信号转导研究方法
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信号转导研究方法
印迹技术 blotting
将在凝胶中分离的生物大分子转移到固相化介质上，并加 以检测分析的技术。
应用：DNA、RNA、蛋白质的检测
DNA 印迹: Southern blotting RNA 印迹: Northern blotting 蛋白质印迹: Western blotting
➢ 基因水平 ➢ 转录水平 ➢ 转录后加工 ➢ 翻译水平 ➢ 翻译后加工 ➢ mRNA和蛋白质降解
信号转导研究方法
基因表达分析方法
转录水平分析: --- RT-PCR --- Real Time PCR
--- In situ hybridization
--- Northern blots --- RNase protection assay --- Primer extention assay
▪ Co-IP（免疫共沉淀） with antibody against one protein followed by Western blot with antibody against another protein ▪ GST pull-down assay ▪ Yeast two-hybrid assay ▪ FRET (fluorescence resonance energy transfer)
采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测 不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别 标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内同时检测 两种不同的分子（Double IF），也可用多参数流式细胞术 对胞内多种分子进行检测。
信号转导研究方法
2. 蛋白质与蛋白质相互作用研究技术:
蛋白质组学研究技术平台 (高效率,高通量) 双向电泳分离样品蛋白质 蛋白质点的定位和切取 质谱分析
信号转导研究方法
第一向：等电聚焦电泳 （IEF）
信号转导研究方法
第二向：SDS-PAGE电泳
信号转导研究方法
免疫荧光技术
Immunofluorescence (IF)
利用某些荧光素如FITC等通过化学反应与抗体或其它蛋白 结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性 结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧 光，因此利用荧光显微镜可对抗原进行定性或定位检测。
抗目的蛋白一抗
目的蛋白质
硝酸纤维素膜
采用Western blot方法检测蛋白质原理示意图
信号转导研究方法
应用举例
某药物是否可引起目的蛋白的表达变化（上调或下调）？ 分别抽提细胞蛋白（未处理、药物处理），定量
相同质量上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳 印迹（电转移） 杂交（抗体） 显色/显影 根据显影结果判断：
信号转导研究方法
Western blotting
又称蛋白质印迹技术或免疫印迹技术。蛋白质经聚丙烯 酰胺凝胶电泳分离后转移（电转）至膜性支持物上(NC 膜）,再与溶液中的抗体相互结合的技术。
主要用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异 蛋白质的半定量分析、蛋白质化学修饰（磷酸化），以 及蛋白质分子间的相互作用研究等。
比较转录组学: --- DifferentiaLeabharlann Baidu screening --- Subtractive hybridization --- Differential display --- Array-based methods
启动子分析: --- EMSA --- Reporter gene assay --- CHIP assay --- Nuclear Run-on assay --- DNA Foot-printing assay --- DNA truncation and
信号转导通路 研究策略和
• 搞懂信号通路 • 查找文献，了解信号系统的研究进展和热点 • 找到研究点
信号转导研究方法
如何分析信号蛋白？
表达分析
功能分析
➢ 何时何地表达 ➢ 基因过表达，或基因沉默
(细胞水平和整体水平)
➢ 相互作用蛋白 ➢ 立体论证
信号转导研究方法
蛋白质基因表达可以在不同层次上调节
信号转导研究方法
蛋白质组学(Proteomics)
蛋白质组（proteome）： 一个基因组所表达的全部蛋白质.
蛋白质组学（proteomics)： 研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。
➢ 同一基因组在不同细胞、不同组织中的表 达情况各不相同； ➢ 在空间和时间上呈动态变化
信号转导研究方法
site-directed mutagenesis 翻译水平分析: --- Western Blots --- Immunocytochemistry
Immunohistochemistry --- Protein modification --- Proteomics
信号转导研究方法
1. 蛋白质表达水平和细胞内定位研究 ▪ 信号蛋白分子表达水平检测:
信号转导研究方法
信号转导研究方法
信号转导研究方法
Electrophoresis
信号转导研究方法
转膜
抽提细胞蛋白，定量 聚丙烯酰胺凝胶电泳
与特异性抗体杂 交。
根据标记物特点显色
HRP 2Ab
Protein
DAB H2O2
1Ab
信号转导研究方法
磷酸化生色体系
脱磷酸显色
标记的二抗
偶联的碱 性磷酸酶
目标蛋白
内参
检测标本很多的情况下Western 无法满足高通量的需求
信号转导研究方法
ELISA / Phosphospecific-ELISAs (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ➢ 检测蛋白质表达量或者活性状态 (化学修饰-磷酸化) ➢ 比western blot更快速、更高效.
▪ Western blot analysis. ▪ ELISA ▪ Proteomics
▪ 信号蛋白分子在细胞内定位研究:
▪ Immunohistochemistry / Immunocytochemistry ▪ Immunofluorescence (IF)
▪ Green fluorescent protein (GFP)-fusion protein— typically, live cells.
印迹技术 blotting
将在凝胶中分离的生物大分子转移到固相化介质上，并加 以检测分析的技术。
应用：DNA、RNA、蛋白质的检测
DNA 印迹: Southern blotting RNA 印迹: Northern blotting 蛋白质印迹: Western blotting
➢ 基因水平 ➢ 转录水平 ➢ 转录后加工 ➢ 翻译水平 ➢ 翻译后加工 ➢ mRNA和蛋白质降解
信号转导研究方法
基因表达分析方法
转录水平分析: --- RT-PCR --- Real Time PCR
--- In situ hybridization
--- Northern blots --- RNase protection assay --- Primer extention assay
▪ Co-IP（免疫共沉淀） with antibody against one protein followed by Western blot with antibody against another protein ▪ GST pull-down assay ▪ Yeast two-hybrid assay ▪ FRET (fluorescence resonance energy transfer)
采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测 不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别 标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内同时检测 两种不同的分子（Double IF），也可用多参数流式细胞术 对胞内多种分子进行检测。
信号转导研究方法
2. 蛋白质与蛋白质相互作用研究技术:
蛋白质组学研究技术平台 (高效率,高通量) 双向电泳分离样品蛋白质 蛋白质点的定位和切取 质谱分析
信号转导研究方法
第一向：等电聚焦电泳 （IEF）
信号转导研究方法
第二向：SDS-PAGE电泳
信号转导研究方法
免疫荧光技术
Immunofluorescence (IF)
利用某些荧光素如FITC等通过化学反应与抗体或其它蛋白 结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性 结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧 光，因此利用荧光显微镜可对抗原进行定性或定位检测。
抗目的蛋白一抗
目的蛋白质
硝酸纤维素膜
采用Western blot方法检测蛋白质原理示意图
信号转导研究方法
应用举例
某药物是否可引起目的蛋白的表达变化（上调或下调）？ 分别抽提细胞蛋白（未处理、药物处理），定量
相同质量上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳 印迹（电转移） 杂交（抗体） 显色/显影 根据显影结果判断：
信号转导研究方法
Western blotting
又称蛋白质印迹技术或免疫印迹技术。蛋白质经聚丙烯 酰胺凝胶电泳分离后转移（电转）至膜性支持物上(NC 膜）,再与溶液中的抗体相互结合的技术。
主要用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异 蛋白质的半定量分析、蛋白质化学修饰（磷酸化），以 及蛋白质分子间的相互作用研究等。
比较转录组学: --- DifferentiaLeabharlann Baidu screening --- Subtractive hybridization --- Differential display --- Array-based methods
启动子分析: --- EMSA --- Reporter gene assay --- CHIP assay --- Nuclear Run-on assay --- DNA Foot-printing assay --- DNA truncation and
信号转导通路 研究策略和
• 搞懂信号通路 • 查找文献，了解信号系统的研究进展和热点 • 找到研究点
信号转导研究方法
如何分析信号蛋白？
表达分析
功能分析
➢ 何时何地表达 ➢ 基因过表达，或基因沉默
(细胞水平和整体水平)
➢ 相互作用蛋白 ➢ 立体论证
信号转导研究方法
蛋白质基因表达可以在不同层次上调节
信号转导研究方法
蛋白质组学(Proteomics)
蛋白质组（proteome）： 一个基因组所表达的全部蛋白质.
蛋白质组学（proteomics)： 研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。
➢ 同一基因组在不同细胞、不同组织中的表 达情况各不相同； ➢ 在空间和时间上呈动态变化
信号转导研究方法
site-directed mutagenesis 翻译水平分析: --- Western Blots --- Immunocytochemistry
Immunohistochemistry --- Protein modification --- Proteomics
信号转导研究方法
1. 蛋白质表达水平和细胞内定位研究 ▪ 信号蛋白分子表达水平检测:
信号转导研究方法
信号转导研究方法
信号转导研究方法
Electrophoresis
信号转导研究方法
转膜
抽提细胞蛋白，定量 聚丙烯酰胺凝胶电泳
与特异性抗体杂 交。
根据标记物特点显色
HRP 2Ab
Protein
DAB H2O2
1Ab
信号转导研究方法
磷酸化生色体系
脱磷酸显色
标记的二抗
偶联的碱 性磷酸酶
目标蛋白
内参
检测标本很多的情况下Western 无法满足高通量的需求
信号转导研究方法
ELISA / Phosphospecific-ELISAs (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ➢ 检测蛋白质表达量或者活性状态 (化学修饰-磷酸化) ➢ 比western blot更快速、更高效.
▪ Western blot analysis. ▪ ELISA ▪ Proteomics
▪ 信号蛋白分子在细胞内定位研究:
▪ Immunohistochemistry / Immunocytochemistry ▪ Immunofluorescence (IF)
▪ Green fluorescent protein (GFP)-fusion protein— typically, live cells.