量成正比。
这样一来，不同分子质量的蛋白质在电场中受到的阻力相对应也会不同，从而实现蛋白质的分离。
3. 凝胶电泳的原理凝胶电泳是利用凝胶作为分离介质的电泳方法。
凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或者琼脂糖琼脂糖凝胶。
在SDS-PAGE蛋白凝胶电泳中，聚丙烯酰胺凝胶是最常用的分离介质。
它的基本原理是利用凝胶的孔隙大小来实现对蛋白质的分离，分子质量较大的蛋白质会受到较大的阻力从而迁移较慢，分子质量较小的蛋白质则会迁移得更快。
4. 电泳条件的影响在进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳实验时，电泳条件的设定对分离结果有着重要影响。
电场强度的大小、电泳时间的长短、凝胶浓度等都会影响蛋白质的迁移速度和分离效果。
总结而言，SDS-PAGE蛋白凝胶电泳原理基于蛋白质在电场中的迁移速度与其分子质量成反比的关系，通过SDS的作用使得蛋白质呈现线性构象并且带有负电荷，再利用凝胶电泳对不同分子质量的蛋白质进行分离。
SDSPAGE-原理和方法
1
样品制备
将蛋白质样品加入SDS洗涤溶液，并
凝胶制备
2
加热变性。
制备聚丙烯酰胺凝胶，并加入
TEMED和过硫酸铵。
3
电泳
将样品加载到凝胶槽中，施加电场进 行电泳分离。
SDSPAGE的实验材料和仪器
材料
SDS洗涤溶液、聚丙烯酰胺凝胶、TEMED、 过硫酸铵等。
仪器
电泳槽、电源、显色剂。
SDSPAGE的优缺点
优点
简单易行、灵敏度高、分辨率好。
缺点
只适用于单一参数（分子质量）的分离。
结论和展望
SDSPAGE作为一种常用蛋白质分离技术，具有广泛的应用前景。未来的发展 方向是提高分辨率、扩大分离范围、提高自动化程度。
SDSPAGE的数据分析和结果解 释
通过比较不同样品的蛋白条带迁移距离、形状和密度，可以判断蛋白质的分 子质量、纯度和含量。
SDSPAGE的应用领域和意义
1 生物医学研究
用于研究蛋白质的结构、功能和相互作用。
2 医学诊断
3 生物工程
用于检测蛋白质异常，如肿瘤标志物的检测。
用于蛋白质表达、纯化和检测。
SDSPAGE-原理和方法
SDSPAGE是一种常用的蛋白质分离和定量技术，利用电泳原理将蛋白质按照 分子质量大小分离出来。本节将介绍SDSPAGE的原理、步骤和方法、实验材 料和仪器、数据分析和结果解释、应用领域和意义以及其优缺点。
SDSPAGE的定义和原理
SDSPAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种电泳技术，使用聚 丙烯酰胺凝胶和SDS洗涤溶液，以分子质量为基准将蛋白质分离和定量。
sds-page蛋白质电泳的原理和基本操作流程
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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)实验原理和操作步骤实验原理：SDS—PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。
SDS是一种去垢剂,可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中.SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略.蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。
试剂和器材:试剂:1. 5x样品缓冲液(10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50％甘油，2ml 10％的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0。
9ml蒸馏水。
可在4℃保存数周,或在－20℃保存数月。
2。
凝胶贮液：在通风橱中,称取丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0。
8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。
过滤后置棕色瓶中,4℃保存，一般可放置1个月。
3。
pH8。
9分离胶缓冲液：Tris 36。
3g ，加1mol/L HCl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解，调pH8。
9，定容至100ml, 4℃保存。
4。
pH6.7浓缩胶缓冲液: Tris 5。
98g ，加1mol/L HCl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺)原液6.10%过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制）7。
pH8。
3 Tris—甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6。
0g，甘氨酸28。
8g，加蒸馏水约900ml，调pH8。
3后,用蒸馏水定容至1000ml。
置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液:称100mg考马斯亮蓝G250,溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
器材：电泳仪，电泳槽,水浴锅，摇床。
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解SDS-（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种电泳技术，用于分离蛋白质。
它是目前最常用的蛋白质分离方法之一、以下将详细介绍SDS-的原理和操作步骤。
一、原理SDS-利用凝胶电泳原理，在电场作用下，将蛋白质按照其分子量大小分离。
其中SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）是一种阴离子表面活性剂，它会使蛋白质解离成单个多聚体，并赋予了所有蛋白质相同的电荷密度，使其仅以分子量来分离。
此外，SDS还能够疏水化蛋白质，使其保持线性构象。
二、流程操作步骤1.制备凝胶：a.准备获得所需蛋白质分子量范围内的分离凝胶（通常为8-20%)和浓缩凝胶（通常为4%）。
b.根据实验需要，自制聚丙烯酰胺凝胶，或购买预铸凝胶片。
c. 使用缓冲液（常见的是Tris-HCl缓冲液）将凝胶片激活。
d.将激活的凝胶放在垂直电泳仓中，然后在最上层加入新鲜的蒽胺溶液以形成平整的上胶液面。
2.蛋白质样品处理：a. 将样品蛋白质进行还原处理，可以使用还原剂如β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）或二巯基甘油（dithiothreitol）。
b.加入相应体积的SDS缓冲液（含有SDS和甘油），将样品加热至100°C，以使其完全变性。
c.在样品中加入跟踪染色剂，常用的有溴酚蓝。
3.加载样品：a.打开电泳仓的盖子并插入试验板。
b.将样品架（通常是细长的注射器或者微量吸管）插入样品孔中，并缓慢地向内注入样品。
c.尽量确保样品的数量均匀，然后小心地将试验板放入电泳槽中。
4.电泳：a. 确保试验板完全浸没在含有缓冲液（如Tris-Glycine缓冲液）的电泳槽中。
b.调整电泳仓的参数，如电流和电压。
c.开启电源，运行电泳，直到跟踪染色剂移动到凝胶底部。
5.凝胶染色和成像：a.将凝胶从电泳槽中取出，并进行染色。
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
蛋白质-SDS胶束的特点 （1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS 胶束基本上是相同的 （3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响， 而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
（7） 照相，凝胶干燥 （8） 定量测定
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
3、电泳过程中的不正常现象 （1）“微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线形， 说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷 却不好
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
（2）“皱眉”现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护
SH基团，而得到窄的电泳带
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
③非还原的SDS处理 许多样品，如生理体液、血清或尿素，一 般只需用1%SDS在100℃煮沸3分钟，并不 需要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
②G-250 二甲花青亮蓝，蓝绿色。
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸银
（银离子）还原成金属银，以使银颗 粒沉积在蛋白带上
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
SDS-PAGE电泳实验原理及步骤
SDS-PAGE电泳实验原理及步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
SDS-PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
基本原理SDS-PAGE是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。
SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,从而消除了蛋白质分子之间电荷差异。
实验步骤(1)将蛋白质样品与5X样品缓冲液(20ul+5ul)在一个eppendorf 管中混合。
放入100℃加热5-10min，离心取上清点样。
(2)将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干。
(3)组装好玻璃板：固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。
(4)按表格1，根据要检测的蛋白的分子大小，选择相应的分离胶浓度，按表格2的配方进行配制。
配制过程要迅速，催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。
注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。
(5)向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合。
水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。
凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。
(6)按表格3配制浓缩胶。
(7)将分离胶上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳。
注意，样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。
(8)装好电泳系统，加入电极缓冲液，将样品梳拔去，上样。
上样前请确保锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果。
另外，上样过程中注射器不可过低，以防刺破胶体，也不可过高，在样下沉时会发生扩散。
为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。
(9)稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 mi n～1hr. 最后，小心的将胶剥离玻璃板，进行下一步实验。
sds-page蛋白凝胶电泳原理
sds-page蛋白凝胶电泳原理SDS-PAGE蛋白凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）是一种常用的蛋白质分析和分离技术。
本文将从原理、方法与步骤、应用以及优缺点等方面详细介绍SDS-PAGE蛋白凝胶电泳。
一、原理SDS-PAGE蛋白凝胶电泳是一种基于电泳原理的方法，主要通过蛋白质的质量和电荷来进行分离。
其原理主要包括以下几个方面：1.蛋白质的复性破坏：SDS-PAGE在凝胶中加入SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂（如巯基乙醇）可以使蛋白质发生复性破坏，其中SDS具有较强的负电性，可以使蛋白质在水溶液中带有负电荷。
同时，还原剂可以将蛋白质中的二硫键还原为巯基，从而进一步破坏其空间结构。
2.蛋白质的质量分离：SDS-PAGE的较高浓度的聚丙烯酰胺凝胶可以提供较高的分辨率，使得蛋白质根据其质量而发生迁移。
SDS为蛋白质提供了一个数量几乎相等的负电量，使得每个蛋白质分子以近似相同的速率移动。
3.蛋白质的电荷分离：由于SDS-PAGE中的凝胶含有离子，电荷可以影响蛋白质的迁移速率。
正电蛋白质受到SDS的负电荷影响而发生迁移，负电蛋白质则受到进一步迁移的影响。
因此，在电泳时，蛋白质的负电荷将决定其迁移方向。
二、方法与步骤SDS-PAGE蛋白凝胶电泳的方法与步骤可以大致分为以下几个步骤：1.制备凝胶：首先制备聚丙烯酰胺凝胶，通常使用两种浓度的聚丙烯酰胺溶液，分别称为分离凝胶和浓缩凝胶。
在凝胶中加入TEMED和过硫酸铵来引发聚合反应。
制备完分离凝胶后，将它移至电泳槽中，同时注入上缓冲液。
2.样品处理：将待测试的蛋白质样品与SDS和还原剂混合，使蛋白质变性并带上负电荷。
样品通常需要经过煮沸过程，进一步破坏蛋白质的空间结构。
3.蛋白质电泳：将样品注入凝胶孔洞中，开启电源，让电流通过凝胶，使得蛋白质在凝胶中移动。
电泳完毕后，取出凝胶并进行染色。
(完整word版)SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术.二、实验原理蛋白质是两性电解质,在一定的pH条件下解离而带电荷。
当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。
本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率.由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。
这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。
同时，在制备上层胶（浓缩胶）和下层胶（分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7-6.8，下层胶pH＝8。
9；Tris—HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。
在pH6。
8时，缓冲液中的Gly—为尾随离子,而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性,控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。
不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后,各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。
由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应,使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离.如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS），由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合,形成带负电性的蛋白质-SDS复合物；此时,蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。
(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。
在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。
由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。
蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。
基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。
二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。
分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL10%SDS溶液 4.0mL甘油 2.0mL巯基乙醇 2.0mL溴酚蓝 0.02g，混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。
sds实验过程及原理
sds实验过程及原理【本篇提要】1、SDS-PAGE实验了解与原理2、SDS-PAGE实验所用试剂或溶液3、SDS-PAGE实验步骤【分述如下】一、SDS-PAGE实验了解与原理（一）相关概念理解SDS-PAGE，即sodium dodecyl sulfate-polyarcylamide gel electrophoresis，即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
它是一种根据蛋白质分子量分离样本中蛋白质的技术。
1、SDS十二烷基硫酸钠，一种阴离子表面活性剂，SDS可使蛋白质带负电荷，并线性化为多肽。
多肽在电场作用下向阳极移动。
由于电荷相同，因此蛋白质的分离完全与它们的分子量有关。
电泳中，分子量越小的多肽移动的越快，因为它们遇到的阻力更小。
2、PA聚丙烯酰胺，多肽电泳分离的介质，就是凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶是通过使用少量的交联剂（如N，N-’亚甲基双丙烯酰胺）使单体丙烯酰胺聚合而成。
丙烯酰胺（Acrylamide）和双丙烯酰胺（Bis-acrylamide）共聚形成丙烯酰胺的直链与双丙烯酰胺的相互联结形成三维网络结构。
丙烯酰胺和双丙烯酰胺的比例决定了凝胶的孔径。
（二）实验原理二、SDS-PAGE实验所用试剂或溶液（一）电泳缓冲液电泳缓冲液的成分是Tris-Glycine(pH8.3)：SDS lg，Tris 3g，Gly 14.4g，加超纯水溶解并定容到1000mL。
4℃冰箱保存。
（电泳缓冲液含有上述提到的SDS，用于改变蛋白质电荷，促使其线性化。
）（二）制备聚丙烯酰胺凝胶的试剂1、制备上层胶（浓缩胶）上层胶的孔径较大，一般对于所有分子量的蛋白质阻滞作用相同，因此蛋白质迁移速率相同。
（1）上层胶（浓缩胶）溶液（2）上层胶（分离胶）缓冲液(1.5mol／L)Tris 6.06g，加超纯水溶解，6mol/L HCl调pH6.8，并定容到100mL。
4℃冰箱保存。
实际实验中，可以购买上层胶溶液和下层胶缓冲液。
sds-page凝胶电泳的方法
sds-page凝胶电泳的方法SDS-PAGE凝胶电泳是一种常用的蛋白质分析方法，广泛应用于生物化学、分子生物学和免疫学等领域。
本文将介绍SDS-PAGE凝胶电泳的原理、步骤及其在蛋白质分析中的应用。
一、SDS-PAGE凝胶电泳的原理SDS-PAGE凝胶电泳是一种基于蛋白质的分子量和电荷差异进行分离的方法。
其原理基于SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质的线性化和蛋白质的电荷密度。
在SDS-PAGE凝胶电泳中，首先将待分析的蛋白质样品与SDS混合，SDS能够以类似于肥皂的方式使蛋白质线性化，并赋予蛋白质一个负电荷。
这样，蛋白质在电场中迁移时，其迁移速度将仅与其分子量有关，而与其电荷无关。
二、SDS-PAGE凝胶电泳的步骤1. 制备凝胶：按照所需分辨率选择合适的凝胶百分比，常用的是8%至15%的聚丙烯酰胺凝胶。
将凝胶原液加入模具中，插入梳子，等待凝胶凝固。
2. 样品处理：将待分析的蛋白质样品与SDS样品缓冲剂混合，加热至95℃左右，使蛋白质线性化，并使其带负电荷。
3. 加载样品：将样品加载至凝胶孔中，注意不要过量加载，以避免样品溢出。
4. 进行电泳：将装有凝胶的电泳槽中加入电泳缓冲液，将电泳槽连接至电源，设定合适的电压和时间进行电泳。
5. 染色和成像：电泳结束后，取出凝胶，进行染色，常用的染色方法有银染和脱色共染方法。
然后，使用成像设备拍摄凝胶图像。
三、SDS-PAGE凝胶电泳的应用1. 分析蛋白质组成：SDS-PAGE凝胶电泳可用于分析复杂混合物中蛋白质的组成和相对含量。
通过凝胶电泳可以将不同分子量的蛋白质分离出来，并通过染色或质谱等方法进行进一步的鉴定和定量。
2. 确定蛋白质的分子量：SDS-PAGE凝胶电泳是一种常用的确定蛋白质分子量的方法。
通过与已知分子量的蛋白质标准品一同进行电泳，可以根据标准品的迁移距离与分子量的对应关系，推断待测蛋白质的分子量。
3. 检测蛋白质纯度：SDS-PAGE凝胶电泳可用于检测蛋白质样品的纯度。
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SDS-PAGE电泳的基础原理和实验步骤概述十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。
此项技术的原理，是根据检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。
在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中，SDS-PAGE更是必不可少的操作，其通常用于检测蛋白的表达情况（表达量，表达分布），以及分析目的蛋白的纯度等。
SDS-PAGE作用机理蛋白中含有很多的氨基（+）和羧基（-），不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷，为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理（上样缓冲液）。
即在样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的上缓冲液。
SDS即十二烷基磺酸钠（CH3-（CH2）10-CH2OSO3-Na+），是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。
电泳样品加入样品处理液后，经过高温处理，其目的是将SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷；另外样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程；另外样品处理液中还加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。
当样品上样并接通两极间电流后（电泳槽的上方为负极，下方为正极），在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。
样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含SDS多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。
电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8的上层，pH8.8的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。
出现了pH 不连续和胶孔径大小不连续：启动时Cl¯解离度大，Pro¯解离度居中，甘aaCOO¯解离度小，迁移顺序为（pH6.8）Cl¯>Pro¯>—COO¯。
在Cl¯与Pro¯之间和Pro¯与—COO¯之间都将出现低离子区，同时也出现高电势，高电势迫使Pro¯向Cl¯迁移，—COO¯向Pro¯迁移。
如：一个Cl¯领路，—COO¯推动，蛋白在中间，这样就起到浓缩的作用了。
在浓缩胶运动中，由于胶联度小，孔径大，Pro¯受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。
当蛋白质进入分离胶时，此时Pro¯，Cl¯，甘aa离子在pH8.8的溶液中，Cl¯完全电离而很快到达正极，甘aa电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。
由于Pro¯在电泳过程中，受到溶液离子的变化而pH值发生变化，但每一瞬间，其所带电荷数除以单位质量是不同的，所以带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就现了电荷效应。
由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。
PAGE胶的聚合原理：甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸胺的作用下聚合，形成胶，如下图：注：催化剂：过硫酸铵（AP）在隔氧的状态下，最好现配现用，使用新鲜的。
加速催化剂：TEMED，四甲基乙二胺。
催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的分离范围：1510～431212～601020～807.536～945.057～212试剂及主要器材通常在SDS-PAGE电泳实验中用到以下几种试剂：1、主要试剂∙30％凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加双蒸水至100mL。
外包锡纸，4℃冰箱保存，30天内使用。
∙分离胶缓冲液（1.5Lmol／L）:Tris18.17g，加双蒸水溶解，6mol/L HCl调pH8.8，定容100mL。
4℃冰箱保存∙浓缩胶缓冲液（0.5LLmol／L）:Tris6.06g，加水溶解，6mol/L HCl调8，并定容到100mL。
4℃冰箱保存电极缓冲液（pH8.3）：SDS lg，Tris3g，Gly14.4g，加双蒸水溶解并定容到1000mL。
4℃冰箱保存。
10％SDS，室温保存∙质量浓度10％过硫酸铵（新鲜配制）∙上样缓冲液：5Lmol／L Tris-HCl pH6.8 1.25mL，甘油2mL，10％SDS2mL，β-巯基乙醇1mL，0.1％溴酚蓝0.5mL，加蒸馏水定溶至10mL。
∙考马斯亮蓝R-250染色液（1L）：1g考马斯亮蓝R250，加入450甲醇，100mL冰醋酸∙脱色液（1L）：100mL甲醇，100mL冰醋酸∙未知分子量的蛋白质样品（1mg／mL）2、实验器材∙垂直板电泳槽∙电泳仪∙长滴管及微量加样器∙烧杯（250mL、500m1）、量筒（500mL、250m1）、培养皿（15cm´l5cm）∙枪头（1mL、200ul、10ul）∙注射器等SDS-PAGE所需溶液：A液——30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。
B液——1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs碱，溶于60mL（30mL）去离子水中，加入约3mL （1.5mL）以上的浓盐酸调节pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。
C液——1.5mol/L Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs碱，溶于60mL（30mL）去离子水中，加入约7mL （3.5mL）以上的浓盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。
D液——10％SDS：10g（2g）SDS溶于去离子水中，定容至100mL（20mL），加热至68℃助溶。
E液——10％过硫酸铵：5g（0.5g）过硫酸铵，溶于50mL（5mL）去离子水中；现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。
F液——TEMED（N-N-N`-N`－四甲基乙二胺）原液，低温保存。
聚丙烯酰胺（Acrylamide）的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。
制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择TRIS-HCL系统。
TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行。
十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。
称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺（N,N'-Methylenebisacrylamide）时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。
SDS-PAGE实验标准操作流程1.清洗玻璃板一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2.灌胶与上样玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）∙配12％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用3mL的吸管或10mL枪吸取适量的胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。
）分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置12％的分离胶和5.1％的浓缩胶。
试剂名称12%的分离胶（8块，35mL） 5.1%的浓缩胶（8块，12mL）30％凝胶贮备液/mL142分离胶缓液8.75（pH8.8）/mL浓缩胶缓冲液（pH6.8）3/mL双蒸水/mL12.25 6.910%过硫酸铵/ul175100TEMED/ul1510注：分离胶与浓缩胶的浓度计算公式：A%*Va/V总=C，A%为30％凝胶贮备液，例如，12%的分离胶：0.3*10/25=12%∙当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
∙按前面方法配5.1％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
∙用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。
（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。
若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。
）∙测完蛋白含量后，计算含50μg蛋白的溶液体积即为上样量。
取出上样样品至0.5mL离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。
（上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加20μl样品。
）上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。
∙加足够的电泳液后开始准备上样。
（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。
）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
3.电泳加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电压控制在100～200V，大约15～20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电压升到200V，电泳过程保持电压稳定。
当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2cm处即停止电泳，约0.5-1小时。
如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。
电泳。
4.染色、脱色电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.25％的考马斯亮蓝染液，染色2～4h，必要时可过夜。
弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。