活体成像

Sig/bkg = 250
Sig/bkg ~ 1
Min detection ~ 102 cells
Min detection ~ 106 cells
VEGFR-2在伤口愈合过程中的诱导表达
小鼠体内一发光点的三维整合图象
0o
700
45o
700
90o
700
135o
1400
1400
1400
4000
700
180o
225o
270o
315o
三维成像表面以彩色显示荧光对数值
生物发光检测与荧光检测的比较
Bioluminescence
2107
Fluorescence 生物发光在体内检测的 7107 灵敏度远远高于荧光
Stem Cell Research 干细胞研究的应用
研究干细胞造血作用
80 70 60 50 40 30 20 10 0 Total leukocytes Granulocytes B cells T cells
Cao et al, Stanford University School of Medicine, PNAS, 2004
R. Paulmurugan, et al, University of California, PNAS, 2002
活体动物体内观察细胞凋亡
Caspase-3 site
I
I
I
LUC
I
LUC
Caspase-3 activation
Caspase site
Induction of apoptosis
Oncology Applications 癌症研究的应用
体内药物分析的生物发光检测
1x106 ，PC-3M-Luc肿瘤细胞，皮下注射 14天 小鼠 #6 21天 28天 35天
处理方式 细胞数 无治疗对照 2.2x109
n=7
小鼠 #40 n=8 (从第11天开始给药)
5- FU治疗 2.8x108
103
103
102
102
0
1 10
number of cells / animal 2 3 4 10 10 10
5 10
101
101
100 0
5 100 101 102 103 104 10
100
细胞数
3 4 4 5x104 2x10 5x104
荧光强度与标记细胞数目呈线性相关
2x103
Images courtesy of Contag et al, Stanford University
活体生物体内成像技术 In Vivo Imagine Technology
国家生物医学分析中心
活体生物体内检验是生物研究的最终验证
体外试验 （In Vitro）
分子生物学技术 克隆技术 蛋白组学 等等…
体内反应 （In Vivo）
研究方法受体内环 境制约，很难准确 反映体内情况
体外检验 （ Ex Vivo）
标准图像的组成
传统肿瘤模型
当前肿瘤研究的主 要方法还主要局限于肉 眼观察、处死老鼠后的 肿瘤体积测量、称重及 组织学切片观察等。
传统实验方法与活体成像方法比较
核磁共振与活体成像技术比较
安慰剂作 用天数
生物发 光强度
结果显示：肿瘤的大体积与生物发光强度呈线性相关
Brian Ross, Ph.D. University of Michigan Medical center.
Computed Tomography,SPECT)
核磁共振（Magnetic Resonance Imaging ，MRI） 可见光及荧光成像(Optical Imaging with visible light and Fluorescence）--生物发光 （Bioluminescence）与荧光（Fluorescence）
一次荧光素能保持小鼠体内荧光素酶标记的细胞发光 30-45分钟。每次荧光素酶催化反应只产生一个光子， 这是肉眼无法观察到的，先进的成像系统，应用一个高 度灵敏的制冷CCD相机及特别设计的成像暗箱和成像软 件，可观测并记录到这些光子。
荧光素酶的表达（2）：细菌荧光素酶 （Photorhabdus luminescens）
同样条件， 荧光在体内只 能最少检测到 1,000,000个 细胞
2107
利用精诺真技 术，生物发光 在体内检测的 灵敏度可达到 100个细胞
107 cells PC3M-luc/DsRed
Sig/bkg = 2200 Sig/bkg = 5
2106
106
cells PC3M-luc/DsRed
发光
Laxman et al, University of Michigan Medical School, PNAS 2002
TRAIL激活Caspase 3的体内成像
Laxman et al, University of Michigan Medical School, PNAS 2002
Transgenic Animal Model (LPTATM Animal) 转基因动物模型的应用
Promoter luxA luxB luxC luxD luxE
发光
luciferase
Decanal + FMNH2
Lux operon
活体成像系统
生物学
物理学
软件
标记基因 成像 数据分析
Living Image ®成像及数据分析软件
IVIS®50 Imaging System
在波长大于600nm时，由老鼠体内发出的光是可 以穿透皮肤被检测到。
小鼠体内平均光子数/秒 (x105)
4 10
4 10
活体成像技术的主要应用
• 癌症及药物研究
• 病毒学及基因治疗
• 干细胞
• 细胞凋亡 • 蛋白质相互作用 • siRNA研究的应用
B16-F10 luc+ 肿瘤细胞尾部 静脉注射后2分钟的成像
• 转基因动物模型
• 其它…
免疫学、代谢、发育、内分泌学， 等等…
siRNA 阻断RNA 研究的应用
当共转染 pGL3-luc 或HCV-luc 表达载体特异的 siRNA时， 可抑制报告基因Luciferase的表达
抑制荧光素酶 (pGL3-control)
抑制丙型肝炎病毒 (pShh1-Ff1)
McCaffrey et al, Stanford University School of Medicine, Nature, 2002
●遗传学标记
精诺真活体成像系统原理
理想的光源：萤火虫或细菌荧光素酶（luciferase）
●实时、原位 ●多波长检测
标记癌细胞 标记细菌
标记转基因鼠
基因、细胞、活体都可被荧光素酶基因标记。
基因、细胞和活体动物都 可被荧光素酶基因标记。标记 细胞的方法基本上是通过分子
生物学克隆技术, 将荧光素酶
的基因插到预期观察的细胞的
小鼠 #31 n=8 (从第11天开始给药)
丝裂酶素治疗 3.6x106
检测体内药物治疗
1x106 ，PC-3M-Luc肿瘤细胞，皮下注射
静脉注射治疗起始点 生 物 发 光 数 对照 n=5-8 丝裂酶素C n=4-8 5-FU n=8 (5-氟尿嘧啶)
实验天数
Exp #049 雄性SCID小鼠
生物发光检测体内药物治疗的复发作用
5x105 ，PC3M-Luc-C6肿瘤细胞，原位前列腺癌模型
1周
生理盐水对照组 （小鼠#40） 静注，3次/周， 第二、三周 5-Fu治疗组 (小鼠#38) 100 mg/kg 静注，1次/周， 第二、三、四周 丝裂酶素治疗组 （小鼠#4） 2mg/kg 静注，3次/周， 第二、三周
3周
5周
7周
8周
活体内蛋白质-蛋白质之间的相互作用
蛋白A 蛋白B 相互作用 蛋白A 蛋白B
+
Luc N端 Luc C端
Luciferase
发光

LUC N端 与 C端 分开时并不发光 蛋白质A 与蛋白质B 分别与LUC N端 和 C端 连接 两组蛋白质由不同的质粒诱导表达
Paulmurugan, et al, University of California, PNAS ,2002
对照组于第 五周结束观 察
生物发光强度
n=13
n=6/7
Exp #081 雄性nu/nu CR n=13,5,7
实验性骨转移瘤模型
皮下注射PC-3M-Luc
第20天
组织病理学观察
Virology Applications 细菌及病毒学研究应用
以及在以DNA为基础的基因治疗研究的应用
不同肺炎链球菌菌株感染模式研究
生物发光光子数与肿瘤体积呈正相关
1x106 ，PC-3M-Luc肿瘤细胞，皮下注射
平 均 光 子 数 对 数 值
平均肿瘤体积
精诺真具有高度灵敏性
细胞培养中平均光子数/秒 (x103)
number of cells / well 0 2 5 10
可精确观 察到100个 细胞
3 1x10 5x103
单纯疱疹病毒(HSV )在 干扰素(IFN) 受体敲除小鼠的感染实验
Wild-type
1 2 3 4
.
1
IFNgR-/2 3 4
1
2
3
4
1
2
3
4
IFNabR-/-
IFNabgR-/-
Luker et al, Washington University School of Medicine, J. Virol., 2003
转基因动物模型原理
生物大分子合成
基因激活 表达 生物发光
研究者可通过观察动物模型的生物发光，判断 靶基因是否表达，既基因的“开”“关”现象。
转基因动物研究原理
血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）是VEGF的同 源受体，VEGF在血管生成过程中分泌。Vegfr2-luc转基 因小鼠应用从小鼠VEGFR2基因启动子及内皮细胞特异的 增强子共4.5kb，以驱动荧光素酶表达。
染色体内，通过单克隆细胞技
术的筛选, 培养出能稳定表达
荧光素酶的细胞株。
荧光素酶的表达（1）
启动子
体内表达
将荧光素酶基因连接于启动子下游，稳定整 合到细胞染色体内，使荧光素酶得到持续表 达。
外源注入底物
活跃细胞
染色体
体内发光
Luciferin
荧光素酶的底物—荧光素，为约280道尔顿的小分
子。荧光素脂溶性非常好, 很容易透过血脑屏障。注射
通过观察发育过程中,VEGFR2-Luc转基因小鼠的 VEGFR2表达逐渐降低,研究生物体的发育过程。
信 号 强 度
Ning Zhang et al, Xenogen Corporation, BLOOD, 2004
已知，VEGFR2启动子活性在肿瘤坏死区域的血管内 皮细胞中可被上调。Vegfr2-luc报告基因的活性可在皮肤 创伤治愈过程中被诱导及在肿瘤特异的新血管形成中有潜 在功能。
24
D39Xen7 1.0 ×107
48
72
96hrs
2500
2000
A66.1Xen10 1.0 ×107
1500
1000
TIGR4Xen35 1.0×108
500
Orihuela CJ, St. Jude Children's Research Hospital, Scand J Infect Dis., 2003

几种常用活体体内成像技术的比较
Ultrasound 超声 Optical Imaging 可见光成像
操作简单
操作复杂
CT
MRI 核磁共振
PET/SPET 正电子衍射
结构成像
功能成像
活体成像系统
--专门为检测活体动物体内发光而设计的技术
生物体内成像系统 使研究人员能够直接监 控活体生物体内的细胞 活动和基因行为。
PCR 电泳 组织病理学 肿瘤称量
活体生物体内成像
等等…
（ In Vivo Imaging Technology）
目前的活体生物体内成像技术和方向


超声（Uቤተ መጻሕፍቲ ባይዱtrasound） 计算机断层摄影（Computed Tomography ，CT） 正电子衍射成像（Positron-Emission Tomography，PET） 单光子衍射(Single-Photon-Emission