western步骤

1、组织蛋白的提取

取上述用于Mn含量测定中另外4只大鼠剩余的纹状体组织置于2ml EP管中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，加400μl单去污剂裂解液（含PMSF）于超声器中进行裂解，然后置于冰上。几分钟后再超声数秒再置于冰上，要重复几次使组织尽量碾碎。裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，去上清分装于新的离心管中并置于-20℃保存。

2、蛋白含量的测定

（1）制作标准曲线

从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。取96孔板，按下表加入各种试剂。混匀后，室温放置2min。在酶标仪上比色分析，测量OD值。

表2，标准曲线的制备

0μg 2.5μg 5.0μg10.0μg20.0μg40.0μg 1mg/mlBSA - 2.5μl 5.0μl10.0μl20.0μl40.0μl

0.15mol/L NaCl 100μl97.5μl95.0μl90.0μl80.0μl60.0μl G250考马斯亮蓝溶液1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

（2）检测样品蛋白含量

①取96孔板，实验用各孔加入4℃存储的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min，后即可用于测蛋白。

②其中一孔加0.15molNaCl溶液100μl做空白对照，其余个孔加95μl

0.15molNaCl溶液和5μl 0.15molNaCl待测蛋白样品，混匀后静置2min，在酶标仪上比色分析，在595nm处测量OD值。

③绘制标准曲线，测得的结果是5μl样品含的蛋白量。

3、SDS-PAGE电泳

（1）干净玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直置于架上准备灌胶。

（2）制备分离胶并灌胶：配置8ml 10%分离胶，3.2ml ddH2O，2.0ml 1.5mol/L Tris·HCl分离胶缓冲液（pH8.8），2.72ml 30%丙烯酰胺溶液，80μl 10%SDS，80μl 10%APS（过硫酸铵），16μl TEMED。

将分离胶加入玻璃板的4/5（梳子下至少1cm）然后胶上加一层水液封。当水和胶之间有一条折射线时说明胶已凝了，再等3min，使胶充分凝固，就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

（3）制备浓缩胶并灌胶：配置4ml 5%浓缩胶，2.28ml ddH2O，1.0ml 0.5mol/L Tris·HCl浓缩胶缓冲液（pH6.8），0.68ml 30%丙烯酰胺溶液，40μl 10%SDS，20μl 10%APS，8μl TEMED。

将玻璃板剩余空间用5%的浓缩胶灌满后将梳子插入浓缩胶中，待凝固。

（4）浓缩胶聚合的同时，将40μg蛋白样品与加样缓冲液混匀，100℃加热3-5min蛋白变性。

（5）浓缩胶聚合完成后，加入电泳缓冲液，依序上样及蛋白质分子量标准品。

（6）电泳：浓缩胶80V，进入分离胶之后调为120V，持续电泳直至染料到达分离胶底部，断开电源，结束电泳后，剥胶。

4、湿法免疫印迹杂交

（1）转膜前，将PVDF膜用适量甲醇浸泡约1min至半透明，用ddH2O反复冲洗，然后将PVDF膜和滤纸用电转移缓冲液浸泡30min。

（2）凝胶-PVDF膜“三明治”操作：将凝胶下垫上滤纸和海绵，然后将PVDF 膜平铺于凝胶上，盖上同样滤纸和海绵，出去各层间气泡。然后放入电转移槽中，凝胶面向阴极（黑色），PVDF膜面向阳极（红色），电流170mA转移2h。

（3）洗膜：在摇床上，PVDF膜在TBST中洗5min，2次，在TBS中5min，洗1次。

（4）封闭：将PVDF膜放入封闭液（5%脱脂奶粉，TBST配制）中进行封闭。

（5）如上法洗膜，加入一抗（GS 1:300, GLAST 1:500, GLT-1 1:300, β-actin 1:500），4℃孵育过夜。

（6）如上法洗膜，加入二抗（1:5000 稀释），37℃孵育2h。

（7）如上法洗膜，将上述PVDF膜置于ECL显影液，采集图像，并分析目的条带，分析各产物的OD（ODx）值，实验结果以各组光密度值和对照组光密度值相比（OD x/ODβ-actin）。

1、细胞蛋白的提取

每个剂量设3个平行样，倒掉培养液，用PBS冲洗细胞3次，弃去洗液，每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液（1ml裂解液含10μl PMSF），于冰上裂解30min，收集裂解的细胞至于1.5ml离心管中，4℃，12000rpm，离心5min，收集上清并保存。

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羊抗GLAST单克隆抗体美国SantaCruz公司

羊抗GLT-1单克隆抗体美国SantaCruz公司

鼠抗β-Actin多克隆抗体美国SantaCruz公司

抗羊IgG-HRP 美国SantaCruz公司

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