分离科学思考题答案PDF版

式中，Ke-----静电作用对溶质分配系数的贡献； Kh----- 疏水作用对溶质分配系数的贡献； Kb-----生物亲和作用对溶质分配系数的贡献； Ks----- 分子大小对溶质分配系数的贡献； Kc----- 分子构型影响对溶质分配系数的贡献； Km -----除上述因素外的其它因素影响对溶质分配系数的贡献。 值得指出的是， 这些因素中虽然没有一个因素完全独立于其它因素， 但一般来说， 这些不同的因素或多或少是独立存在的。 影响待分离物质在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、 成相 聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH 值、温度等。
坏蛋白质的四级结构。 SDS 会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结 合 SDS 的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关， 因此 SDS 多肽复合 物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关 IEFE 是一种利用具有 PH 梯度的支持介质分离等电点不同的蛋白质电泳技术。 其原理就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即 形成一个由阳极到阴极逐步增加的 PH 梯度，在此体系中，不同蛋白质即一定到 货聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术 中的等电点聚焦也被称为聚焦电泳。 13、PAGE 与 SDS-PAGE 原理上有何不同？ 聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效地把不同类型的蛋白质分开的主要依据． 是样品中各 种物质的电荷和分子量的差异性。SDS-PAGE 分离原理的主要依据，则是各种物 质分子量的差异性。 因为当 SDS 与蛋白质结合后， 蛋内质分子即带有大量的负电 荷．并远远超越其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至 消除。与此同时蛋白质在 SDS 的作用下结构变得松散，形状趋向—致。多肽与 SDS 结合的量几乎总成正比而与其序列无关。 所以各种 SDS 蛋白质复合物在电泳 时产生的泳动率差异，就反映出分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数 与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。 14、用 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量时为什么要用巯基乙醇 强还原剂β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。巯基乙醇使蛋白二硫键还原, 有利于蛋白质与 SDS 的结合,蛋白质—SDS 复合物带上相同密度的负电荷， 并可引 起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状 的影响， 而取决于分子量的大小，因此聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质 的分子量。 15、用 SDS-PAGE 测定蛋白质的分子量，为什么有时和凝胶层析法所得结果有所 不同？是否所有的蛋白质都能用 SDS-PAGE 测定其分子量？为什么？ 两种方法原理不同，有差异是正常的。如果差距较大，要仔细分析。 一般凝胶层析是非变性的， SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是变性的， 二硫键也被还原， 所以是亚基（肽链）分子量。
凝胶层析与分子形状有关，一般 marker 都是球状蛋白，所以测球状蛋白分子量 较准。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与分子形状无关。 不是所有的蛋白质都能用 SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质 用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带 有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。
极缓冲液离子强度增高，电流强度也增加，不仅降低分辨率(即电泳谱带的展宽 和组分的热混和)，严重时甚至烧断或熔化支持介质。 （6）筛孔在筛孔大的凝胶中溶质颗粒的泳动速度快。 11、什么是电渗？带电质点泳动速度与电渗的关系如何？ 电渗是支持物本身所带的电荷吸附溶液中性质相反的离子，在电场中移动的结 果。其带电愈高，电渗力愈大。当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，加快颗粒 的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。 12、PAGE、SDS-PAGE、IEFE 中文名称是什么？简述各自的分离原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂 N,N-甲 叉 双 丙 烯 酰 胺(Bis) 在 加 速 剂 N,N,N,N- 四甲基乙二胺 (TEMED) 和催化剂过硫酸铵 (AP) 或核黄素 (C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电 泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。不连续 PAGE， （1）凝胶层的不连续；浓缩 胶浓度为 2.5%-4%，分离胶则根据被分离样品的情况而定。 （2）缓冲液离子成分 的不连续；在两层凝胶中加入前导离子，在电极缓冲液中加入尾随离子。为保持 溶液的电中性及一定的 pH，在缓冲液中加入一种与前导和尾随离子符号相反的 离子，为缓存配对离子。在分离蛋白质样品时，常用的前导离子为 Cl，甘氨酸根 负离子为尾随离子，采用三羟甲基氨基甲烷（Tris）作为缓冲配对离子。 （3）电 位梯度的不连续：前导离子后面形成了高的电位梯度。当前导离子、尾随离子和 蛋白质迁移率和电位梯度的乘积相等是，则三种离子移动速度相同。在前导离子 和尾随离子之间形成一个稳定的不断向阳极移动的界面。 也就是在高电位梯度和 低电位梯度之间形成一个迅速移动的界面。 （4）pH 值的不连续：在浓缩胶和分 离胶之间有 pH 的不连续，这是为了控制尾随离子的解离度，从而控制其有效迁 移率。要求在浓缩胶中，慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品夹 在前导和尾随离子界面之间， 使样品浓缩。而在分离胶中尾随离子的有效迁移率 比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。 SDS－PAGE 是在电泳样品中加入含有 SDS 和β-巯基乙醇的样品处理液的一 种电泳方法。 SDS 即十二烷基硫酸钠(CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+)， 是一种阴离子 表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二 级和三级结构，强还原剂β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破
9 电泳分离蛋白质的原理是什么 蛋白质是两性电解质，当 PH > pI 时带负电荷, 在电场作用下向正极移动 :PH > PI 时带正电荷,在电场作用下向负极移动：PH=PI 时净电荷为零，在电场作用下既不 向正极移动也不向负极移动，此时的 PH 值即是该蛋白的 PI 值。各种蛋白质中由 不同种类的氨基酸一不同的比例组成，因而有不同的等电点，这是其固有的理化 常数。 蛋白质在电场中汰动一段时间后，便会集中到确定的位置上呈一条致密区 带。 若样品为混合的蛋白质溶液时， 由于不同蛋白质的等电点和分子量是不同的， 因此经电泳后，就形成了泳动度不同的区带。利用此性质，便可把混合液中不同 的蛋白质(或其它物质)分离开，也可用其对样品的纯度进行鉴定。 10、简述影响带电质点的泳动速度的因素 （1） 颗粒性质带电颗粒在电场中泳动的速度与带电颗粒的净电荷量成正比，与 颗粒的半径成反比。 （2）电场强度 E 愈高，带电颗粒的泳动速度愈快。 （3） 溶液性质 pH 偏离分子的等电点愈远，解离度愈大，净电荷愈多，泳动速 度越快；离子强度加大，电流加大，泳动速度加快;泳动速度与溶液黏度成反比。 （4）电渗是支持物本身所带的电荷吸附溶液中性质相反的离子，在电场中移动 的结果。其带电愈高，电渗力愈大。当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，加快 颗粒的泳动速度； 当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时， 则降低颗粒的泳动速度。 （5）焦耳热电泳过程中释放的热量与电流强度的平方成正比。当电场强度或电
样品预处理
亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两 相中水分均占很大比例，即形成双水相系统。利用亲水性高分子聚合物的水溶液 可形成双水相的性质，开发了双水相萃取法。双水相萃取与水-有机相萃取的原 理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同时，物质 进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子 键等） 的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。 5、双水相相图中各区域的含义是什么 答：双水相相图是一根双节线，当成相组分的配比在曲线下方时，系统为均匀的 单相。混合后溶液澄清透明，称为均相区；当配比在曲线的上方时，能自动分成 两相，称为两相区，当配比在曲线上，混合后，溶液由澄清变为浑浊。 6、常见的双水相构成体系有哪些 答：可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）, 聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纤维素/葡聚糖。双水相萃取中采用的双聚合物系统是 PEG/Dx，该双水相的上相富含 PEG，下相富含 Dx。另外，聚合物与无机盐的 混合溶液也可以形成双水相，例如，PEG/磷酸钾（KPi）、PEG/磷酸铵、PEG/ 硫酸钠等常用于双水相萃取。 PEG/无机盐系统的上相富含 PEG,下相富含无机盐。 7.双水相适合萃取什么样品 答 ：主要是分离蛋白质 ，酶，病毒，脊髓病毒和线病毒的纯化，核酸，DNA 的分离，干扰素，细胞组织，抗生素，多糖，色素，抗体等。 此外双水相还可用于稀有金属/贵金属分离 8、影响生物分子在两水相中分配的因素有哪些 答： 由于溶质在双水相系统两相间的分配时至少有四类物质在两个不同相系统共 存，要分配的物质和各相组分之间的相互作用是个复杂的现象，它涉及到氢键、 电荷相互作用、范德华力、疏水性相互作用以及空间效应等，因此，可以预料到 溶质在双水相系统中两相间的分配取决于许多因素， 它既与构成双水相系统组成 化合物的分子量和化学特性有关，也与要分配物质的大小、化学特性和生物特性 相关。 大量研究表明， 生物分子在双水相系统中的实际分配是生物分子与双水相系统间 静电作用、疏水作用、生物亲和作用等共同作用的结果，形式上可以将分配系数 的对数值分解为几项： InK = InKm+InKe+In Kh+InKb+InKs+InKc
从强极性溶剂中萃取非极性或弱极性化合物。 离子交换固相萃取所用的吸附剂是带有电荷的离子交换树脂，目标化合物与 吸附剂之间的相互作用是静电吸引力，用于萃取带有电荷的化合物。 吸附 SPE：一般指用的吸附剂是综合性的、多功能的萃取方法。 3. 优化 SPE 的步骤是什么？
选择吸附剂 4、何谓双水相萃取
1. SPE 与 SPME 的特点各是什么？相同性？相异性？ SPE 特点：SPE 技术基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱 的方式对样品进行富集、分离、净化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程。 其特点主要为：可同时完成样品富集与净化，大大提高检测灵敏度；比液液萃取 更快；更节省溶剂,；可自动化批量处理；重现性好。 SPME 特点：集萃取、浓缩、解吸、进样于一体的样品前处理新技术，它以 固相萃取(SPE)为基础，保留了 SPE 的全部优点，排除了 SPE 需要柱填充物和使用 有机溶剂进行解吸的缺点，并可用于 GC 和 HPLC 等仪器上直接进样。它具有样 品用量少、选择性高、使用方便、快捷等特点。 共同点：节约有机溶剂 容易操作 可自动化控制 不会出现乳化现象 缩短样品预处理时间