Western超详细实验步骤教学内容
western步骤
1、组织蛋白的提取取上述用于Mn含量测定中另外4只大鼠剩余的纹状体组织置于2ml EP管中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，加400μl单去污剂裂解液（含PMSF）于超声器中进行裂解，然后置于冰上。
几分钟后再超声数秒再置于冰上，要重复几次使组织尽量碾碎。
裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，去上清分装于新的离心管中并置于-20℃保存。
2、蛋白含量的测定（1）制作标准曲线从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
取96孔板，按下表加入各种试剂。
混匀后，室温放置2min。
在酶标仪上比色分析，测量OD值。
表2，标准曲线的制备0μg 2.5μg 5.0μg10.0μg20.0μg40.0μg 1mg/mlBSA - 2.5μl 5.0μl10.0μl20.0μl40.0μl0.15mol/L NaCl 100μl97.5μl95.0μl90.0μl80.0μl60.0μl G250考马斯亮蓝溶液1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml（2）检测样品蛋白含量①取96孔板，实验用各孔加入4℃存储的考马斯亮蓝溶液1ml。
室温放置30min，后即可用于测蛋白。
②其中一孔加0.15molNaCl溶液100μl做空白对照，其余个孔加95μl0.15molNaCl溶液和5μl 0.15molNaCl待测蛋白样品，混匀后静置2min，在酶标仪上比色分析，在595nm处测量OD值。
③绘制标准曲线，测得的结果是5μl样品含的蛋白量。
3、SDS-PAGE电泳（1）干净玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直置于架上准备灌胶。
（2）制备分离胶并灌胶：配置8ml 10%分离胶，3.2ml ddH2O，2.0ml 1.5mol/L Tris·HCl分离胶缓冲液（pH8.8），2.72ml 30%丙烯酰胺溶液，80μl 10%SDS，80μl 10%APS（过硫酸铵），16μl TEMED。
western实验步骤
1．蛋白样品的制备在50mg组织中加入0.5ml蛋白裂解液(50mM Tris.Cl pH 6.8、15mM NaCl、5mM EDTA、0.5% NP-40、1mM PMSF)，超声匀浆，10000g ,4℃离心10min,取上清，加入等体积的2×SDS buffer（tris-Cl 100mM, DTT 200 mM, 甘油20%，溴酚蓝0.2%, SDS 4%），95℃煮沸5min, 迅速冰浴，10000g ,4℃离心10分钟，收集上清，用于后面实验。
2． SDS-PAGE（1）分离胶12%Tris-HCl PH 8.8 2.5ml双蒸水 3.3ml10%SDS 0.1ml30%丙烯酰胺 4.0ml10%过硫酸铵 0.1mlTEMED 0.04ml（2）浓缩胶5%Tris-HCl PH 6.8 0.63ml双蒸水 3.44ml10%SDS 0.05ml30%丙烯酰胺 0.83ml10%过硫酸铵 0.05mlTEMED 0.0005ml（3）电泳：浓缩胶恒压80V, 时间约45分；分离胶恒压120V，时间约3小时。
3．转膜（1）PVDF膜（millipore,K9KN1973U）的活化：甲醇浸泡2分，蒸馏水1分，转入转移缓冲液中。
（2）转移仪进行转膜：恒流200mA, 2小时。
4．封闭：5%BSA溶液, 4℃封闭过夜。
5.一抗孵育：（1）抗体稀释度：鼠源beta-actin, 1:1000稀释,鼠源chop, 1:1000稀释,兔源p38，1:1000稀释，稀释液：TBST。
（2）时间：4℃过夜。
6.二抗孵育：（1）抗体稀释度：抗鼠二抗或抗兔二抗, 1：10000稀释。
（2）时间：室温2h。
7. ECL(pierce,KL140454)底物化学发光显色，显影，定影，扫描。
western实验原理及步骤
western实验原理及步骤
western实验原理及步骤
western实验是一种分子生物学技术，它可以用来检测特定蛋白质的表达水平。
它的原理是将细胞内的蛋白质从细胞内取出，然后通过电泳来分离，最后将蛋白质用特定的抗体标记，然后用荧光染料检测，最后用荧光显微镜检测，从而检测特定蛋白质的表达水平。
Western实验的步骤包括：
1. 准备实验样本：首先准备实验样本，一般是细胞系或者组织样本，将其分离和提取蛋白质。
2. 电泳：将提取的蛋白质放入凝胶中，然后加入电流，使蛋白质受到电流的作用，从而分离不同的蛋白质。
3. 标记：将分离的蛋白质用特定的抗体标记，以便检测。
4. 检测：将标记的蛋白质用荧光染料检测，然后用荧光显微镜检测，从而检测特定蛋白质的表达水平。
western实验的原理是将细胞内的蛋白质从细胞内取出，然后通过电泳来分离，最后将蛋白质用特定的抗体标记，然后用荧光染料检测，最后用荧光显微镜检测，从而检测特定蛋白质的表达水平。
步骤包括准备实验样本、电泳、标记和检测。
超详细的Western实验步骤及结果分析
超详细的Western实验步骤及结果分析Western实验步骤1. 电泳(Electrophoresis)（1）SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。
一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。
配胶步骤：1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。
2.按比例配分离胶（8ml-10ml）3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。
（如果今日不上样可以放入4°C冰箱）注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。
3.12000r离心5分钟。
（3）上样与电泳1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。
3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳）注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。
western blot 超详细步骤
一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min 后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP管中，编号置于冰上。
2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。
3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。
二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。
2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。
测出待测蛋白浓度。
测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。
按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。
样品于-80℃保存。
三、电泳1.制胶分离胶:电泳凝胶浓度试剂 10%H2O(ml) 4.030%丙烯酰胺 3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.510%SDS(ml) 0.110%AP(ml) 0.1TEMED(μl) 5总体积(ml) 10浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(μl) 4010%AP(μl) 30TEMED(μl) 4总体积(ml) 31、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
完整版WesternBlot免疫印迹法实验方法步骤
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20）TBS/T封闭缓冲液（n1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
westernblot超详细步骤
westernblot超详细步骤Western印迹法这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。
Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。
杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液1.0mol/L Tris·HClTris (MW121.14) 30.29g蒸馏水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0约10ml1.74mg/ml (10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g异丙醇 100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。
0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW119.98） 12g蒸馏水至 500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4·12H2O（MW 358.14） 71.6g蒸馏水至 1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
western实验操作原理及方法
蛋白免疫印迹（Western blotting）实验操作原理及方法一、实验目的：通过本实验，可以特异性的检测蛋白的表达水平。
二、实验原理：1、蛋白浓度测定：考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）存在两种不同的颜色形式：红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，结合后燃料演的有红变蓝，最大光吸收由465 nm变成595 nm。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
此反应大约2 min即可完成，并可稳定1小时。
2、SDS凝胶：丙烯酰胺（Acr）和甲叉丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵（ammonium persulfate, (NH4)2S2O8, APS）或核黄素（ribofavin, VB2）和加速剂N, N, N’,N’-四甲基乙二胺（N, N, N’,N’-ytetramethyl ethylenediamine, TEMED）的作用下，聚合成三维网状结构。
* Acr和Bis之比可以决定胶的孔径等因素。
浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶。
3、SDS-PAGE电泳：SDS是阴离子去垢剂，由于其带有大量负电荷，当与蛋白结合时，所带电荷大大超过了天然蛋白原有的负电荷，因而消除了蛋白之间原有的电荷差异，则电泳迁移率主要依赖于分子量，而与所带净电荷和形状无关。
三、实验方法及步骤：样品预处理：1、将细胞从平皿上刮下，离心后，用1 X PBS冲洗，12000rpm 1min离心，弃上清，细胞沉淀保存于-80℃。
2、把细胞沉淀取出，加M-PER或T-PER（Thermo，约为细胞体积的2~3倍），悬浮细胞。
10 mL M-PER或T-PER+50μL 200 mM Na3VO4+50μL 200 mM PMSF+1片IN（Roche，酶抑制剂复合物）3、将装有细胞悬液的Doff管固定在4℃层析柜中的脱色摇床上，max speed，剧烈摇1小时。
4、冰上，超声破碎（注意先用纯水清洗探头），AmL=35%超声10s，停顿5s，反复10次（探头不能碰到管壁，且始终保持在液面以下，尽量不要产生气泡）5、重新固定在脱色摇床上，4℃，1 h，max speed。
western步骤详解
序号试剂名称1 硝酸纤维膜(NC膜) 0.45um2 三羟甲基氨基甲烷（Tris）3 甘氨酸4 甲醇5 盐酸（HCl）6 氯化钠7 Tween-208 脱脂奶粉9 丽春红S10 乙酸11 DAB12 30%过氧化氢13 1N盐酸3'3'二氨基联苯胺4盐酸盐14(4-CN)三、仪器和器具：1.转印电泳装置；2.稳流稳压电泳仪；3.高速冷冻离心机；电子天平；电冰箱；4.玻璃平皿、水槽、搪瓷盘5.微量进样器（5-50ul/20-200ul/100-1000ul）；6.普通试剂瓶、棕色试剂瓶（10ml/100ml/1000ml）7.烧杯(50ml/250ml/2000ml)、玻璃吸管及玻璃棒8.滤纸、玻璃纸、小刀片等四、溶液配制：1.10×转膜缓冲液（10×Transfer buffer）：Tris 29 g甘氨酸144g，去离子水加至800ml，4℃保存。
使用时取80ml上述溶液，加入500ml去离子水，200ml甲醇，用浓盐酸调PH至7.6，去离子水定容至1000ml2.10×TBS：Trise-base 24.2 gNaCl，85g用适量去离子水溶解，用1N盐酸调节PH至7.6，去离子水定容至1000ml，。
3.洗涤液（TBS/T）10×TBS 100 mlTween-20 1 ml去离子水定容至1000ml4.封闭液脱脂奶粉5.0g（溶解于80ml去离子水中）10×TBS 10 mlTween-20 50 ul去离子水定容至100ml5.10×丽春红S储存液丽春红S 2 g三氯乙酸30 g磺基水杨酸30 g去离子水溶解并定容至100 ml。
丽春红S染液（备选）丽春红S 0.2 g1%(V/V)乙酸100ml6.Tris-HCl（0.1M，PH7.5）Tris 21g溶于80ml去离子水中，用1N盐酸调节PH至7.5，去离子水定容至100 ml。
Western+实验操作程序
Western blot 实验操作程序一、储存液的配制：1.)1.5M T ris-HCl（PH8.8）：100mlTris 18.15g去离子水50 ml缓慢加浓盐酸调PH至8.8（约4 ml），冷却至室温后再加去离子水至100 ml.2.) 0.5M T ris-HCl（PH6.8）：100mlTris 6.05g去离子水50 ml缓慢加浓盐酸调PH至6.8（约8ml），冷却至室温后再加去离子水至100 ml..3.)10%SDS（W/V）：100mlSDS 10g去离子水100 ml溶解后，室温下保存。
4.)50%（v/v）甘油：100ml100%甘油50 ml去离子水50 ml 混匀后，室温下保存。
5. )1%溴酚蓝：10 ml溴酚蓝100mg去离子水10ml搅拌至完全溶解，经过滤后使用6. )丽春红S(Ponceau S)储存液：100 ml丽春红S 2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g去离子水100ml混匀后，室温下保存。
7. )10×转膜液：1000 ml甘氨酸90gTris 19.3g加去离子水至1000 ml，PH在8.3-8.4左右.二、工作液的配制：PMSF（苯甲基磺酰氟）：可抑制蛋白酶的降解作用，有较强的毒性，可严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，使用时需戴手套操作。
它在水溶液中不稳定，使用时需新鲜配制（可先配成10 mg/ml的储存液，需用异丙醇溶解）。
Aprotinin（抑肽酶）：可抑制组织裂解后释放出的蛋白酶对蛋白质的降解作用。
丙烯酰胺和双丙烯酰胺单体均具有强神经毒性，其作用具有累加性，配制时必须戴手套，防止皮肤接触。
搅拌至完全溶解，在4o C下可保存数月。
4. 4⨯分离胶缓冲液：100 ml2M Tris-HCl（PH6.8）75 ml 1.5M10%SDS 4ml 0.4%去离子水21ml混匀后可在4o C下保存数月，配分离胶时使用，注意用时不需再稀释,直接用4⨯的缓冲液即可5. 4⨯堆积胶缓冲液: 100 ml1M Tris-HCl（PH6.8）50 ml 0.5M10%SDS 4ml 0.4%去离子水46ml混匀后可在40C保存数月，配堆积胶时使用，注意用时不需再稀释,直接用4⨯的缓冲液即可6. 10%过硫酸胺(APS)：5 ml过硫酸胺0.5g去离子水5ml分装后，保存于-200C7. 电泳缓冲液:1000 mlTris 3g 25 mM甘氨酸14.4g 192 mMSDS 1g 0.1%加去离子水至1000 ml，PH在8.3左右。
最详细的Western_Blot过程步骤详解
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答） Western免疫印迹(Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测.对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术：一、原理二、分类i.放射自显影ii。
底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5。
Marker的相关疑问6。
染色的选择7.参照的疑问8。
缓冲液配方的常见问题9。
条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色"用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分.该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺,应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺）的去离子水配制含有29％（w/v)丙稀酰胺和1%(w/v）N，N'—亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N,N—亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
western试验步骤及注意事项
W estern实验步骤1．制胶及上样：（1）配制12%SDS-PAGE分离胶，混匀后注入边条厚度为2mm的两块洁净玻璃板间，其上加一薄层异丙醇，室温下静置至凝固。
（2）待分离胶完全聚合后，倾去其上的水层，以吸水纸吸净残余液体，插入加样梳，缓缓加入浓缩胶，使其充满加样梳间的空隙，室温下静置。
待胶完全聚合。
（3）将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽加入电泳缓冲液。
（4）小心拔去加样梳，使加样孔竖直，以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。
（5）分别取50µg蛋白量的细胞总蛋白样品及蛋白质分子量Marker，按4：1体积比加入5⨯样品缓冲液，以1⨯样品缓冲液？配平上样体积（总体积20µ1）后，于沸水浴中煮3min使蛋白变性。
（6）将处理好的样品按照预定的顺序加入分离胶的上样孔中。
2．电泳（1）接通凝胶电泳仪的电源，初始电压70V。
（约30分钟）（2）溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至160V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。
（约60分钟）3．转膜（1）从玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中。
（2）取与胶同样大小的硝酸纤维素膜，以95%乙醇浸泡5秒钟后浸泡于转移缓冲液5分钟以上待用。
（3）按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。
（4）将转移夹放入转移槽，膜在正极、胶在负极，接冷却循环水，90V稳压转移2小时。
4．染色（1）将硝酸纤维素浸入丽春红使用液中，振摇染色5-10min。
（2）蛋白质条带出现后，用去离子水洗去硝酸纤维膜上的丽春红底色。
（3）按照蛋白质分子量Marker指示的位置剪下目的条带所在的硝酸纤维素膜。
5．封闭把硝酸纤维素膜浸入5%脱脂奶粉，室温摇动2小时。
6．洗膜与杂交（1）以T-TBS洗膜，10分钟⨯ 3次。
（2）第一抗体封闭：SPARC单抗以T-TBS 1：200稀释，按0.1ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，4℃振摇过夜。
western实验步骤与注意事项
葵花宝典致亲爱的师弟师妹：本着不希望你们来到实验面临一些束手无策的窘境，师姐在这里把自己所学和资源略写一二。
一、来到实验室，无论你喜欢不喜欢，乐不乐意，一定要把实验室的师兄师姐的名字都记住，以及实验室里有什么仪器！！！二、关于实验部分1、组织蛋白提取：方法一：（1）4℃下，先生理盐水洗，再加入蛋白提取液，剪刀剪碎，匀质器6000，循环六次，每次都拿下来冰镇，防止蛋白变性，最后14000转，20min，4℃（2）跑western之前，需测BCA，以保证每个组分上样的蛋白总质量一样（此处为定量实验，看目标蛋白的表达量，若仅仅定性则无需做BCA）注意事项：匀质器需要用的小管和玻璃球在郝荣华师姐那里，先加玻璃球一般，目测大概三四毫米高度就行（包括管底小尖尖），且溶液必须装满才振荡效果好，因此，加入细胞裂解液多，容易导致蛋白浓度低。
方法二：（1）取冰（东边实验室，最后面有制冰机）（2）将软骨从﹣80℃冰箱取出，置于冰面上解冻（3）去细胞室的液氮罐里，取出少量液氮置于泡沫箱内，（4）转移至实验室内，取出少量，倒入研钵中，研磨（5）浆糊状，立即转入EP管中，（6）细胞裂解液，2、western blotting（1）抗体购买1. Antigen,也就是抗原名称,最好是英文全称,许多客户只说简称,要知道不同的抗体其简称有可能会一样的.有中文最好也提供一下.2. Reactivity,即反应性,也就是实验用于什么特种,是人,大鼠还是小鼠等3. Host,宿主,就是抗体来源,这个主要和二抗有关系。
一抗来源必须要和二抗搭配,且不能和样本来源相同。
比如,二抗是羊抗小鼠,一抗就要选择小鼠来源的.不少客户常常是先有二抗,再买一抗,受限制得很,其实应该先订一抗,再买二抗,毕竟一抗贵,为了将就一个100元左右的二抗,而把几千元的一抗的订购弄得很复杂,真是不划算.所以,不要为了二抗伤脑筋4. Conjugate,即缀合物或标记物,如是不是需要FITC标记,HRP标记等情况,也最好说明5. Applications,就是应用. 你买这个抗体用于做什么实验,是IHC还是WB,这点一定要说,要知道,抗体开发出来,不是什么实验都能用或都会效果好,抗体公司说明上写着能做的实验是经过验证的,没有写的不是说一定不能做,也可能可以做,但没有验证,厂家不会乱说的,也是科学，负责的态度.例如,你要是想做IHC-P,就是石蜡切处的免疫组化,如果买不到抗体明确说可以做,你要用就得冒风险,好在现在抗体厂家众多一般都找得到了（2）β-actin（内参蛋白）分子质量为43KD，因此，目标蛋白不能和内参蛋白分子质量一致，内参也叫看家基因，在组织或细胞中都会表达，且表达量在不同组织或细胞中几乎是相同的，一般有β-ACTIN，GAPDH等。
WESTERN详细实验步骤
前期准备物品准备：平皿、眼科剪、小镊子、匀浆器、研磨器、枪头（10ul、100ul、1000ul）、EP管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（提蛋白的所有操作均在冰上）、超纯水、脱脂奶粉、热水/水浴缸。
配液准备：PBS液：PBS 1袋，2000ml超纯水。
（最好加热促溶，并提前消毒，4℃过夜备用）TBST液（洗膜液）：PBS液：Tween20=1000:1电泳缓冲液：Tris base 3.01g，甘氨酸 18.77g，SDS 1g，超纯水1000ml。
转膜液（1L）：Tris base 3.03g，甘氨酸 14.4g，超纯水 800ml，甲醇200ml。
封闭牛奶：脱脂牛奶 5g，TBST 100ml。
丽春红：考马斯亮蓝：化学发光底物（1ml）：A液、B液各0.5ml。
（B液需避光保存）SDS-PAGE 分离胶（一般选8%）：10%SDS用前先加热溶解；AP配成10%（1mlAP+10ml超纯水）分离浓缩胶试剂8% 10% 12% 15% 18% 20% 8% 10% 12% 15% 18% 20% H20 ml 4.63 4 3.3 2.3 1.3 0.63 6.9 5.9 4.9 3.4 1.9 0.930%丙烯酰胺2.673.3 4 5 6 6.67 4 5 6 7.5 9 101.5MTRIS-HCL(ph8.8)2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.53.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.810%SDS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 AP 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15TEMED 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul总体积（ML ）10ml 15mlSDS-PAGE 浓缩胶：操作步骤肝组织蛋白的提取准备物品：PBS （提前消毒，4℃过夜备用），平皿，眼科剪，小镊子，匀浆器，枪头，EP 管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（所有操作试剂浓度5%H20 ml 2 3 4 6 30%丙烯酰胺 0.5 0.75 1 1.5 1.5MTRIS-HCL(ph8.8)0.5 0.75 1 1.5 10%SDS 40 60 80 120 AP 30 45 60 90 TEMED 4ul 6ul 8ul 12ul 总体积（ML ）3ml4.5ml6ml9ml均在冰上）1、取出肝组织块于平皿中，加入PBS漂洗，切下约黄豆大小的肝组织放入手动匀浆器中，在冰上迅速碾磨直至呈现云雾状；2、加入组织裂解液约500ul（裂解液:PMSF=100:1），冰上作用20～30min；3、吸取组织液到已高压灭菌的EP管中，4℃离心，12000rpm×15min；4、取出EP管放在冰盒内，仔细吸取上清，取2ul的上清用于蛋白浓度的测定；5、剩余上清，按蛋白：5xbuffer=4:1的比例加入5xbuffer,煮沸10min；6、瞬时离心，放入-20℃冰箱冻存备用。
Westernblot实验步骤详尽版
Westernblot实验步骤详尽版Western bolt 实验步骤详尽版蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳实验目的：分离目的蛋白实验仪器：移液枪，玻璃瓶，胶模，垂直板电泳槽，电泳仪，水浴锅，通风橱，染色和脱色用器皿实验材料：ddH2O，30%丙烯酰胺溶液（Acrylamide-Bisacrylamide 29：1），1.5M Tris-HCl，0.5M Tris-HCl，10%SDS，10%APS，TEMED，1*蛋白上样缓冲液，5*蛋白上样缓冲液，考马斯亮蓝R250，0.2M KCl溶液，欲染蛋白marker，1*SDS-PAGE电泳缓冲液实验步骤：1.安装制胶模具。
2.调制5ml 12%的分离胶，立即灌注至模具高度的70%（绿杠下缘）。
5ml 12%分离胶的配方：1.8ml ddH2O，2.0ml丙烯酰胺溶液，1.3ml 1.5M的Tris-HCl缓冲液，0.05ml 10%SDS，0.05ml 10%APS，0.002ml TEMED。
3.加一层ddH2O，约30分钟后聚合（胶凝固），胶层和水层可见折光界面。
4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干。
5.调制1ml 5%浓缩胶，立即灌注，插入梳子。
静置。
1ml 5%浓缩胶配方：0.55mlddH2O，0.17ml丙烯酰胺溶液，0.26ml 0.5M的Tris-HCl缓冲液，0.01ml 10%SDS，0.01ml 10%APS，0.001mlTEMED。
6.胶凝后装配垂直板电泳槽，向电泳仪倒入1*SDS-PAGE电泳缓冲液，内槽倒满，外槽倒至一半高度。
7.取16μl蛋白样品与4μl的5*蛋白上样缓冲液混合，水浴锅内煮沸5分钟。
取6μl蛋白marker与6μl 1*蛋白上样缓冲液混合。
8.加样电泳，每孔加样12μl。
电泳参数为：70V 15分钟左右，150V 30分钟左右。
（时间可以调整，以欲染Marker各条带清晰为准）9.卸下玻板，剥离凝胶放在盛有转膜缓冲液的器皿内，切下目的蛋白所在区域的凝胶，注意保留欲染Marker，且最好保留多条欲染Marker条带（因此电泳时间也不要太长，让Marker紧凑一些）。
western blot 超详细步骤
一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP管中，编号置于冰上。
2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。
3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。
二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。
2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。
测出待测蛋白浓度。
测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。
按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。
样品于-80℃保存。
三、电泳1.制胶分离胶:电泳凝胶浓度试剂 10%H2O(ml) 4.030%丙烯酰胺 3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.510%SDS(ml) 0.110%AP(ml) 0.1TEMED(μl) 5总体积(ml) 10浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(μl) 4010%AP(μl) 30TEMED(μl) 4总体积(ml) 31、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
(完整word版)Western操作步骤
Western-Blot 操作流程及个人心得体会（二）from 生物问问我的生物博客Western操作步骤（一）蛋白样品制备(1）单层贴壁细胞总蛋白的提取:1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS(0。
01M pH7.2～7。
3)。
平放轻轻摇动1min 洗涤细胞,然后弃去洗液。
重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液.将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。
3。
按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM),摇匀置于冰上。
(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合）4. 每瓶细胞加400 μl 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5。
裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1。
5ml 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）6。
于4℃下12000rpm 离心5min。
(提前开离心机预冷)7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。
（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液,按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的.本人是先用预冷的PBS（一般数毫升)加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强)（2）组织中总蛋白的提取:1。
将少量组织块置于1～2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。
然后置于冰上。
3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎.4. 裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1。
Western Blotting(半干转) 超级详细步骤
Western Blotting Analysis Guide（半干转）Western blotting (半干转)可分为以下9个步骤：一、蛋白的提取A．总蛋白提取1. 将收集的细胞或组织(约0.1 g)从-80°C冰箱取出，按1:10 (w:v)加入冰浴的蛋白裂解液(RIPA)；并加入1/10体积的蛋白酶抑制剂（PMSF）2. 用Dounce 手动匀浆器或电动匀浆器，匀浆细胞或组织（注意：全程冰上操作，每个样品用Dounce 上下抽动相同的次数，电动匀浆器匀浆相同的转速及时间）3. 冰上静置20 min 后，12000 rpm 离心，4 °C，15 min，取上清。
B．核蛋白提取1. 称取100 mg 肝脏冰冻组织置于Dounce 手动匀浆器，加入1 mL 冰浴的核蛋白裂解液A，上下抽动5下（注意：全程冰上操作，不同组织上下抽动需摸条件，匀浆后能看到些许小组织块）2. 将匀浆液倒入1.5 mL 离心管，瞬时离心30 s3. 上清倒入另一1.5 mL 离心管，冰浴5 min4. 3000 rpm 离心，4 °C，10 min，上清倒入另一1.5 mL 离心管收集（此为胞浆蛋白）5. 沉淀加入50 μL 核蛋白裂解液B 吹打，冰浴20 min6. 12000 rpm 离心，4 °C，20 min，将上清吸入0.5 mL 离心管收集（此为核蛋白）。
二、蛋白浓度的测定在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA 分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
1．BCA标准品和样品的准备：（BCA标准品为5mg/mL）配制1mg/mL的标准品：取10 μL原标准品+ 40 μL PBS缓冲液混匀，浓度为1mg/mL 配制0.25 mg/mL的标准品：取5 μL上述1mg/mL的标准品+ 15 μL PBS缓冲液混匀，浓度为0.25 mg/mL样品用水以1– 5倍稀释，并且将蛋白裂解液用PBS缓冲液按相同的比例稀释作为样品的空白对照（建议样品稀释2倍，不同组织使用不同稀释倍数）。
western 实验操作流程
免疫印迹实验操作流程一、培养细胞总蛋白质的提取1. 每200ul预冷的RIPA裂解液中加入2ul PMSF，混匀后置冰上备用；2. 收集细胞，用预冷PBS洗涤细胞两次，尽可能吸干上清；3. 每106个细胞加100ul预冷的RIPA裂解液，与细胞充分混匀，置4℃条件下放置30m，每间隔5分钟吹打混匀；4. 4℃，12000rpm条件下离心5m，将上清转移入另一预冷的离心管中；5. 使用蛋白定量试剂盒及酶标仪对总蛋白质进行定量测定；调整蛋白浓度；6. 依据体积加入6×蛋白上样缓冲液（如不立即使用，置于-80℃待用）；沸水浴煮沸5分钟后准备上样。
二、电泳与转膜7. 清洗玻璃板，制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%分离胶和5%积层胶）；8. 蛋白提取液与预染蛋白分子量Marker上样，100V电泳；9. 依据实验要求剪出合适大小的PVDF膜，甲醇漂洗PVDF膜10s，并使用电转液完全浸润PVDF膜、胶板、海绵、滤纸15m；10. 剥胶后，根据预染蛋白分子量Marker确定目的条带的位置并切胶；11. 按阴极至阳极：海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序将转膜板固定于装满电转液的电转槽中，90V电转；12. 电转结束后，在膜上做标记；三、封闭、一抗与二抗孵育、显色13. 将膜条置于含5%脱脂奶粉的TBST中，室温缓慢振荡封闭1h；14. 将膜条转移至含1%脱脂奶粉的TBST稀释的一抗中：抗β-actin小鼠抗人单克隆抗体（1:4000），置4℃条件下缓慢振荡过夜（或室温振荡2h以上）；TBST 液洗膜三次，每次10min；15. 将膜条转移至含1%脱脂奶粉的TBST稀释的二抗中：辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（1:4000），室温缓慢振荡1h；TBST液洗膜三次，每次10min；16. 加入配制好的化学发光试剂ECL，室温2min后，X光片曝光、显影、定影。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
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Western实验步骤
1. 电泳(Electrophoresis)
（1）SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。
一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。
配胶步骤：
1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。
2.按比例配分离胶（8ml-10ml）
3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面
4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。
（如果今日不上样可以放入4°C冰箱）
注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理
1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加 3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀
2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。
3.12000r离心5分钟。
（3）上样与电泳
1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右
2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。
3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳）
注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。
3.转膜(Transfer)
1.物品准备，甲醇，转膜缓冲液，滤纸，转膜槽，玻璃皿3个，制冰。
2.取下胶板，用专门的板将玻璃板分离（务必不要将胶弄破，动作轻些，从下面和上面分离玻璃板），切适合大小的胶（不要切掉MAKER）。
3.用专门的板将胶转入事先放有转膜缓冲液的皿中，记录胶的顺序，剪与胶同等大小的滤纸和转膜纸PVDF膜，PVDF膜要放入甲醇中浸15秒（一般1-2分钟），胶要切角做标记（不要切到maker）,一般一个切三个角，一个切一个角，记录顺序
4.铺膜，PVDF膜铺在胶上，在PVDF膜上铺三层滤纸，然后胶的对侧面铺三层滤纸即可（滤纸要大于等PVDF膜，PVDF膜要大于等胶），赶尽气饱。
5.再将铺好的膜胶滤纸，转入转膜夹中，有PVDF膜这面放在正极侧（即无色透明夹这面），再将夹子放入转膜槽里（电极不要放错，蛋白质带负电的）
6.转膜，槽放入冰中，槽内放冰槽，设定转膜电流为300-400mA，电压120伏，转膜时间为40分钟（30-60分钟）。
注意：实验选用PVDF膜但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取，膜不要碰到其他地方特别是手不要碰到膜；动作要轻；赶尽气饱；正负极不要弄错；记录胶的顺序；
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，电压120伏，转膜时间为30-60分钟。
也可以在15-20mA转膜过夜。
具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。
也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4．封闭
1.转膜完毕后，将蛋白膜放入，TBS漂洗1-2分钟
2.再用TBST封闭，在摇床上摇1小时，装入薄膜内
配制TBS:1MtriHCL (PH8.0) 10ML,1M NaCL 150ml,dd水 840ml；
TBST(MILLK)：5%millk（脱脂奶粉）,0.1%tween20,TBS
注意：从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景；对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
1.切所需蛋白条带后，参考一抗的说明书，按照适当比例用TBST（有奶粉的）稀释一抗。
放置在冰上
2.有薄膜将所需条带封住，立即加入稀释好的一抗后，封口，4℃孵育过夜。
注意：其实室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。
或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。
6.二抗孵育(antibody incubation)
1.回收一抗。
2.取出膜，放入TBST(没MILLK)中摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟（5-10分钟），共洗涤3次
注意：如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数，一般洗膜后以MAKER条带背景变淡一些为好。
3.参考二抗的说明书，按照适当比例用TBST(MILLK)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。
二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗
4.立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗。
5取出膜，放入TBST(没MILLK)中摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟（5-10分钟），共洗涤3次，如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数
7.显色和曝光
1.物品准备：显色试剂A、B(A;B=1ml:25ul)，显影液，定影液，保鲜膜，胶片
2.倒掉脱洗液，在曝光盒里铺好保鲜膜；再在皿里将条带铺好（蛋白面朝上），关灯暗室中配好的显色液，加入铺好的膜上（要完全覆盖膜）
3.将蛋白膜铺好在保鲜膜上（要脱掉些显色液），盖上保鲜膜，剪适当大小胶片，曝光，曝光时间分别是15秒、30秒、60、秒
4.曝光后将膜放入显影液中，显影片刻（看到条带出现即可），放入定影液中定影片刻；
5.曝光结束后，清水洗胶片，晾干
8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
如果蛋白膜需要再次利用可以使用strippingbuffer处理蛋白膜。
1.将蛋白膜加入stripping buffer 中50°C摇30分钟
2.倒掉stripping buffer,加入新的stripping buffer在25°C（室温即可）摇10分钟
3.再TBST(没有奶粉)摇洗10分钟，共2次
4.封闭，同上4封闭。