第三章高效液相色谱分析
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为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增 加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 m ）！
直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以 及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱 效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。
2020/8/4
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1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法 的比较
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大 增加，分析速度极快，只需数分 钟；而经典方法靠重力加料，完成 一次分析需时数小时。
高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂 渍均匀、传质阻力小，因而柱效很 高。可以在数分钟内完成数百种物 质的分离。
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g, 荧光检测器—10-11g。
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HP1100 Chem-Station System
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2. HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸 点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数 的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的 稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数 的80%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的 几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作 用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体 的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作 用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的 作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大， 可通过溶剂来控制和改进分离。 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进 行。
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3. 应用 由于HPLC分离分析的高 灵敏度、定量的准确性、 适于非挥发性和热不稳 定组分的分析，因此， 在工业、科学研究，尤 其是在生物学和医学等 方面应用极为广泛。如 氨基酸、蛋白质、核酸、 烃、碳水化合物、药品、分 多糖、高聚物、农药、 子 抗生素、胆固醇、金属 量 有机物等分析，大多是 通过HPLC来完成的。 右图是各种HPLC方法 的应用范围及对象
Chapter 3
High Performance Liquid Chromatography
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13.1 概述 13.2 HPLC仪器
包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统;辅助系统 13.3 流动相和固定相简介 13.4 高效液相色谱方法各论 分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺 寸排阻色谱和亲和色谱
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早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长 50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充 的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。即使这样，流速 仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！
当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但 柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
不溶于水 非极性
极性增加
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向 分配
正向 分配
离子 交换
凝胶 渗透
尺寸 排阻
凝胶 过滤
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13.2 HPLC仪器
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He
出口检查
储液瓶 分布器 过滤 2m
高压泵
脉流消除
入口检查 抽气
到检测器 分离柱
压力计 反压调节 注样阀
过滤器
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1. 高压输液系统 1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)， 其孔很约2 m，可防止颗粒物进行泵内。 2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气 器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过ຫໍສະໝຸດ Baidu 从溶剂中除去。 3）高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳 定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
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HPLC仪器包括：
高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统; 此外还配有梯度淋
洗、自动进样和数 据处理装置。
其工作过程如图所示。
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输液泵种类：恒压型和恒流型。 恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填 充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且 输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变 化，现已较少使用。 恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。 有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往 复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次，因此脉动小。 对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接 一脉动阻尼器)。
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13.1 概述
高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按 照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)； 离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外，还有 亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。
直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以 及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱 效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。
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1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法 的比较
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大 增加，分析速度极快，只需数分 钟；而经典方法靠重力加料，完成 一次分析需时数小时。
高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂 渍均匀、传质阻力小，因而柱效很 高。可以在数分钟内完成数百种物 质的分离。
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g, 荧光检测器—10-11g。
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2. HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸 点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数 的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的 稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数 的80%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的 几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作 用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体 的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作 用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的 作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大， 可通过溶剂来控制和改进分离。 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进 行。
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3. 应用 由于HPLC分离分析的高 灵敏度、定量的准确性、 适于非挥发性和热不稳 定组分的分析，因此， 在工业、科学研究，尤 其是在生物学和医学等 方面应用极为广泛。如 氨基酸、蛋白质、核酸、 烃、碳水化合物、药品、分 多糖、高聚物、农药、 子 抗生素、胆固醇、金属 量 有机物等分析，大多是 通过HPLC来完成的。 右图是各种HPLC方法 的应用范围及对象
Chapter 3
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13.1 概述 13.2 HPLC仪器
包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统;辅助系统 13.3 流动相和固定相简介 13.4 高效液相色谱方法各论 分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺 寸排阻色谱和亲和色谱
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早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长 50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充 的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。即使这样，流速 仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！
当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但 柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
不溶于水 非极性
极性增加
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向 分配
正向 分配
离子 交换
凝胶 渗透
尺寸 排阻
凝胶 过滤
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出口检查
储液瓶 分布器 过滤 2m
高压泵
脉流消除
入口检查 抽气
到检测器 分离柱
压力计 反压调节 注样阀
过滤器
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1. 高压输液系统 1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)， 其孔很约2 m，可防止颗粒物进行泵内。 2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气 器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过ຫໍສະໝຸດ Baidu 从溶剂中除去。 3）高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳 定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
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11
HPLC仪器包括：
高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统; 此外还配有梯度淋
洗、自动进样和数 据处理装置。
其工作过程如图所示。
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输液泵种类：恒压型和恒流型。 恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填 充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且 输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变 化，现已较少使用。 恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。 有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往 复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次，因此脉动小。 对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接 一脉动阻尼器)。
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13.1 概述
高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按 照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)； 离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外，还有 亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。