活体生物发光成像技术
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活体生物发光成像技术
——A549-luc小鼠肺癌移植瘤模型 ——A549-luc小鼠肺癌移植瘤模型 A549
武 烨
2011.06.16
1
活体生物发光成像技术 (Optical in vivo Imaging)
生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence); 生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence); (bioluminescence)与荧光 荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA; 荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA; 荧光报告集团(GFP, Cyt及dyes等 进行标记。 荧光报告集团(GFP, RFP, Cyt及dyes等)进行标记。 荧光照相机(charge 荧光照相机(charge coupled device camera, CCD camera) 及其分析软件和作为报告子的荧光素酶(lsuciferae) 及其分析软件和作为报告子的荧光素酶(lsuciferae)和 荧光素(luciferin)组成。 荧光素(luciferin)组成。 优点： 优点： • 无创性； 无创性； • 可多次重复在不同时间点检测； 可多次重复在不同时间点检测； • 快速扫描成像； 快速扫描成像； • 实验动物整体成像。 实验动物整体成像。
(A549/A549建立移植瘤模型 (A549/A549-luc)
裸鼠皮下移植瘤模型： 620± 裸鼠皮下移植瘤模型：nude mice, 6-7 w, 20±2 g, female; i.p. 105×106 /200 µl PBS; n=3; 150 µl /只(30 mg/ml), i.p., 10l l 后活体成像;QWK, w。 25 min 后活体成像;QWK, 4 w。 SCID鼠尾静脉移植瘤模型 鼠尾静脉移植瘤模型： 620± SCID鼠尾静脉移植瘤模型：SCID mice, 6-7 w, 20±2 g, female.; 5×106 /200 µlPBS; n=3; 150 µl /只(30 mg/ml), 5× lPBS; l lPBS i.p., 10-25 min 后活体成像;Q3D, 4 w。 后活体成像;Q3D, w。 i.p. 10原位成瘤及转移观察： 原位成瘤及转移观察：S.C. mice will be euthanized and i.v. euthanized collected tumor on D26; i.v. mice will be euthanized and collected lung, brain, heart, liver and ovaries on D30. HE 4 staining.
7
实验过程
结果3 A549及A549-luc细胞原位成瘤及转 结果3： A549及A549-luc细胞原位成瘤及转 移能力的病理形态学观察
尾静脉接种模型脏器HE(20× 尾静脉接种模型脏器HE(20×) HE(20
பைடு நூலகம்
8
9
3
光学原理
实验过程
构建单克隆细胞株A549构建单克隆细胞株A549-luc A549
Pgl4.17[luc2/neo]质粒转染人非小细胞肺癌细胞株A549 Pgl4.17[luc2/neo]质粒转染人非小细胞肺癌细胞株A549 质粒转染人非小细胞肺癌细胞株 筛选抗性细胞及单克隆化 获得稳定表达荧光素酶的A549 luc细胞 A549获得稳定表达荧光素酶的A549-luc细胞
2
技术原理
标记原理
氧化反应：Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达 氧化反应：Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达 基因整合到细胞染色体DNA 荧光素酶， 外源（腹腔或静脉注射） 荧光素酶，当 外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧 光素(luciferin) 即可在几分钟内产生发光现象。 光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。 反应条件： 反应条件：ATP, O2。 光的强度与标记细胞的数目线性相关。 光的强度与标记细胞的数目线性相关。 分子生物学克隆技术：基因插入——单克隆细胞筛选— ——单克隆细胞筛选 分子生物学克隆技术：基因插入——单克隆细胞筛选— 稳定表达细胞株。 —稳定表达细胞株。 检测波长范围：400nm荧光 检测波长范围：400-950 nm荧光 最少可检测到皮下500 500个细胞 最少可检测到皮下500个细胞 相同深度检测到发光强度和细胞的数量有较好的线性 关系
实验过程
结果1 结果1：裸鼠皮下移植瘤模型的建立
5
实验过程
结果2 SCID鼠静脉移植瘤模型的建立 结果2：SCID鼠静脉移植瘤模型的建立
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实验过程
结果3 A549及A549-luc细胞原位成瘤及转 结果3： A549及A549-luc细胞原位成瘤及转 移能力的病理形态学观察
皮下瘤HE(20× 皮下瘤HE(20×) HE(20
——A549-luc小鼠肺癌移植瘤模型 ——A549-luc小鼠肺癌移植瘤模型 A549
武 烨
2011.06.16
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活体生物发光成像技术 (Optical in vivo Imaging)
生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence); 生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence); (bioluminescence)与荧光 荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA; 荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA; 荧光报告集团(GFP, Cyt及dyes等 进行标记。 荧光报告集团(GFP, RFP, Cyt及dyes等)进行标记。 荧光照相机(charge 荧光照相机(charge coupled device camera, CCD camera) 及其分析软件和作为报告子的荧光素酶(lsuciferae) 及其分析软件和作为报告子的荧光素酶(lsuciferae)和 荧光素(luciferin)组成。 荧光素(luciferin)组成。 优点： 优点： • 无创性； 无创性； • 可多次重复在不同时间点检测； 可多次重复在不同时间点检测； • 快速扫描成像； 快速扫描成像； • 实验动物整体成像。 实验动物整体成像。
(A549/A549建立移植瘤模型 (A549/A549-luc)
裸鼠皮下移植瘤模型： 620± 裸鼠皮下移植瘤模型：nude mice, 6-7 w, 20±2 g, female; i.p. 105×106 /200 µl PBS; n=3; 150 µl /只(30 mg/ml), i.p., 10l l 后活体成像;QWK, w。 25 min 后活体成像;QWK, 4 w。 SCID鼠尾静脉移植瘤模型 鼠尾静脉移植瘤模型： 620± SCID鼠尾静脉移植瘤模型：SCID mice, 6-7 w, 20±2 g, female.; 5×106 /200 µlPBS; n=3; 150 µl /只(30 mg/ml), 5× lPBS; l lPBS i.p., 10-25 min 后活体成像;Q3D, 4 w。 后活体成像;Q3D, w。 i.p. 10原位成瘤及转移观察： 原位成瘤及转移观察：S.C. mice will be euthanized and i.v. euthanized collected tumor on D26; i.v. mice will be euthanized and collected lung, brain, heart, liver and ovaries on D30. HE 4 staining.
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实验过程
结果3 A549及A549-luc细胞原位成瘤及转 结果3： A549及A549-luc细胞原位成瘤及转 移能力的病理形态学观察
尾静脉接种模型脏器HE(20× 尾静脉接种模型脏器HE(20×) HE(20
பைடு நூலகம்
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光学原理
实验过程
构建单克隆细胞株A549构建单克隆细胞株A549-luc A549
Pgl4.17[luc2/neo]质粒转染人非小细胞肺癌细胞株A549 Pgl4.17[luc2/neo]质粒转染人非小细胞肺癌细胞株A549 质粒转染人非小细胞肺癌细胞株 筛选抗性细胞及单克隆化 获得稳定表达荧光素酶的A549 luc细胞 A549获得稳定表达荧光素酶的A549-luc细胞
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技术原理
标记原理
氧化反应：Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达 氧化反应：Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达 基因整合到细胞染色体DNA 荧光素酶， 外源（腹腔或静脉注射） 荧光素酶，当 外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧 光素(luciferin) 即可在几分钟内产生发光现象。 光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。 反应条件： 反应条件：ATP, O2。 光的强度与标记细胞的数目线性相关。 光的强度与标记细胞的数目线性相关。 分子生物学克隆技术：基因插入——单克隆细胞筛选— ——单克隆细胞筛选 分子生物学克隆技术：基因插入——单克隆细胞筛选— 稳定表达细胞株。 —稳定表达细胞株。 检测波长范围：400nm荧光 检测波长范围：400-950 nm荧光 最少可检测到皮下500 500个细胞 最少可检测到皮下500个细胞 相同深度检测到发光强度和细胞的数量有较好的线性 关系
实验过程
结果1 结果1：裸鼠皮下移植瘤模型的建立
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实验过程
结果2 SCID鼠静脉移植瘤模型的建立 结果2：SCID鼠静脉移植瘤模型的建立
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实验过程
结果3 A549及A549-luc细胞原位成瘤及转 结果3： A549及A549-luc细胞原位成瘤及转 移能力的病理形态学观察
皮下瘤HE(20× 皮下瘤HE(20×) HE(20