超详细的Western实验步骤及结果分析
Western实验操作原理及方法 jst
蛋白免疫印迹（Western blotting）实验操作原理及方法一、实验目的：通过本实验，可以特异性的检测蛋白的表达水平。
二、实验原理：1、蛋白浓度测定：考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）存在两种不同的颜色形式：红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，结合后燃料演的有红变蓝，最大光吸收由465 nm变成595 nm。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
此反应大约2 min即可完成，并可稳定1小时。
2、SDS凝胶：丙烯酰胺（Acr）和甲叉丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵（ammonium persulfate, (NH4)2S2O8, APS）或核黄素（ribofavin, VB2）和加速剂N, N, N’,N’-四甲基乙二胺（N, N, N’,N’-ytetramethyl ethylenediamine, TEMED）的作用下，聚合成三维网状结构。
* Acr和Bis之比可以决定胶的孔径等因素。
浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶。
3、SDS-PAGE电泳：SDS是阴离子去垢剂，由于其带有大量负电荷，当与蛋白结合时，所带电荷大大超过了天然蛋白原有的负电荷，因而消除了蛋白之间原有的电荷差异，则电泳迁移率主要依赖于分子量，而与所带净电荷和形状无关。
三、实验方法及步骤：样品预处理：1、将细胞从平皿上刮下，离心后，用1 X PBS冲洗，12000rpm 1min离心，弃上清，细胞沉淀保存于-80℃。
2、把细胞沉淀取出，加M-PER或T-PER（Thermo，约为细胞体积的2~3倍），悬浮细胞。
10 mL M-PER或T-PER+50μL 200 mM Na3VO4+50μL 200 mM PMSF+1片IN（Roche，酶抑制剂复合物）3、将装有细胞悬液的Doff管固定在4℃层析柜中的脱色摇床上，max speed，剧烈摇1小时。
4、冰上，超声破碎（注意先用纯水清洗探头），AmL=35%超声10s，停顿5s，反复10次（探头不能碰到管壁，且始终保持在液面以下，尽量不要产生气泡）5、重新固定在脱色摇床上，4℃，1 h，max speed。
最详细的Western_Blot过程步骤详解
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步调及问题解答)之樊仲川亿创作Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产品，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步调五、一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采取的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标识表记标帜的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能坚持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标识表记标帜的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现经常使用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操纵也比较简单，原理如下（二抗用HRP标识表记标帜）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保管。
严格核实PH不得超出7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超出两个月，隔几个月须重新配制。
western实验步骤
制备SDS-PAGE 凝胶(1) 将灌胶玻璃板洗净，晾干固定，确定灌制分离胶液面标志线（距样品梳子底部约0.5-1.0cm 处）。
(2) 配制10%分离胶8ml（见下表），快速灌入凝胶玻璃槽中，使其液面至标志线位置（避免产生气泡）。
(3) 立即用去离子水覆盖胶面（隔绝空气，有助于凝胶聚合），室温放置约40min至分离胶凝固。
(4) 配制5%浓缩胶4ml（见下表）。
(5) 倒掉去离子水覆盖液，并用吸水纸吸掉残留的液体。
将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5%浓缩胶液（注意避免产生气泡），插入样品梳，室温凝胶约40 分钟。
(6) 轻轻拔去梳子，将玻璃夹板“凹”面贴紧电泳槽，两侧用夹子很好的固定在电泳槽上。
样品变性及电泳(1) 由-80℃冰箱取出提取的组织总蛋白样品，立即插入冰中（减少蛋白降解）待其融化。
(2) 根据蛋白定量结果，加入相应体积的总蛋白样品与5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液, 轻轻混合，95℃变性10分钟，立即插入冰中待用。
(3) 将样品轻轻加至凝胶孔中，电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80V 使样品通过浓缩胶与分离胶（电压约8v/cm）。
电泳使染料至分离胶适当位置，结束电泳。
3.4 凝胶转膜及其检测凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。
用于Western 印迹法的固相支持物有多种，本实验采用PVDF膜作为固相支持物。
本实验采用湿转的转膜方式。
(1) PVDF膜的预处理：先置于100%甲醇中浸泡2-3min，水、电转液依次漂洗2min×2次，置于电转液中备用；(2) 剪裁与胶同样大小的6 层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用。
(3) 取下电泳板，将其平置（使“凹”面玻璃板在下），小心取出夹板中的垫片及去掉上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用电转液漂洗一次。
(4) 将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为海绵垫片→3 层滤纸→样品胶→PVDF膜→三层滤纸（注意：排除气泡）→海绵垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中。
westernblot实验详细步骤(1)
Western Blot实验技术一、制胶SDS-PAGE分离胶配方表1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。
3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。
二、上样1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。
2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。
3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。
4、上样时从左到右依次上样。
5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。
6、要预留Marker的上样孔。
三、电泳四、转膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
（转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。
）1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。
需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。
3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。
否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。
三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白）转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。
装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。
装置运行时需冰浴。
）五、封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。
封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。
Western Blot实验(蛋白质印迹法)
时间：2016-05-07
一：蛋白定量（实验前处理）
• 组织：到手的组织状态：冰袋快递：组织腐烂，蛋白含量减少 干冰快递：基本无影响 甲醛处理：石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒 需用匀浆器，液氮等方法加入1*PBS充分研磨 裂解液量：组织（g）：裂解液（ml）=1:10 细胞：一般为细胞悬液实验前需确定细胞大概浓度 裂解液量： 107数量细胞加入1ml裂解液
五：封闭（过程）
• 丽春红染色漂洗完成后。 • 清洗干净的膜放入盛有5%BSA的容器中，室温 封闭60-90min，或者4度过夜。
• 5%BSA：秤取2gBSA
加40ml 1xPBS(或TBST)
六：一抗孵育（查询抗体）
决定二抗属性 条带大小
适用实验
一抗稀释比例
六：一抗孵育（过程）
• 封闭完成前，参照说明书将一抗用5%BSA稀释到足够实验 需求的量（无特殊要求，一抗稀释液用封闭液）。 • 封闭完成后，从膜上剪下宽度为1.5cm左右相应蛋白大小 条带，倒掉封闭液，加入稀释好的一抗溶液，摇床上平缓 摇动，室温孵育120min或4℃孵育过夜。 • 一抗孵育完成后，倒掉一抗溶液（有回收要求的抗体，回 收一抗溶液4℃保存），用TBST漂洗膜4次，第一次漂洗 主要漂洗BSA，冲刷后便可倒去，TBST可以加至膜漂浮在 液体中，每次10min。
• 分离胶
分离胶浓度 试剂 6% 分子量（kDa) 去离子水（ml） 30％丙烯酰胺（ml） 1.5MTris－HCl （PH8.8）（ml） 10％SDS（ml） 10％AP（ml） TEMED（ul） 总体积（ml） ≥94 5.3 2 2.5 0.1 0.1 0.008 8% 70-94 4.6 2.7 2.5 0.1 0.1 0.006 10% 55-70 4.0 3.3 2.5 0.1 0.1 0.004 12% 20-55 3.3 4.0 2.5 0.1 0.1 0.004 15% 10-20 2.3 5.0 2.5 0.1 0.1 0.004 18% ≤10 1.3 6.0 2.5 0.1 0.1 0.004
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。
下面将详细介绍WB实验的具体步骤。
1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。
使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。
再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。
2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。
3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。
电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。
电泳结束后，将凝胶转移到膜上。
4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。
5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。
常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。
6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。
一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。
7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。
8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。
10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。
最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。
11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。
需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。
同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。
超详细的Western实验步骤及结果分析
超详细的Western实验步骤及结果分析Western实验步骤1. 电泳(Electrophoresis)（1）SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。
一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。
配胶步骤：1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。
2.按比例配分离胶（8ml-10ml）3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。
（如果今日不上样可以放入4°C冰箱）注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。
3.12000r离心5分钟。
（3）上样与电泳1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。
3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳）注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。
Western Blot实验步骤及关键分析
【分享】个人整理Western Blot！！！1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL 混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH太低时，聚合反应受到抑制。
AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。
PH8.39、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS(可不加)，200ml 甲醇(临用前加)，加水至总量1L。
Western-Blot 操作流程及个人心得体会
Western-Blot 操作流程及个人心得体会（二）作者：未知时间：2010-5-25 10:26:33Western操作步骤（一）蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2~7.3）。
平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。
3. 按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合）4. 每瓶细胞加400 μl 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）6. 于4℃下12000rpm 离心5min。
（提前开离心机预冷）7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。
（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液，按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。
本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强）（2）组织中总蛋白的提取：1. 将少量组织块置于1~2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。
然后置于冰上。
3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
Western实验步骤
Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
western试验步骤及注意事项
W estern实验步骤1．制胶及上样：（1）配制12%SDS-PAGE分离胶，混匀后注入边条厚度为2mm的两块洁净玻璃板间，其上加一薄层异丙醇，室温下静置至凝固。
（2）待分离胶完全聚合后，倾去其上的水层，以吸水纸吸净残余液体，插入加样梳，缓缓加入浓缩胶，使其充满加样梳间的空隙，室温下静置。
待胶完全聚合。
（3）将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽加入电泳缓冲液。
（4）小心拔去加样梳，使加样孔竖直，以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。
（5）分别取50µg蛋白量的细胞总蛋白样品及蛋白质分子量Marker，按4：1体积比加入5⨯样品缓冲液，以1⨯样品缓冲液？配平上样体积（总体积20µ1）后，于沸水浴中煮3min使蛋白变性。
（6）将处理好的样品按照预定的顺序加入分离胶的上样孔中。
2．电泳（1）接通凝胶电泳仪的电源，初始电压70V。
（约30分钟）（2）溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至160V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。
（约60分钟）3．转膜（1）从玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中。
（2）取与胶同样大小的硝酸纤维素膜，以95%乙醇浸泡5秒钟后浸泡于转移缓冲液5分钟以上待用。
（3）按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。
（4）将转移夹放入转移槽，膜在正极、胶在负极，接冷却循环水，90V稳压转移2小时。
4．染色（1）将硝酸纤维素浸入丽春红使用液中，振摇染色5-10min。
（2）蛋白质条带出现后，用去离子水洗去硝酸纤维膜上的丽春红底色。
（3）按照蛋白质分子量Marker指示的位置剪下目的条带所在的硝酸纤维素膜。
5．封闭把硝酸纤维素膜浸入5%脱脂奶粉，室温摇动2小时。
6．洗膜与杂交（1）以T-TBS洗膜，10分钟⨯ 3次。
（2）第一抗体封闭：SPARC单抗以T-TBS 1：200稀释，按0.1ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，4℃振摇过夜。
Western Blot(个人版)分析
Western Blot 实验方法一蛋白提取1、切取组织，置于已经用记号笔标记好的EP管底，称重（mg）插入冰盒中，注意不同样品间所用剪刀、刀片、镊子等要擦拭干净。
2、配置裂解液：980ulRiPA+10ul10%PMSF+10ul混匀机混匀。
3、每EP管中加裂解液(10ul/1mg)，超声（time --pulse--AMPL- -start--O）5s停5s循环1min ,振幅25%（AMPL参数）,再裂解30min 。
4、于40C冷冻离心机中预冷15min，1200r/min.将裂解后的组织液离心15min，取上清即为所提蛋白，至于一个试管内，用酶标仪测浓度，再高温变性，再上样，多余的试剂置-80℃保存。
5、用玻璃小烧杯配制定量用的试剂：（2mlH2O+500ul考马斯亮蓝）+36ulH2O+4ul 样品，另加一个标准品BSA(10ul/ml)对照组，一个空白对照组。
6、(4倍)上样缓冲液稀释成（1倍），即:30ul上清液+10ul(4倍)上样缓冲液（红色的，购买的），震荡混合+离心，高温振荡机中变性，950C，5min，注意使离心液全部流于底部，准备跑电泳。
7、测595nm吸光度，打开盖预热30min，每次都将空白校正0，读取标准品对照组，样品组的吸光度，尽快。
比色皿水洗+酒精洗。
8、建Excel：（一）Cx=Ax/A标。
C标（C标=10ug/ml ,由30ul稀释至40ul, A标已经知道的）（二）一般上样量为：30ug, 故: 30ug上样量/(0.75Cx)=V上样（ml）由（一）（二），得：V上样=A标/Ax .4二配胶1、提前配板：洗板，吹干，对齐，夹紧（向下压），配分离胶（两块板10ml），灌胶，压水，观察是否漏液，出现分界面，配浓缩胶（两块板4ml），若温度太低不易凝，可将分离胶中10%APS,TEMED同时加倍促凝.将配胶用烧杯洗净干燥，配胶：10％分离胶5％浓缩胶10ml(两快板) 15ml(三快板) 4ml (l两块板) 6ml(三块板) H2O 4.0ml 5.9ml 2.7ml 4.1 ml 30％丙稀酰胺 3.3ml 5ml 670ul 1.0Tris-HCL 2.5ml（1.5M，Ph8.8）3.8ml 0.50ml（1.0M，Ph6.8）0.75ml 10％SDS 100μl 150ul 40μl60ul10％APS（聚合剂，现配，灌胶前加入）100μl 150ul 40μl60ul TEMED（加速剂，灌胶前加入）4μl 6ul 4μl6ul2、根据板子数计算所需胶的体积数，根据比例配制胶液，为铺胶平整下层胶铺好后立即UP水封，待胶干后倒去上层UP水并用滤纸吸干，按比例配制浓缩胶（积压胶），最后上梳子（注意孔数、厚度与玻璃板搭配）；补液。
WESTERN详细实验步骤
前期准备物品准备：平皿、眼科剪、小镊子、匀浆器、研磨器、枪头（10ul、100ul、1000ul）、EP管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（提蛋白的所有操作均在冰上）、超纯水、脱脂奶粉、热水/水浴缸。
配液准备：PBS液：PBS 1袋，2000ml超纯水。
（最好加热促溶，并提前消毒，4℃过夜备用）TBST液（洗膜液）：PBS液：Tween20=1000:1电泳缓冲液：Tris base 3.01g，甘氨酸 18.77g，SDS 1g，超纯水1000ml。
转膜液（1L）：Tris base 3.03g，甘氨酸 14.4g，超纯水 800ml，甲醇200ml。
封闭牛奶：脱脂牛奶 5g，TBST 100ml。
丽春红：考马斯亮蓝：化学发光底物（1ml）：A液、B液各0.5ml。
（B液需避光保存）SDS-PAGE 分离胶（一般选8%）：10%SDS用前先加热溶解；AP配成10%（1mlAP+10ml超纯水）分离浓缩胶试剂8% 10% 12% 15% 18% 20% 8% 10% 12% 15% 18% 20% H20 ml 4.63 4 3.3 2.3 1.3 0.63 6.9 5.9 4.9 3.4 1.9 0.930%丙烯酰胺2.673.3 4 5 6 6.67 4 5 6 7.5 9 101.5MTRIS-HCL(ph8.8)2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.53.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.810%SDS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 AP 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15TEMED 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul总体积（ML ）10ml 15mlSDS-PAGE 浓缩胶：操作步骤肝组织蛋白的提取准备物品：PBS （提前消毒，4℃过夜备用），平皿，眼科剪，小镊子，匀浆器，枪头，EP 管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（所有操作试剂浓度5%H20 ml 2 3 4 6 30%丙烯酰胺 0.5 0.75 1 1.5 1.5MTRIS-HCL(ph8.8)0.5 0.75 1 1.5 10%SDS 40 60 80 120 AP 30 45 60 90 TEMED 4ul 6ul 8ul 12ul 总体积（ML ）3ml4.5ml6ml9ml均在冰上）1、取出肝组织块于平皿中，加入PBS漂洗，切下约黄豆大小的肝组织放入手动匀浆器中，在冰上迅速碾磨直至呈现云雾状；2、加入组织裂解液约500ul（裂解液:PMSF=100:1），冰上作用20～30min；3、吸取组织液到已高压灭菌的EP管中，4℃离心，12000rpm×15min；4、取出EP管放在冰盒内，仔细吸取上清，取2ul的上清用于蛋白浓度的测定；5、剩余上清，按蛋白：5xbuffer=4:1的比例加入5xbuffer,煮沸10min；6、瞬时离心，放入-20℃冰箱冻存备用。
Westernblot实验步骤详尽版
Westernblot实验步骤详尽版Western bolt 实验步骤详尽版蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳实验目的：分离目的蛋白实验仪器：移液枪，玻璃瓶，胶模，垂直板电泳槽，电泳仪，水浴锅，通风橱，染色和脱色用器皿实验材料：ddH2O，30%丙烯酰胺溶液（Acrylamide-Bisacrylamide 29：1），1.5M Tris-HCl，0.5M Tris-HCl，10%SDS，10%APS，TEMED，1*蛋白上样缓冲液，5*蛋白上样缓冲液，考马斯亮蓝R250，0.2M KCl溶液，欲染蛋白marker，1*SDS-PAGE电泳缓冲液实验步骤：1.安装制胶模具。
2.调制5ml 12%的分离胶，立即灌注至模具高度的70%（绿杠下缘）。
5ml 12%分离胶的配方：1.8ml ddH2O，2.0ml丙烯酰胺溶液，1.3ml 1.5M的Tris-HCl缓冲液，0.05ml 10%SDS，0.05ml 10%APS，0.002ml TEMED。
3.加一层ddH2O，约30分钟后聚合（胶凝固），胶层和水层可见折光界面。
4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干。
5.调制1ml 5%浓缩胶，立即灌注，插入梳子。
静置。
1ml 5%浓缩胶配方：0.55mlddH2O，0.17ml丙烯酰胺溶液，0.26ml 0.5M的Tris-HCl缓冲液，0.01ml 10%SDS，0.01ml 10%APS，0.001mlTEMED。
6.胶凝后装配垂直板电泳槽，向电泳仪倒入1*SDS-PAGE电泳缓冲液，内槽倒满，外槽倒至一半高度。
7.取16μl蛋白样品与4μl的5*蛋白上样缓冲液混合，水浴锅内煮沸5分钟。
取6μl蛋白marker与6μl 1*蛋白上样缓冲液混合。
8.加样电泳，每孔加样12μl。
电泳参数为：70V 15分钟左右，150V 30分钟左右。
（时间可以调整，以欲染Marker各条带清晰为准）9.卸下玻板，剥离凝胶放在盛有转膜缓冲液的器皿内，切下目的蛋白所在区域的凝胶，注意保留欲染Marker，且最好保留多条欲染Marker条带（因此电泳时间也不要太长，让Marker紧凑一些）。
westernblot实验报告
westernblot实验报告西方印迹（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本文将介绍Western Blot实验的原理、步骤以及其在科研中的应用。
一、实验原理Western Blot是一种通过将蛋白质分离、转移、固定和检测的技术。
首先，将待检测的蛋白质样品经过电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接下来，将膜固定并与特定抗体反应，以检测目标蛋白质的存在和表达水平。
二、实验步骤1. 样品制备：将待检测的蛋白质样品加入蛋白负荷缓冲液，经过煮沸和离心处理，使样品变性并去除杂质。
2. 凝胶电泳：将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，通电使蛋白质在凝胶中按照大小被分离。
3. 转印：将凝胶中的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通过电流使蛋白质迁移。
4. 固定膜：用甲醛等化学物质固定膜上的蛋白质，以保持其位置和结构。
5. 抗体反应：将特异性抗体加入到膜上，与目标蛋白质结合形成特异性免疫复合物。
6. 信号检测：通过添加酶标记的二抗或荧光标记的二抗，使免疫复合物发出可检测的信号。
7. 结果分析：使用成像设备或荧光显微镜观察和记录蛋白质的表达水平。
三、应用领域Western Blot技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，帮助科研人员了解蛋白质的功能和调控机制。
其次，Western Blot还可以用于检测特定蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化等，以研究这些修饰对蛋白质功能的影响。
此外，Western Blot还可以用于检测蛋白质的亚细胞定位，研究蛋白质在细胞中的分布情况。
Western Blot技术的优点在于其高灵敏度和特异性。
通过选择合适的抗体，可以实现对特定蛋白质的检测和定量。
此外，Western Blot还可以同时检测多个蛋白质，从而提高实验效率。
然而，Western Blot也存在一些局限性。
首先，由于其操作步骤较多，需要较长的实验时间。
western实验步骤
western实验步骤Western实验步骤西方实验法（Western blotting）是一种常用的蛋白质分析技术，可以用来检测目标蛋白在复杂混合物中的存在以及其相对丰度。
本文将介绍Western实验的步骤。
1. 样品制备需要从细胞或组织中提取蛋白质。
可以使用细胞裂解液或蛋白质提取缓冲液来裂解细胞，并加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。
然后，使用离心等方法将细胞碎片与其他细胞组分分离。
最后，将得到的蛋白质溶液进行浓缩和纯化，以获得高质量的蛋白样品。
2. SDS-PAGE电泳将样品中的蛋白质按照其分子量大小通过SDS-PAGE电泳进行分离。
首先，将蛋白质样品与Laemmli缓冲液混合，并在加热后进行电泳。
电泳时，将样品注入凝胶孔中，并在电场作用下进行分离。
蛋白质在凝胶中的移动速度受到其分子量的影响，较小的蛋白质迁移得更远。
电泳结束后，用染色剂染色来可视化蛋白带。
3. 转膜将电泳后的蛋白质从凝胶中转移到膜上，以便进行后续的免疫检测。
通常使用半干法或湿法转膜的方法。
在半干法中，将电泳片与膜和吸收纸堆叠在一起，用电流将蛋白质转移到膜上。
在湿法中，将电泳片和膜分别浸泡在缓冲液中，并通过电流进行转膜。
转膜完成后，可以通过Ponceau染色来验证转膜效果。
4. 阻断和抗体处理为了减少非特异性结合，需要在膜上进行阻断处理。
常用的阻断剂包括非脂类干乳或BSA。
将膜浸泡在阻断液中，以阻断未结合的蛋白质结合位点。
然后，将膜与目标蛋白特异性的一抗进行孵育。
一抗的选择应根据实验的目的和样品的特点来确定。
将膜与抗体孵育一段时间后，用缓冲液洗涤膜以去除未结合的一抗。
5. 二抗检测在处理完一抗后，需要使用与一抗来源物种不同的二抗来检测目标蛋白的存在。
二抗一般是与酶或荧光标记结合的抗体。
将膜与二抗进行孵育，并再次用缓冲液洗涤膜以去除未结合的二抗。
然后，使用适当的检测方法来可视化目标蛋白。
6. 结果分析根据实验目的和所用的检测方法，可以使用化学发光、荧光成像或酶标记等技术来检测和量化目标蛋白的存在。
Western印迹法原理、操作步骤及应用
Western印迹法的原理及应用一、原理免疫印迹法（Western印迹法）是将经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或放射性核素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
典型的印迹实验包括三个步骤：①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性、非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。
免疫印迹法克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。
二、材料Western印迹法所需材料包括SDS-PAGE试剂，硝酸纤维素薄膜，匀浆缓冲液，转膜缓冲液，膜染色液，显色液，酶标二抗及其底物等。
三、操作步骤（一）样品制备培养细胞及组织样品加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5～1分钟。
细菌诱导表达的原核细胞，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞。
然后4℃，13 000g离心15分钟，取上清液作为样品。
（二）SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前对蛋白质进行分离、纯度鉴定及分子量测定的主要方法之一。
十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，可与蛋白质结合，使蛋白质变性并带上大量负电荷。
SDS-PAGE是最常用的凝胶电泳技术。
它通常采用不连续电泳系统，即用上层胶（成层胶）和下层胶（分离胶）两种不同浓度的凝胶灌制凝胶板。
SDS-PAGE通过其电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。
抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
蛋白质的Western印迹分析
蛋白质的Western印迹分析一、实验注意事项：1、本实验所有操作避免用手直接接触PVDF膜，同时避免折划PVDF膜；2、实验过程中，要一直保持PVDF膜的湿润状态；二、实验流程1．蛋白质电泳：操作流程及注意事项参见《蛋白质的SDS－PAGE凝胶电泳》；2．SDS－PAGE凝胶转膜：1)将蛋白胶放于玻璃板上，测量大小，剪取相同大小的PVDF膜，做好标记，将膜放于100％甲醇内浸润超过10秒；2)剪取相同大小的六块滤纸，三张一份，与胶和PVDF膜放于转膜缓冲液内平衡；3)在转膜上将三张一份的滤纸放于最底层，依次放上蛋白胶、PVDF膜、另外三张滤纸，对齐用玻璃棒赶去所有气泡；根据目的蛋白大小凝胶浓度选择合适电流和时间恒流转膜(一般一块膜75mA,时间2hr)；3．蛋白质的免疫检测：1）在平皿内加入含5％脱脂奶粉的10ml PBS-T(或TBS-T)，脱色摇床摇动将膜封闭2-3hr；2）加入一抗稀释液10ml (含2.5％脱脂奶粉PBS-T)，一抗的稀释比例取决于所用抗体的效价和转到膜上目的蛋白的量，室温反应2小时或者4度过夜；3）大体积（约20ml）PBS-T洗膜3×5分钟；4）加入稀释好的二抗(含2.5％脱脂奶粉TBS-T)5）20 ml TBS-T漂洗3×10分钟；7）将膜放于碱性磷酸酶反应buffer内摇动平衡2分钟8）在一小培养皿中依次加入10 ml碱性磷酸酶反应Buffer、66ul NBT 、33ul BCIP混匀将膜放入，避光反应，并随时检测膜的颜色变化；9）目的条带出现后，大量自来水洗终止反应（或在50ml PBS-T内加入200ul0.5 mol/L EDTA，用之终止效果更佳），照相保存；三、实验所需试剂：1．转移缓冲液1L：39mM甘氨酸：2.9g48mM Tris：5.8g0.037%SDS：0.37g20%甲醇：200ml2．碱性磷酸酶缓冲液100ml：100mM NaCl5mM MgCl2100mM Tris-Cl pH9.53、PBS-T 1L pH 7.5：1M 磷酸二氢钠31.6ml1M 磷酸氢二钠68.4mlTween 20 0.1% 1ml水900ml，调pH后定容1L4、TBS-T 1L pH 7.6：Tris 2.42gNacl 8gTween 20 1ml水900ml，调pH后定容1L；5、封闭液100ml：100ml TBS-T内加入5克脱脂奶粉6、一抗稀释液100ml ：100ml PBS-T内加入3-5克脱脂奶粉7、二抗稀释液100ml ：100ml TBS-T内加入3-5克脱脂奶粉。
western试验步骤及注意事项
western试验步骤及注意事项W estern实验步骤1．制胶及上样：（1）配制12%SDS-PAGE分离胶，混匀后注入边条厚度为2mm 的两块洁净玻璃板间，其上加一薄层异丙醇，室温下静置至凝固。
（2）待分离胶完全聚合后，倾去其上的水层，以吸水纸吸净残余液体，插入加样梳，缓缓加入浓缩胶，使其充满加样梳间的空隙，室温下静置。
待胶完全聚合。
（3）将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽加入电泳缓冲液。
（4）小心拔去加样梳，使加样孔竖直，以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。
（5）分别取50μg蛋白量的细胞总蛋白样品及蛋白质分子量Marker，按4：1体积比加入5?样品缓冲液，以1?样品缓冲液？配平上样体积（总体积20μ1）后，于沸水浴中煮3min使蛋白变性。
（6）将处理好的样品按照预定的顺序加入分离胶的上样孔中。
2．电泳（1）接通凝胶电泳仪的电源，初始电压70V。
（约30分钟）（2）溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至160V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。
（约60分钟）3．转膜（1）从玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中。
（2）取与胶同样大小的硝酸纤维素膜，以95%乙醇浸泡5秒钟后浸泡于转移缓冲液5分钟以上待用。
（3）按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。
（4）将转移夹放入转移槽，膜在正极、胶在负极，接冷却循环水，90V稳压转移2小时。
4．染色（1）将硝酸纤维素浸入丽春红使用液中，振摇染色5-10min。
（2）蛋白质条带出现后，用去离子水洗去硝酸纤维膜上的丽春红底色。
（3）按照蛋白质分子量Marker指示的位置剪下目的条带所在的硝酸纤维素膜。
5．封闭把硝酸纤维素膜浸入5%脱脂奶粉，室温摇动2小时。
6．洗膜与杂交（1）以T-TBS洗膜，10分钟? 3次。
（2）第一抗体封闭：SPARC单抗以T-TBS 1：200稀释，按0.1ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，4℃振摇过夜。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Western实验步骤
1. 电泳(Electrophoresis)
（1）SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。
一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。
配胶步骤：
1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。
2.按比例配分离胶（8ml-10ml）
3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面
4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。
（如果今日不上样可以放入4°C冰箱）
注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理
1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加 3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀
2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。
3.12000r离心5分钟。
（3）上样与电泳
1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右
2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。
3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳）
注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。
电泳常出现的现象：
a.︶条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。
b.︵条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
c.拖尾：样品溶解不好。
d.纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。
E.条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。
f.条带两边扩散：加样量过多。
3.转膜(Transfer)
1.物品准备，甲醇，转膜缓冲液，滤纸，转膜槽，玻璃皿3个，制冰。
2.取下胶板，用专门的板将玻璃板分离（务必不要将胶弄破，动作轻些，从下面和上面分离玻璃板），切适合大小的胶（不要切掉MAKER）。
3.用专门的板将胶转入事先放有转膜缓冲液的皿中，记录胶的顺序，剪与胶同等大小的滤纸和转膜纸PVDF膜，PVDF膜要放入甲醇中浸15秒（一般1-2分钟），胶要切角做标记（不要切到maker）,一般一个切三个角，一个切一个角，记录顺序
4.铺膜，PVDF膜铺在胶上，在PVDF膜上铺三层滤纸，然后胶的对侧面铺三层滤纸即可（滤纸要大于等PVDF膜，PVDF膜要大于等胶），赶尽气饱。
5.再将铺好的膜胶滤纸，转入转膜夹中，有PVDF膜这面放在正极侧（即无色透明夹这面），再将夹子放入转膜槽里（电极不要放错，蛋白质带负电的）
6.转膜，槽放入冰中，槽内放冰槽，设定转膜电流为300-400mA，电压120伏，转膜时间为40分钟（30-60分钟）。
注意：实验选用PVDF膜但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取，膜不要碰到其他地方特别是手不要碰到膜；动作要轻；赶尽气饱；正负极不要弄错；记录胶的顺序；
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，电压120伏，转膜时间为30-60分钟。
也可以在15-20mA转膜过夜。
具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。
也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4．封闭
1.转膜完毕后，将蛋白膜放入，TBS漂洗1-2分钟
2.再用TBST封闭，在摇床上摇1小时，装入薄膜内
配制TBS:1MtriHCL (PH8.0) 10ML,1M NaCL 150ml,dd水 840ml；
TBST(MILLK)：5%millk（脱脂奶粉）,0.1%tween20,TBS
注意：从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景；对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
1.切所需蛋白条带后，参考一抗的说明书，按照适当比例用TBST（有奶粉的）稀释一抗。
放置在冰上
2.有薄膜将所需条带封住，立即加入稀释好的一抗后，封口，4℃孵育过夜。
注意：其实室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。
或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。
6.二抗孵育(antibody incubation)
1.回收一抗。
2.取出膜，放入TBST(没MILLK)中摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟（5-10分钟），共洗涤3次
注意：如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数，一般洗膜后以MAKER条带背景变淡一些为好。
3.参考二抗的说明书，按照适当比例用TBST(MILLK)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。
二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗
4.立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗。
5取出膜，放入TBST(没MILLK)中摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟（5-10分钟），共洗涤3次，如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数
7.显色和曝光
1.物品准备：显色试剂A、B(A;B=1ml:25ul)，显影液，定影液，保鲜膜，胶片
2.倒掉脱洗液，在曝光盒里铺好保鲜膜；再在皿里将条带铺好（蛋白面朝上），关灯暗室中配好的显色液，加入铺好的膜上（要完全覆盖膜）
3.将蛋白膜铺好在保鲜膜上（要脱掉些显色液），盖上保鲜膜，剪适当大小胶片，曝光，曝光时间分别是15秒、30秒、60、秒
4.曝光后将膜放入显影液中，显影片刻（看到条带出现即可），放入定影液中定影片刻；
5.曝光结束后，清水洗胶片，晾干
8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
如果蛋白膜需要再次利用可以使用strippingbuffer处理蛋白膜。
1.将蛋白膜加入stripping buffer 中50°C摇30分钟
2.倒掉stripping buffer,加入新的stripping buffer在25°C（室温即可）摇10分钟
3.再TBST(没有奶粉)摇洗10分钟，共2次
4.封闭，同上4封闭。