在活体成像中荧光色素标记细胞的方法举例
活细胞成像技术的使用教程
活细胞成像技术的使用教程活细胞成像技术是一种能够观察和记录活细胞在活体条件下的实时动态的图像技术。
这种技术在生物医学研究、药物发现、细胞生物学和生物工程领域得到了广泛应用。
本文将介绍活细胞成像技术的基本原理、常用的成像方法和实验步骤，以及一些常见的应用案例。
一、基本原理活细胞成像技术基于显微镜成像原理，通过将活细胞标记或转染成荧光染料、标签蛋白或荧光蛋白，利用显微镜观察和记录这些标记物的荧光信号。
荧光信号可以直接显微镜观察或使用专门的成像设备进行采集和记录。
活细胞成像技术依赖于荧光标记物的特异性和稳定性。
常用的荧光染料或标签包括荧光染料，如荧光素、达菲红和荧光素酮；标签蛋白，如绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）和黄色荧光蛋白（YFP）等。
这些荧光标记物会与特定的生物分子结合，如细胞器、蛋白质、DNA或RNA等。
荧光标记物与目标结合后，通过激发荧光染料吸收光，产生特定波长的荧光信号。
这些信号可以通过荧光显微镜进行实时观察和记录。
二、常用成像方法1. 荧光显微镜荧光显微镜是观察荧光信号的主要工具。
它包括激发光源、滤光片、物镜、荧光探测器和成像系统。
激发光源选择合适波长的激光或白炽灯，滤光片选择对目标荧光信号具有高透射率的滤光片，以减少背景干扰。
荧光探测器可以选择光电倍增管或CCD相机等，用于接收和记录荧光信号。
成像系统可以是显微镜附件或独立的荧光成像仪。
2. 皮肤窗准备法皮肤窗准备法是一种常用的动物模型实验方法，可以观察和记录活细胞在活体动物皮肤上的实时图像。
在这种方法中，通过手术将活体动物的皮肤上形成一个窗口，并标记活细胞，然后使用荧光显微镜观察和记录细胞的活动和变化。
这种方法可用于研究细胞迁移、细胞分裂、血管生成等生物过程。
三、实验步骤1. 准备样品根据实验需要选择合适的细胞系，培养到合适的生长状态。
根据实验目的选择适当的荧光标记物或标签蛋白，将其转染到细胞中。
确保标记物与目标分子结合后的效果和细胞生理状态正常。
小动物活体成像用的近红外一区荧光染料
小动物活体成像用的近红外一区荧光染料在小动物活体成像的领域里，近红外一区荧光染料就像是个“魔法师”，它们能帮助我们看清动物体内发生的种种神秘事件。
这些染料可不是普通的颜料哦，而是经过精心设计的，能够在特定波长下发光。
想象一下，科学家们就像小侦探一样，借助这些染料深入动物的身体，观察各种生理活动。
嘿，听起来是不是有点酷？这种技术让我们能够在不伤害小动物的情况下，了解它们的健康状况，真是让人觉得妙不可言。
说到近红外一区荧光染料，它们的特点简直是独一无二。
这些染料能穿透生物组织，不像其他可见光染料那样容易被吸收或散射，仿佛给动物穿上了一件隐形斗篷，让我们在不打扰它们的情况下，轻松探查里面的秘密。
真是“隔墙有耳”，不过我们可不是想偷听八卦，而是想了解它们的生理状态。
通过成像技术，科学家们能看到肿瘤、炎症甚至是血管的动态变化。
想想看，身处实验室的科研人员就像是在操控一台“透视仪”，轻松掌握小动物的健康状况。
找到合适的染料可不是一件简单的事。
就像找对象一样，得挑挑捡捡。
每种染料都有自己的特点，得看它的发光强度、稳定性、以及与生物组织的相容性。
比如，有些染料在小动物体内会因为环境的变化而失去荧光，这就像约会时突如其来的冷场，尴尬得不得了。
所以，科学家们需要做大量的实验，才能找到最合适的荧光染料，真是“千辛万苦”。
染料的使用不止于此，真是“一石二鸟”。
这些荧光染料不仅能帮助我们进行成像，还能用来追踪细胞的动态变化。
想象一下，在某个小动物体内注入了荧光染料，然后通过成像技术观察到细胞是如何迁移、增殖甚至是死亡的。
那种实时监测的感觉，真是让人兴奋不已！就像看一场现场的舞蹈表演，细胞在舞台上尽情展现自己的风采。
说实话，这种技术让我们对生物学的理解更加深入，就像打开了一扇窗，阳光洒进来，照亮了我们曾经看不见的地方。
使用这些染料也有一些挑战。
要保证小动物的安全，染料的毒性必须控制得当。
就像喝水，量多了会撑，量少了又渴。
科学家们必须找到一个平衡点，让染料在体内工作时不产生副作用。
活体生物发光成像技术原理及应用
活体生物发光成像技术原理及应用展开全文一、技术原理1. 标记原理哺乳动物生物发光，一般是将 Firefly luciferase 基因（由 554 个氨基酸构成，约50KD）即荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体 DNA 上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光素酶也会得到持续稳定的表达。
基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。
将标记好的细胞接种到实验动物体内后，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。
这种酶在ATP，氧存在的条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。
除Firefly Luciferase 外，有时也会用到Renilla Luciferase。
二者的底物不一样，前者的底物是荧光素（D-luciferin），后者的底物是coelentarizine。
二者的发光波长不一样，前者所发的光波长在540~600nm，后者所发的光波长在460~540nm 左右。
前者所发的光更容易透过组织，后者在体内的代谢比前者快，而且特异性没有前者好，所以大部分活体实验使用 Firefly Luciferase 作为报告基因，如果需要双标记，也可采用后者作为备选方案。
荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素。
荧光素在氧气、ATP 存在的条件下和荧光素酶发生反应，生成氧化荧光素 (oxyluciferin)，并产生发光现象。
对于细菌标记，一般利用发光酶基因操纵子luxABCDE 或luxCDABE，其由控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成。
利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物。
但是一般细菌标记需要转座子的帮助把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达。
2. 底物荧光素的特点荧光素由于诸多优点得到广大科研人员的青睐，主要特点如下：① 荧光素不会影响动物的正常生理功能。
活体细胞中关键生物分子的荧光成像实验报告
活体细胞中关键生物分子的荧光成像实验报告说起“荧光成像”，你可能会想，这听起来是不是像科幻电影里那些神秘的科学实验？完全不是那么复杂，反倒很酷，能让你用眼睛直接看到细胞里发生的各种“故事”。
今天就来给大家聊聊在活体细胞中，怎么通过荧光成像这些小小的荧光分子，窥探细胞内部的秘密，感觉就像是给细胞装上了一个“夜视镜”，神奇又有趣。
活体细胞呢，不像你平时看见的那些死掉的细胞那样透明、单一，它们里面可是有一大堆五花八门的生物分子，什么蛋白质、DNA、脂质，甚至一些小小的离子。
这些分子，恰如我们身边的“幕后英雄”，它们在细胞里面来来往往，做着各种各样的工作。
可问题是，这些东西通常肉眼根本看不见，不像你的手机、衣服，直接一眼就能看明白。
于是呢，科学家们就想出了一招，那就是用荧光标记。
这时候，细胞内部的这些分子就变得好像披上了“霓虹灯外衣”，一闪一闪的，亮得你眼花缭乱。
你想啊，如果能够把这些分子标记上颜色，然后用特殊的仪器拍照，岂不是能看到这些分子在细胞中“忙碌”的样子？怎么给这些分子贴上“霓虹标签”呢？这可不是涂涂画画那么简单。
科学家们通常会选择一些能和这些分子特定结合的化学物质，把它们标记成荧光。
比如说，某些蛋白质就会和一些特定的荧光探针发生反应，形成一种化学配对。
这个时候，它们就能在特定的光照条件下，发出漂亮的荧光，像夜空中的星星一样，让你一眼就能发现它们的“身影”。
荧光探针在不同的光线下会有不同的颜色，红的、绿的、蓝的，五光十色，看得人眼花缭乱。
可是，别以为这就完了哦。
你要知道，荧光成像可不是那么简单的事。
虽然这些分子在荧光照射下会亮起来，但如果不够精准，那就像是在夜空中盯着无数的星星，根本搞不清楚哪个是哪个。
所以，除了荧光标记，最重要的就是选择合适的显微镜设备，尤其是高分辨率的荧光显微镜。
通过这种显微镜，科学家们就能把细胞内部的一切都放大，看到每个分子的活动轨迹。
好比你从天上俯瞰一座城市，看到每栋楼里的灯光和行人流动，而这些分子，就像是这座城市的交通和电力系统，天天忙个不停，才让细胞能够“正常运转”。
活体生物发光成像技术
活体生物发光成像技术-是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA活体生物发光成像技术-是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，采用荧光报告基团(GFP、RFP、Cyt及dyes等)进行标记，利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。
学术术语来源——绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的分离鉴定文章亮点：1 利用显性遗传的表达绿色荧光蛋白的转基因大鼠作为细胞供体，进行了骨髓间充质干细胞的分离和培养，成功获得了稳定表达绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞。
2 经鉴定后的间充质干细胞传代至10代时仍具有很强的增殖能力，采用油红O和茜素红染色方法进一步证实，在不同的诱导条件下，其可分别向成脂和成骨方向分化。
结果说明稳定表达的绿色荧光蛋白未影响到骨髓间充质干细胞的多向分化潜能，可作为良好的示踪因子。
关键词：干细胞；骨髓干细胞；绿色荧光蛋白；骨髓间充质干细胞；转基因大鼠；细胞表型；成骨分化；成脂分化；辽宁省自然科学基金主题词：骨髓；间质干细胞；绿色荧光蛋白质类；大鼠，转基因摘要背景：转基因动物提取的间充质干细胞自身携带绿色荧光蛋白，与传统病毒、质粒转染相比，能在活细胞中稳定地表达，可较快筛选其修饰的细胞。
目的：观察绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。
方法：取2周龄的绿色荧光蛋白转基因大鼠双侧长骨骨髓，采用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞。
流式细胞术分析第5代绿色荧光蛋白阳性骨髓间充质干细胞的细胞表型，并分别加入成骨及成脂条件培养液进行体外多向诱导分化，采用茜素红钙盐染色和油红O染色进行鉴定。
结果与结论：成功获得了稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表达CD90和CD105，不表达或弱表达CD14和CD45。
经成骨诱导3周后茜素红染色可见有橘红色钙盐沉积，经成脂诱导3周后油红O染色见红色的脂滴。
活细胞成像的染色方法
活细胞成像的染色方法活细胞成像是一种通过染色技术观察和研究活体细胞结构和功能的方法。
染色可以使细胞的结构和分子组分在显微镜下更加清晰可见，从而帮助科学家深入了解细胞的内部机制。
本文将介绍几种常用的活细胞成像染色方法。
1. 荧光染色荧光染色是一种常见的活细胞成像技术，通过使用荧光染料标记细胞的特定分子，如细胞核、细胞器或细胞膜，可以在显微镜下直接观察到这些结构的位置和运动。
常用的荧光染料包括荧光素、罗丹明、荧光蛋白等。
荧光染色的优点是具有高灵敏度和高分辨率，可以实时观察细胞的动态过程。
2. 酶标染色酶标染色是一种利用酶反应来染色细胞的方法。
常用的酶标染色方法包括辣根过氧化物酶（HRP）染色和碱性磷酸酶（AP）染色。
这些酶可以与特定的底物发生反应产生可见的色素，从而标记细胞的特定结构或分子。
酶标染色的优点是具有较高的灵敏度和稳定性，适用于长时间观察细胞。
3. 核染色核染色是一种将细胞核染色以观察和分析细胞核结构和功能的方法。
常用的核染色方法包括使用荧光染料如荧光素、DAPI、Hoechst等。
这些染料可以与DNA结合，形成荧光标记，使细胞核在显微镜下呈现出蓝色或绿色荧光。
核染色可以帮助科学家观察细胞核的形态、数量和分布，从而了解细胞的生命周期和基因表达。
4. 细胞膜染色细胞膜是细胞的外包层，起到保护细胞内部结构和调节物质进出的作用。
为了观察和研究细胞膜的特点，科学家通常使用荧光染料如DiI、DiO、FM等来染色细胞膜。
这些染料可以与细胞膜中的脂质结合，形成荧光标记，使细胞膜在显微镜下呈现出绿色或红色荧光。
细胞膜染色可以帮助科学家观察细胞膜的形态、结构和动态变化。
总结起来，活细胞成像的染色方法有荧光染色、酶标染色、核染色和细胞膜染色等。
这些方法可以帮助科学家观察和研究细胞的结构和功能，从而深入了解细胞的内部机制。
随着技术的不断发展，越来越多的新型染料和标记方法的出现，将进一步推动活细胞成像技术的发展，为细胞生物学研究提供更加精确和全面的工具和方法。
荧光标记的纳米颗粒进入小鼠体内的活体成像实验
荧光标记的纳米颗粒进入小鼠体内的活体成像实验引言荧光标记的纳米颗粒在生物医学领域中具有广泛应用。
通过将荧光染料或荧光蛋白标记到纳米颗粒表面，可以实现对生物体内组织和细胞的高分辨率成像。
本文将介绍一种利用活体成像技术观察荧光标记的纳米颗粒进入小鼠体内的实验方法。
实验设计实验目的本实验旨在通过活体成像技术观察荧光标记的纳米颗粒在小鼠体内的分布和动态变化，以了解其在生物体内的行为。
实验步骤1.制备荧光标记的纳米颗粒：选择合适尺寸和表面性质的纳米颗粒，并将荧光染料或荧光蛋白与其结合，完成荧光标记。
2.小鼠模型制备：选择合适品系和年龄相近、健康状况良好的小鼠作为实验对象。
3.注射纳米颗粒：将荧光标记的纳米颗粒溶液注射到小鼠体内，选择合适的途径（如静脉注射、腹腔注射等）。
4.活体成像：使用荧光显微镜或活体成像系统对小鼠进行实时观察和记录，以获取纳米颗粒在小鼠体内的分布和动态变化信息。
5.数据分析：对活体成像数据进行处理和分析，包括图像处理、信号定量测量等。
实验工具与材料•荧光标记的纳米颗粒：选择合适尺寸和表面性质的纳米颗粒，并选择合适的荧光染料或荧光蛋白进行标记。
•小鼠模型：选择合适品系和年龄相近、健康状况良好的小鼠。
•注射器与针头：用于将纳米颗粒溶液注射到小鼠体内。
•荧光显微镜或活体成像系统：用于观察和记录小鼠体内纳米颗粒的分布和动态变化。
•数据处理软件：用于对活体成像数据进行处理和分析。
实验步骤详解1. 制备荧光标记的纳米颗粒在实验之前，需要选择合适尺寸和表面性质的纳米颗粒，并将荧光染料或荧光蛋白与其结合，完成荧光标记。
这一步骤可以通过化学合成、生物合成等方法完成。
2. 小鼠模型制备选择合适品系和年龄相近、健康状况良好的小鼠作为实验对象。
在实验之前，需要对小鼠进行适当的驯化和适应环境。
3. 注射纳米颗粒将荧光标记的纳米颗粒溶液注射到小鼠体内。
注射途径可以根据实验需要选择，常用的有静脉注射、腹腔注射等。
注射时需要注意剂量控制和注射速度。
活体生物荧光成像技术
活体生物荧光成像技术【前言】生命科学的发展始终紧密联系着技术的进步。
近年来，随着基因编辑技术、CRISPR-Cas9技术的逐渐成熟，活体生物荧光成像技术开始逐步受到人们的关注。
本文将结合实例，分享一些荧光成像技术的应用与发展趋势。
【荧光成像技术的介绍】荧光成像技术是指通过在生物体内或外部植入或表达荧光标记物，利用激发荧光信号及其发射光强度进行成像的一种手段。
利用比显微镜更灵敏的摄像设备及成像算法，研究者可以实时获取荧光标记物的分布、运动轨迹等信息，并对细胞、组织、器官等进行动态观察和分析。
荧光成像技术的发展历程可以追溯到上个世纪60年代。
当时，以Stanley Cohen和Martin Chalfie为代表的科学家们开发出了一种基于荧光蛋白GFP（绿色荧光蛋白）的标记方法，并发现这种蛋白质可以通过外源表达在生物体内发出明亮的绿光，因此被广泛应用于荧光成像领域。
从此，各种不同颜色的荧光蛋白被陆续开发出来，并成为荧光成像技术的重要组成部分。
【荧光蛋白与荧光标记】荧光蛋白是一类能够在生物体内自发发出荧光信号的特殊蛋白质。
不同种类的荧光蛋白具有不同的荧光颜色和激发波长，因此可以实现不同层次生物结构的荧光成像。
比如经典的GFP可以在植物、昆虫、小鼠等多种生物体内发出绿色荧光，mCherry则可以发出橙色荧光，Cerulean则可以发出蓝色荧光，这些荧光标记帮助研究者观察、研究生物体的结构与活动过程。
荧光蛋白通过基因工程技术被植入到目标细胞或生物体内，可以实现荧光标记。
除了荧光蛋白外，离子探针、染料、纳米粒子等也可以用来实现荧光标记，不同标记物的选择取决于应用场景的不同。
【荧光成像技术的应用】近年来，随着荧光成像技术的进一步发展，它的应用范围也逐渐扩大。
下面介绍几个常见的应用领域：1. 细胞机理研究：荧光成像技术能够帮助研究者观察和监测细胞内各种生物分子的分布、传递过程。
比如通过染色体染料荧光素（Hoechst）实现染色体着色，可以观察到染色体在细胞减数分裂时的运动轨迹，从而了解染色体运动的规律。
小动物活体成像技术的原理及操作方法
小动物活体成像技术的原理及操作方法小动物活体成像技术（In vivo Imaging）是一种非侵入性的影像学检测方法，能够实时观察小动物体内生物过程的变化。
这种技术被广泛应用于药物研发、疾病研究、肿瘤学以及神经科学等领域。
以下将详细介绍小动物活体成像技术的原理及操作方法。
原理：小动物活体成像技术主要依赖于生物标记物的发光或吸收特性，将其转化为可见光、近红外光或射线信号进行成像。
常见的活体成像方法包括生物发光成像（Bioluminescence Imaging, BLI）、荧光成像（Fluorescence Imaging, FLI）、放射性同位素成像（Radionuclide Imaging）以及磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）等。
生物发光成像是应用广泛的一种小动物活体成像技术。
其基本原理是使用生物荧光标记物的荧光发射来观察对象的生物过程。
一般情况下，研究者将荧光标记物（例如荧光蛋白）合成到感兴趣的生物分子（例如蛋白质或细胞）中，然后用荧光成像仪观察荧光发射。
这种方法由于操作简便、解析度高以及成本相对较低而得到广泛应用。
操作方法：1.设计实验：在进行活体成像前，研究者需要设计合适的实验方案。
这包括选择适合的动物模型、确定使用的荧光或射线标记物、考虑成像时间点以及确定成像区域等。
2.准备动物：在进行成像前，需要准备适当的小动物（如小鼠或兔子）并保证其健康状态。
动物应该经过严格的饲养和管理，以确保成像结果可靠。
3.注射标记物：根据实验设计，将合适的标记物注射到小动物体内。
标记物可以是荧光蛋白、放射性同位素或磁性荧光探针等。
注射可以通过尾静脉注射、腹腔注射或皮下注射等方式进行。
4.成像操作：根据实验需求使用相应的成像设备进行成像。
不同的成像技术有不同的操作要求，例如生物发光成像需要使用荧光成像仪，而放射性同位素成像则需要使用放射性同位素摄像机。
5.数据获取与分析：进行成像后，需要对获得的数据进行分析和解释。
荧光染料在细胞成像方面是如何运作
荧光染料在细胞成像方面是如何运作细胞成像是一种重要的生物学研究方法，在细胞结构和功能研究以及疾病治疗等领域具有广泛的应用。
为了使细胞在显微镜下可见并能够观察其内部结构和功能，科学家们广泛使用荧光染料来实现细胞成像。
荧光染料在显微镜下的使用可以提供更多有关细胞的信息，因此它已成为细胞成像中的重要工具。
荧光染料是一类分子，可吸收特定波长的光能量，并将其转化为辐射出发射具特定波长的光。
这种发射的光称为荧光，并且常常具有较长的波长。
荧光染料的化学结构决定了其吸收和发射特性，使得科学家能够通过对特定波长的光敏感地染色来标记细胞或特定细胞组分。
在细胞成像中，荧光染料通常被用来标记细胞中的特定结构、分子或细胞器。
例如，细胞核染色剂（如荧光素染剂）可用于标记细胞核，细胞质染色剂（如Rhodamine染剂）可用于标记细胞质，线粒体染色剂（如Mitotracker染剂）可用于标记线粒体。
荧光染料在细胞成像中的工作原理主要基于两个重要的特性：吸收和发射光。
当光与染料分子相互作用时，染料分子会吸收光的能量并转移到一个处于激发态的电子能级上。
然后，该电子经过一系列退激过程返回基态时，会释放出一定波长的光，即荧光。
为了观察细胞中的特定结构或分子，科学家们需要将荧光染料引入细胞内部。
一种常见的方法是使用细胞渗透性的荧光染料，在培养基中直接添加染料。
这些染料能够穿过细胞膜并与细胞内部的分子结合。
另一种常见方法是使用荧光标记的抗体。
抗体是一种特异性结合到目标蛋白质或分子上的蛋白质，而荧光标记的抗体则在抗体分子上结合了荧光染料。
当该抗体与目标分子结合时，荧光标记抗体所携带的荧光染料也被带入细胞内部，从而在显微镜下观察到目标分子的位置和表达量。
荧光染料选择应根据所需的研究目的和荧光成像技术来确定。
染料应具有高亮度和较长的荧光寿命，以提供更清晰的成像。
此外，染料的吸收和发射波长应与显微镜的过滤器系统相匹配，以最大程度地提高成像的灵敏度和分辨率。
小动物活体成像技术的原理及操作方法
2. 生物发光成像活体生物荧光成像技术是指在小的哺乳动物体内利用报告基因-荧光素酶基因表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、Mg2+离子存在的条件下消耗ATP发生氧化反应，将部分化学能转变为可见光能释放。
然后在体外利用敏感的CCD设备形成图像。
荧光素酶基因可以被插入多种基因的启动子，成为某种基因的报告基因，通过监测报告基因从而实现对目标基因的监测。
生物荧光实质是一种化学荧光，萤火虫荧光素酶在氧化其特有底物荧光素的过程中可以释放波长广泛的可见光光子，其平均波长为560 nm(460—630 nm)，这其中包括重要的波长超过600 nm的红光成分。
在哺乳动物体内血红蛋白是吸收可见光的主要成分，能吸收中蓝绿光波段的大部分可见光；水和脂质主要吸收红外线，但其均对波长为590—800 nm的红光至近红外线吸收能力较差，因此波长超过600 nm的红光虽然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳动物组织被高灵敏的CCD检测到。
生物发光成像的优点可以非侵入性，实时连续动态监测体内的各种生物学过程，从而可以减少实验动物数量，及降低个体间差异的影响；由于背景噪声低，所以具有较高的敏感性；不需要外源性激发光，避免对体内正常细胞造成损伤，有利于长期观察；此外还有无放射性等其他优点。
然而生物发光也有自身的不足之处：例如波长依赖性的组织穿透能力，光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性也不尽相同，其中血红蛋白是吸收光子的主要物质；由于是在体外检测体内发出的信号，因而受到体内发光源位置及深度影响；另外还需要外源性提供各种荧光素酶的底物，且底物在体内的分布与药动力学也会影响信号的产生；由于荧光素酶催化的生化反应需要氧气、镁离子及ATP等物质的参与，受到体内环境状态的影响。
二、小动物活体成像1. 制作动物模型可根据实验需要通过尾静脉注射、皮下移植、原位移植等方法接种已标记的细胞或组织。
利用荧光素酶标记的肿瘤细胞建立活体成像动物模型
中国体视学与图像分析2013年第18卷第1期CHINESE JOURNAL OF STEREOLOGY AND IMAGE ANALYSIS Vol．18No．1March201367文章编号:1007－1482(201301－0067－0072·生物医学·利用荧光素酶标记的肿瘤细胞建立活体成像动物模型张绘宇1,郑国兵2,张金栋2,刘启才2(1.广州医学院病理教研室,广州510182; 2.广州医学院实验医学研究中心,广州510182摘要:目的建立稳定表达荧光素酶的人乳腺癌细胞株并构建适用于小动物活体成像系统观察的裸鼠皮下移植瘤模型。
方法采用脂质体将携带荧光素酶基因的质粒转染到人乳腺癌细胞株MCF-7中,G418筛选出稳定表达荧光素酶的单克隆细胞株。
扩增后接种于裸鼠,建立裸鼠皮下移植瘤模型,通过活体动物成像系统监测肿瘤的生长过程。
结果获得了高水平稳定表达荧光素酶的乳腺癌单克隆细胞株,该单克隆细胞株与母细胞系MCF-7具有相似的生长特性。
将稳定表达荧光素酶的克隆接种于裸鼠皮下可成瘤,小动物活体成像系统能准确监测肿瘤细胞在体内的生长过程。
结论成功建立了稳定表达荧光素酶的乳腺癌单克隆细胞株。
采用活体动物成像系统构建的裸鼠皮下移植瘤模型是拓展肿瘤体内生长、转移及治疗相关研究的理想模型。
关键词:荧光素酶;生物发光;移植瘤;活体成像;裸鼠中图分类号:R73文献标识码:AEstablishment of a nude mouse model of in vivo bioluminescenceimaging generated by luciferase-labeled cancer cellsZHANG Huiyu1,ZHENG Guobin2,ZHANG Jindong2,LIU Qicai2(1.Department of Pathology,Guangzhou Medical College,Guangzhou510182,China;2.Experimental Medicine Research Center,Guangzhou MedicalCollege,Guangzhou510182,ChinaAbstract:Objective To establish a mouse model of in vivo bioluminescence imaging by subcutaneous inoculation of luciferase-labeled human breast cancer cells into nude mice．Methods Recombinant plas-mid containing luciferase gene was transfected into human breast cancer cell line MCF-7cells,and a mon-oclonal cell line stably expressing luciferase was screened out．The cultured cells were subcutaneously in-oculated into nude mice to establish mouse models of transplanted tumors,and the tumor growth was moni-tored by in vivo animal imaging system．Results A monoclonal cell line stably and highly expressing lu-ciferase was obtained．The cell line showed similar growth characteristics of the original human breast cancer cell line MCF-7cells．The cell clone stably expressing luciferase was subcutaneously inoculated in-收稿日期:2013-01-14基金项目:广东省自然科学基金(06301124作者简介:张绘宇(1964－,女(汉,河北廊坊人,副教授。
活体及细胞的荧光标记方法
活体及细胞的荧光标记方法下面以研究干细胞活体移植后的存活率为例，简介一两种内源性荧光色素标记的实验方法，供专业人士参考。
用荧光色素DiD标记间充质干细胞1. 先用胰蛋白酶消化待标记材料，使之成为一定密度的悬浮液；2. 从细胞培养箱中取出间充质干细胞，吸取含原有培养基的细胞悬浮液进行标记；3. 用10 ml Mg/Ca-free PBS （不含钙镁离子的磷酸缓冲液）清洗细胞，吸去PBS，钙镁离子会影响胰蛋白酶的活性，必须小心；4. 加入预热的0.05% 胰蛋白酶液，加液量以T75型瓶为例，每瓶加5ml，确保瓶的表面被完全覆盖；5. 在细胞培养箱中37° C 孵育约5 分钟；6. 然后在显微镜下确认细胞已经完全分散，如果有细胞贴壁情况，轻拍若干次或延长孵育时间直至酶解消化完全成功；7. 加入等量含10% FCS的培养基中和胰蛋白酶；8. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散；9. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中；10. 400 RCF离心5 分钟；11. 小心移去上清液，不要扰动细胞；12. 将细胞重新悬浮于DMEM 并进行计数；13. 需要待标记细胞在无血清DMEM溶液中的密度应为1x106 /ml ；14. 每ml细胞悬浮液加入5 µL DiD 染色液；15. 用移液器将染色液与细胞悬浮液混合均匀；16. 在6孔低附着性细胞板上37 °C 孵育20分钟；17. 孵育完全后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中；18. 400 RCF离心5 分钟；19. 小心移去染色液，不要扰动细胞；20. 用PBS清洗细胞，用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散；21. 重复洗三次；22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性；23. 可以进行活细胞成像了！用荧光色素ICG标记人胚胎干细胞（活体实验）1. 必须先准备好吲哚菁绿溶液（血容量、心输出量、肝功能测定剂）作为对照品，然后使之与转染试剂鱼精蛋白（抗凝血作用）混合；2. 测出1ml吲哚菁绿溶液的活力，然后在100 µL DMSO中溶解ICG；3. 向混合物中加入400 µL Dulbecco的改良Eagles 培养基(DMEM + 10% 胎牛血清)，震荡均匀，吲哚菁绿溶液终浓度为2mg/ml；4. 加入转染试剂鱼精蛋白，鱼精蛋白作为对照品的载体，使之能够有效进入细胞；5. 在300 µL ICG 和300 µL 无血清Dulbecco改良Eagles 培养基中混入5 µL 硫酸鱼精蛋白溶液, 使之终浓度为10mg/ml,；6. 震荡5分钟使之形成复合物，标记溶液制备完毕；7. 从hESC 10mm Petri 培养皿中移去原有培养基；8. 加入5ml预热的DMEM；9. 加入制备好的鱼精蛋白/ICG 溶液，37 °C下孵育1h；10. 孵育完全后移去染色液；11. 用5 ml PBS漂洗培养皿以清除染色液；12. 移去PBS 再加入5ml 0.25 % 胰蛋白酶液，37 °C下孵育5分钟使之酶解，适当震摇培养皿效果会更好；13. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散；14. 加入等量含10% KSR的培养基中和胰蛋白酶；15. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中，400 RCF 离心5 分钟；16. 在全培养基中悬浮细胞；17. 如果还有细胞团块，可以移去原有培养基用10ml预热的全ESC培养基重新悬浮细胞，重复酶解再离心；18. 在这一点上，鼠源饲喂细胞需从hESCs中分离；19. 然后将细胞悬浮液移至涂布琼脂的10 cm 培养皿中；20. 37 °C 孵育45 分钟，注意不要晃动培养皿，如此鼠源饲喂细胞会贴壁而干细胞保持悬浮；21. 从Petri 培养皿中移出已标记的单细胞人胚胎干细胞悬浮液；22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性；23. 可进行活细胞成像了。
萤火虫荧光素酶活体成像方法步骤
萤火虫荧光素酶活体成像方法步骤：
萤火虫荧光素酶活体成像方法步骤如下：
1.准备实验动物和标记荧光素酶的细胞：选择适当的实验动物，如小鼠或大鼠，并获取标记荧光素酶的细胞。
标记荧光
素酶的方法是将荧光素酶基因转染到目标细胞中，使细胞表达荧光素酶。
2.建立活体成像系统：建立适合实验动物大小的活体成像系统，如小动物全身成像系统或显微成像系统。
3.标记细胞的移植：将标记的细胞移植到实验动物的特定部位，如皮下、肌肉或器官中。
4.荧光素酶底物的给药：通过给药方式将荧光素酶底物（如荧光素）给予实验动物，使底物在细胞内代谢并发出荧光。
5.活体成像：在设定的时间点对实验动物进行荧光成像，记录荧光信号的变化。
荧光信号的强弱与标记细胞的数目和活
性有关。
6.数据分析和处理：对获得的荧光图像进行定量分析，计算标记细胞的数目、荧光强度等参数，并根据需要绘制时间-
荧光强度曲线或其他相关图表。
7.结论分析：根据数据分析结果，评估荧光素酶活体成像方法在生物学、药理学或医学研究中的应用价值，并针对具体
问题给出相应的结论和建议。
在活体成像中荧光色素标记细胞的方法举例
在活体成像中荧光色素标记细胞的方法举例活体成像是一种用于研究生物体内细胞行为的非侵入性技术。
活体成像技术的兴起为细胞研究提供了新的手段，其中一种重要的方法是利用荧光色素标记细胞。
本文将介绍几种常用的活体成像中荧光色素标记细胞的方法。
1.基因工程法基因工程法是目前最常用的标记细胞的方法之一、该方法通过将荧光蛋白基因导入到目标细胞中，使细胞具有自发产生荧光的能力。
其中最被广泛应用的蛋白是绿色荧光蛋白（GFP），它可将细胞内荧光定位在一些特定的位置或亚细胞结构。
2.荧光染料法荧光染料法是一种简单易行的细胞标记方法。
通过将具有荧光性质的染料与细胞结合，使细胞发出可见光。
经典的荧光染料如荧光素、罗丹明B等，这些荧光染料可通过染色剂注射、浸润或培养基培养等方式将其引入到细胞中，从而标记细胞。
3.生物标记法生物标记法是将树脂自由基耦合荧光染料和细胞表面的活性基位点进行共价偶联的一种方法。
该标记方法可以使荧光染料稳定地结合在细胞表面，从而实现标记细胞的目的。
较为常用的生物标记剂是胶原酶，它可通过与细胞表面的胺基进行反应，使荧光染料稳定地结合在细胞表面。
4.先导物标记法先导物标记法是指将带有活性团的先导物与细胞结合，通过先导物被细胞内酶催化后形成具有荧光的产物，从而实现细胞标记的方法。
例如，酯酮酸类活性酯可以与细胞内的酶发生酶促反应产生荧光化合物，该方法可以直接标记胞质内存在的酶分子或表面含有酶的细胞。
5.神经元标记法神经元是生物体中最为复杂的细胞类型之一，研究神经元的功能与行为对于理解大脑功能具有重要意义。
神经元标记法是一种将荧光染料注入神经元的方法，使神经元发出荧光以便观察其活动。
其中一种常用的神经元标记方法是用含有荧光标记物的载体注射至大脑组织中，荧光标记物会被特异性地吸附在神经元膜上，从而实现神经元活体成像。
总之，活体成像中的荧光色素标记细胞的方法多种多样，每种方法都有其适用的细胞类型和实验需求。
这些方法的发展为细胞活体成像研究提供了有力的工具，为我们更好地了解和研究细胞的功能和行为提供了便利。
通过活体荧光成像技术研究生物系统
通过活体荧光成像技术研究生物系统活体荧光成像技术是一种非侵入式的活体成像技术，它使用荧光蛋白对生物体进行实时成像，能够提供三维空间信息和时间动态信息。
该技术已被广泛应用于生物学研究、药物研发和医学诊断中。
活体荧光成像技术的基本原理是将荧光蛋白基因转染到生物体内，使细胞或组织发生荧光，然后利用高灵敏度的相机对荧光成像进行记录和分析。
常用的荧光蛋白有EGFP、mCherry、tdTomato等，它们分别对应绿色、红色和橙色荧光。
活体荧光成像技术可以用于研究许多生物系统，例如细胞、组织、器官和整个生物体。
下面我们来看几个具体的应用案例。
第一个案例是对小鼠神经系统的研究。
神经元是生物体中最复杂的细胞类型之一，其功能和调控方式还有待进一步探索。
利用活体荧光成像技术，研究人员可以将荧光蛋白基因转染到小鼠神经元中，实时观察神经元的结构和功能。
例如，研究人员可以观察到神经元之间的连接方式、神经元的突触传递、神经元的兴奋性等信息，从而深入了解神经系统的工作原理。
第二个案例是对肿瘤的研究。
肿瘤是一种生物系统，其发生和发展涉及到复杂的细胞信号传递、细胞增殖和细胞凋亡等基本过程。
活体荧光成像技术可以使研究人员观察到活体内的肿瘤细胞和血管分布情况，了解肿瘤的生长和侵袭方式以及其对周围组织的影响。
例如，研究人员可以使用活体荧光成像技术观察肿瘤细胞中的荧光信号随着治疗时间的变化，进而评估治疗的效果。
第三个案例是对心脏系统的研究。
心脏是人类身体中最重要的器官之一，其结构和功能非常复杂。
利用活体荧光成像技术，研究人员可以观察到心脏血管、心肌细胞以及心脏神经元的活动情况，深入了解心脏系统的调控方式和心脏疾病的机制。
例如，研究人员可以使用荧光蛋白标记血管内皮细胞，从而观察到血管壁的生长、血管收缩和扩张以及血液流动速度等信息。
综合以上案例，我们可以看到活体荧光成像技术在生物学中的广泛应用。
该技术通过荧光蛋白标记生物体内的分子和细胞，实现了对生物系统的实时成像和分析，有助于深入了解生物体内神经、心血管和肿瘤系统等复杂生物现象的机理和调控方式。
PE小动物活体成像在干细胞研究中的应用
小动物活体光学成像技术在干细胞研究中的应用PerkinElmer小动物活体光学成像技术已在生命科学基础研究、临床前医学研究及药物研发等领域得到广泛应用。
在众多应用领域中，干细胞研究是活体光学成像技术的应用热点之一。
在活体光学成像实验中，常用于干细胞光学标记的方法包括：1、利用萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）作为报告基因，通过转基因技术体外转染干细胞；2、通过亲脂性荧光染料直接标记干细胞；3、从已构建好的生物发光转基因动物中提取干细胞，所提取干细胞即具备生物发光特性。
总体来说，应用小动物活体光学成像技术进行干细胞研究主要集中于以下几个方面：1、监测干细胞的移植、存活和增殖；2、示踪干细胞在体内的分布和迁移；3、多能诱导干细胞、肿瘤干细胞等新兴研究。
下面结合一些具体实例进行阐述：一.监测干细胞的移植、存活和增殖干细胞移植在治疗心肌缺血、脊髓损伤、关节炎等多种疾病中发挥重要作用。
但是迄今为止，科学家对干细胞在体内的存活时间和增殖规律并未完全了解，而缺少有效的技术手段是其中一个重要限制因素。
活体光学成像技术可以长期连续监测干细胞在活体动物体内的存活及增殖规律，为干细胞的研究提供了全新的技术支持。
以下为应用生物发光成像技术观测干细胞在活体动物体内存活和增殖的具体实例：造血干细胞移植是现代生命科学的重大突破，通过移植造血干细胞可以治疗恶性血液病，部分恶性肿瘤，部分遗传性疾病等多种致死性疾病。
之前对于造血干细胞的异体移植研究主要依靠流式细胞仪分析从处死的受体动物中提取的骨髓。
这种方法虽然能够准确测量造血干细胞的移植存活率，但存在诸多缺陷：如需处死大批实验动物；无法反映除骨髓之外其他部位发生的造血重组情况；数据获取只局限于处死动物后的单一时间点，无法对同一个体的移植情况进行连续纵向观测。
生物发光成像技术很好的解决了上述问题。
发表于2003年Blood杂志上的一篇文献首次利用了生物发光技术进行干细胞异体移植的研究。
活体动物体内生物发光和荧光成像技术
活体动物体内生物发光和荧光成像技术基础原理与应用简介文章来自中国生物器材网文章目录：一、活体生物发光成像技术二、活体动物荧光成像技术三、生物发光成像与荧光成像的比较四、活体动物可见光成像仪器原理与操作流程活体动物体内成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。
活体动物体内成像技术主要分为可见光成像(optical imaging)、核素成像（radio-nuclear imaging）、核磁共振（magnetic resonance imaging ，MRI）成像和超声（ultrasound）成像、计算机断层摄影（computed tomography ，CT）成像五大类，其中可见光成像和核素成像特别适合研究分子、代谢和生理学事件，通常称为功能成像；超声成像和CT则适合于解剖学成像，通常称为结构成像。
功能成像与结构成像比较，前者更能够反映细胞或基因表达的空间和时间分布，从而了解活体动物体内的相关生物学过程、特异性基因功能和相互作用。
所以，活体动物体内功能成像技术可用于观察和追踪靶细胞、基因的表达，同时检测多种分子事件，优化药物和基因治疗方案，从分子和细胞水平对药物疗效进行观察，从整体动物水平上评估疾病发展过程，对同一个动物进行时间、环境、发展和治疗影响跟踪。
由于功能成像的诸多优势，这项技术广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面，本文重点介绍活体动物可见光成像技术。
体内可见光成像(optical in vivo imaging)技术主要包括生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence)成像两种技术。
生物发光成像是用荧光素酶(luciferase)基因标记细胞或DNA，利用其产生的蛋白酶与相应底物发生生化反应产生生物体内的探针光信号；而荧光成像则是采用荧光报告基因（如GFP、RFP）或Cyt及dyes等荧光染料进行标记，利用荧光蛋白或染料产生的荧光就可以形成体内的荧光光源。
体内抑制实验流程
体内抑制实验流程活体生物发光成像技术的原理：在小型哺乳动物体内利用报告基因（荧光素酶基因）表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、Mg存在的条件下消耗ATP2+发生氧化还原反应，将部分化学能转化为可见光能释放。
因此只有在活细胞内才会发生发光现象。
并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。
一、材料准备1.动物：裸鼠9只，6～8周龄，雄性；C57小鼠24只，6～8周龄，雄性；动物均为自由饮水采食。
2.细胞：MDA-MB-231人乳腺癌细胞系，使用荧光素酶基因标记。
方法：用荧光素酶报告基因标记的质粒转染人乳腺癌细胞，共转染的还有选择性标记基因，从而保证转染细胞的稳定性，形成表达荧光素酶的肿瘤细胞株；B16黑色素瘤细胞。
二、实验步骤1.紫杉醇混合胶束的制备（1）将适量紫杉醇溶解在少量无水乙醇和丙二醇的混合溶剂中.（2）加入适当比例的磷脂和表面活性剂A进行充分混合，制得稳定的紫杉醇混合胶束前体制剂，载药浓度为6 g/L。
（3）临用时按剂量加入生理盐水中稀释、摇匀后即可使用。
制剂体系的粒径大小与分布特征采用动态激光光散射粒度仪检测。
2.MDA-MB-231人乳腺癌细胞荷瘤鼠模型的建立（1）培养荧光素酶基因标记的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系，使用DMEM培养基（添加10%胎牛血清），37℃、5%CO2培养箱中培养，每3天传代1次。
（2）待细胞密度为80%～90%、细胞总量达到实验所需要求时，使用胰酶消化，收集于PBS溶液重悬。
（3）如有需要，在细胞培养一定时间后，应使用抗生素Zeocin 进行抗性筛选，保证荧光素酶基因的表达量足够。
（4）收集细胞，使用PBS稀释至细胞数1.5×10/mL，接种于裸鼠腋下，每只裸鼠的接8种量为0.1 mL。
3.动物活体成像检测（1）接种后将裸鼠随机分为3组，分别为生理盐水组、紫杉醇注射液组、紫杉醇混合胶束制剂组，每组3只。
（2）肿瘤接种后第8天开始给药，剂量为15 mg/kg，每3天腹腔注射给药1次。
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本实验技术来源于SciMall科学在线
在活体成像中荧光色素标记细胞的方法举例
活体光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光（bioluminescence）技术与荧光（fluores cence）技术。
生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，今天，生物发光标记物可以标记到任何一种基因上，使对基因功能的全面细致研究成为现实。
而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RF P, Cyt及dyes等）进行标记，利用荧光蛋白在外源光源或是内源发光照射下被激发产生的荧光作为检测信号。
研究人员能够利用一套非常灵敏的光学检测仪器直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。
该技术可被广泛应用于标记细胞或基因的示踪及检测；基因治疗在活体动物体内直接的观察和检测；基因组、蛋白组学、药学及生物技术在活体动物内的研究；药物及化学合成药物的药物代谢及毒理学监测；食品菌落生长成像；皮肤医学中皮肤疾病的体内成像；法医鉴定；微孔板成像，例如：免疫分析、报告基因、基因探针和嗜菌作用分析等；荧光团的体内成像，例如：Alzheimer疾病研究中结合嗪的β-淀粉沉淀物分析；转基因植物中通过报告基因对生理周期节奏的研究；凝胶成像分析等等。
但在研究过程中，研究者们必须事先用基因技术进行荧光素酶基因标记，或者某种荧光报告基团标记。
目前活体光学成像系统的知名制造商，如Berthold、GE、Xenogen、Photometrics、Carestream Health 等，不仅为客户提供先进的仪器，也提供具体实验所需的整套解决方案，包括试剂、实验手册、特殊用途的质粒、细胞株、转基因动物、细胞处理和动物处理设施等配套技术支持。
出色的多任务处理能力，人性化的整体设计，便捷精确的操作系统，使实验室影像分析领域进入了一个全新的时代
下面以研究干细胞活体移植后的存活率为例，简介一两种内源性荧光色素标记的实验方法，以供参考。
一、用荧光色素DiD标记间充质干细胞
1. 先用胰蛋白酶消化待标记材料，使之成为一定密度的悬浮液；
2. 从细胞培养箱中取出间充质干细胞，吸取含原有培养基的细胞悬浮液进行标记；
3. 用10 ml Mg/Ca-free PBS （不含钙镁离子的磷酸缓冲液）清洗细胞，吸去PBS，钙镁离子会影响胰蛋白
酶的活性，必须小心；
4. 加入预热的0.05% 胰蛋白酶液，加液量以T75型瓶为例，每瓶加5ml，确保瓶的表面被完全覆盖；
5. 在细胞培养箱中37° C 孵育约5 分钟；
6. 然后在显微镜下确认细胞已经完全分散，如果有细胞贴壁情况，轻拍若干次或延长孵育时间直至酶解消化完全成功；
7. 加入等量含10% FCS的培养基中和胰蛋白酶；
8. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散；
9. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中；
10. 400 RCF离心5 分钟；
11. 小心移去上清液，不要扰动细胞；
12. 将细胞重新悬浮于DMEM 并进行计数；
13. 需要待标记细胞在无血清DMEM溶液中的密度应为1x106 /ml ；
14. 每ml细胞悬浮液加入5 µL DiD 染色液；
15. 用移液器将染色液与细胞悬浮液混合均匀；
16. 在6孔低附着性细胞板上37 °C 孵育20分钟；
17. 孵育完全后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中；
18. 400 RCF离心5 分钟；
19. 小心移去染色液，不要扰动细胞；
20. 用PBS清洗细胞，用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散；
21. 重复洗三次；
22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性；
23. 可以进行活细胞成像了！
二、用荧光色素ICG标记人胚胎干细胞
1. 必须先准备好吲哚菁绿溶液（血容量、心输出量、肝功能测定剂）作为对照品，然后使之与转染试剂鱼精蛋白（抗凝血作用）混合；
2. 测出1ml吲哚菁绿溶液的活力，然后在100 µL DMSO中溶解ICG；
3. 向混合物中加入400 µL Dulbecco的改良Eagles 培养基(DMEM + 10% 胎牛血清)，震荡均匀，吲哚菁绿溶液终浓度为2mg/ml；
4. 加入转染试剂鱼精蛋白，鱼精蛋白作为对照品的载体，使之能够有效进入细胞；
5. 在300 µL ICG 和300 µL 无血清Dulbecco改良Eagles 培养基中混入5 µL 硫酸鱼精蛋白溶液, 使之终浓度为10mg/ml,；
6. 震荡5分钟使之形成复合物，标记溶液制备完毕；
7. 从hESC 10mm Petri 培养皿中移去原有培养基；
8. 加入5ml预热的DMEM；
9. 加入制备好的鱼精蛋白/ICG 溶液，37 °C下孵育1h；
10. 孵育完全后移去染色液；
11. 用5 ml PBS漂洗培养皿以清除染色液；
12. 移去PBS 再加入5ml 0.25 % 胰蛋白酶液，37 °C下孵育5分钟使之酶解，适当震摇培养皿效果会更好；
13. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散；
14. 加入等量含10% KSR的培养基中和胰蛋白酶；
15. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中，400 RCF离心5 分钟；
16. 在全培养基中悬浮细胞；
17. 如果还有细胞团块，可以移去原有培养基用10ml预热的全ESC培养基重新悬浮细胞，重复酶解再离心；
18. 在这一点上，鼠源饲喂细胞需从hESCs中分离；
19. 然后将细胞悬浮液移至涂布琼脂的10 cm 培养皿中；
20. 37 °C 孵育45 分钟，注意不要晃动培养皿，如此鼠源饲喂细胞会贴壁而干细胞保持悬浮；
21. 从Petri 培养皿中移出已标记的单细胞人胚胎干细胞悬浮液；
22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性；
23. 可进行活细胞成像了！
与本实验技术相关的试剂（点击名称查看详细信息）：
普通胎牛血清
优级胎牛血清
特级胎牛血清
基础培养基
细胞株/细胞系。