实验蛋白质含量测定2019-PPT课件
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实验一蛋白质含量测定
实验一蛋白质含量的测定姓名：mangogola一．实验原理生物化学实验中，经常需要测定蛋白质的含量，一般常用的蛋白质含量测定方法有紫外吸收法、福林酚试剂法以及一些改进的Lowry法可以应用。
紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸中的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm处，且蛋白质溶液的光密度值与其含量呈正比关系。
该方法具有简单、灵敏、快速和不消耗样品的优点，但易受核酸分子中嘌呤、嘧啶等的干扰，准确度较差。
根据蛋白质和核酸的吸收峰不同，可通过计算适当校正核酸的干扰作用。
Lowry法的原理是：在碱性条件下，蛋白质与铜离子形成铜-蛋白质复合物，该复合物可还原磷钼酸-磷钨酸（Folin试剂）产生深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物。
该方法灵敏度较高，但较费时。
对膜蛋白或相当稀的（如<1ug/ml）蛋白溶液的含量测定，以及为减小去污剂、脂类、碳水化合物的干扰，可采用一些改进的Lowry法，如蛋白质-染料结合法。
原理是：当染料考马斯亮蓝G250与蛋白质结合时，最大吸收峰从465nm移动到595nm，而且吸收值在一定蛋白浓度下线性相关，因此用标准浓度的蛋白测OD595作标准曲线，即可求得待测样品的蛋白浓度。
此方法简单经济、快速、灵敏度也较高。
需要注意的是，染料与蛋白质可在3min内完成结合，由于染料试剂中含有酒精成分，易挥发，所以结合生成的复合物在1h 内可比较稳定地存在于溶液中，制作的标准曲线后部会出现弯曲现象。
二．实验过程（Lowry法）1.溶液配制A液：2%Na2CO3，用0.1mol/LNaOH配制。
（不能将NaOH和 Na2CO3干粉混合配制，这样会因释放CO2而不准确）B液：0.5%CuSO4.5H2O,用1%酒石酸钾或酒石酸钠配制。
C液：使用前将A、B液按50:1混合，当天使用。
D液：Folin试剂标准蛋白溶液：200ug/mLBSA溶液2.标准曲线测定按照下表进行操作，用一系列标准浓度的BSA平行进行两组测定反应，记录A500。
蛋白质含量的测定方法.PPT-
内容一般包括样品名称、送检单位、生产日期 及批号、取样时间、检验日期、检验项目、检验结 果、报告日期、检验员签字、主管负责人签字、检 验单位盖章等。
国家食品检验工职业鉴定
一、食品检验工的职业定义 使用检测设备，用抽样检查方式对粮油及制品、糕点糖
果、乳及乳制品、白酒、果酒、黄酒、啤酒、饮料、罐头食 品、肉蛋及制品、调味品、酱腌制品、茶叶等各类食品的感 官、理化、卫生及食品内包装材料等指标进行检验的人员 二、食品检验工的职业技能鉴定
二、检测结果的表示 1. 固体试样 固体试样中待测组分的含量，一般以质量分数（%）表示 当
待测组分含量很低时，可采用mg·kg-1 、μg·kg-1 表示
2. 液体试样 常用单位是 mol·L-1 、mg·L-1 、mol·kg -1
检测报告的编制
一、原始记录
原始记录必须真实、齐全、清楚，记录方式应 简单明了；原始记录本应统一编号、专用，用钢笔 或圆珠笔填写，不得任意涂改、撕页、散失；原始 记录应统一管理，归档保存，以备查验 二、检验报告
第一章 农产品检测基础
·农产品质量与检测
一、农产品的分类 在农业活动中获得的植物、动物、微生物及其
产品称为农产品，可分为食品原料类（如谷类农作 物的种子、果蔬产品、畜禽及其产品、水产等）和 非食品原料类（如棉、麻、丝、草等） 二、农产品的营养
食品原料类农产品的营养成分通常分为碳水化合 物、蛋白质和氨基酸、脂肪、维生素、有机酸、水 分及矿物元素
农产品中脂肪的检测
二、油脂酸价的测定 酸价是反映油脂质量的主要技术指标之一。
测定方法：热乙醇测定法，即试样溶解在热乙醇中， 用氢氧化钾或氢氧化钠水溶液滴定。
三、油脂碘价的测定 碘价的高低表示油脂中脂肪酸的不饱和程度。测
国家食品检验工职业鉴定
一、食品检验工的职业定义 使用检测设备，用抽样检查方式对粮油及制品、糕点糖
果、乳及乳制品、白酒、果酒、黄酒、啤酒、饮料、罐头食 品、肉蛋及制品、调味品、酱腌制品、茶叶等各类食品的感 官、理化、卫生及食品内包装材料等指标进行检验的人员 二、食品检验工的职业技能鉴定
二、检测结果的表示 1. 固体试样 固体试样中待测组分的含量，一般以质量分数（%）表示 当
待测组分含量很低时，可采用mg·kg-1 、μg·kg-1 表示
2. 液体试样 常用单位是 mol·L-1 、mg·L-1 、mol·kg -1
检测报告的编制
一、原始记录
原始记录必须真实、齐全、清楚，记录方式应 简单明了；原始记录本应统一编号、专用，用钢笔 或圆珠笔填写，不得任意涂改、撕页、散失；原始 记录应统一管理，归档保存，以备查验 二、检验报告
第一章 农产品检测基础
·农产品质量与检测
一、农产品的分类 在农业活动中获得的植物、动物、微生物及其
产品称为农产品，可分为食品原料类（如谷类农作 物的种子、果蔬产品、畜禽及其产品、水产等）和 非食品原料类（如棉、麻、丝、草等） 二、农产品的营养
食品原料类农产品的营养成分通常分为碳水化合 物、蛋白质和氨基酸、脂肪、维生素、有机酸、水 分及矿物元素
农产品中脂肪的检测
二、油脂酸价的测定 酸价是反映油脂质量的主要技术指标之一。
测定方法：热乙醇测定法，即试样溶解在热乙醇中， 用氢氧化钾或氢氧化钠水溶液滴定。
三、油脂碘价的测定 碘价的高低表示油脂中脂肪酸的不饱和程度。测
蛋白质检测方法 ppt课件
比色法-BCA法
✓ BCA （Bicinchoninic acid) 试剂的主要成分为二喹啉 甲酸钠。 ✓ BCA并不能直接与蛋白质发生化学或是物理上的反应， 而是对双缩脲反应的强化。BCA 极易与 Cu+结合形成紫 色的复合物，该复合物在 562 nm 处有最大吸收峰，对 入射光的吸收程度与 Cu+的浓度成正比。
凯氏定氮法由于蛋白质是体内的主要含氮物，因此，通过测 定生物样品的含氮量便可估算出样品中的总蛋白质含量。
蛋白质含量＝含氮量 Х 6.25 此方法的测定范围为0.2～1.0 mg氮。 ✓ 优点：应用范围广，重现性好、准确度高 ✓ 缺点：局限于样品中总蛋白的检测，破坏蛋白质结构，
易受到被测样品中其它有机含氮化合物的干扰
比色法-茚三酮法
✓ 茚三酮，又名苯并戊三酮，溶于水后与水分子结合形 成水合茚三酮，进而可与氨、一级胺、二级胺发生化学 反应生成紫蓝色或黄色缩合物。茚三酮法可用于水解蛋 白质的检测。
比色法-茚三酮法
以氨基酸为例，首先在弱酸性加热条件下氨基酸与水合茚酸酮发生氧 化反应，氨基酸脱去氨基和羟基变成醛类化合物，水合茚三酮吸收氨基并 脱去分水子变成胺合茚三酮。随后胺合茚三酮与茚三酮反应生成席夫碱， 并最终形成紫蓝色或黄、棕色化合物，产物颜色的深浅与蛋白质的浓度相 关，最大吸收波长为 570 nm 左右。
比色法-双缩脲法
✓ 原理：蛋白质含有两个以上的肽键，故有双缩脲（NH2CO-NH-CO-NH2）反应。在碱性条件下，肽键的质子被解离， Cu2+和失去质子的多肽链的氮相结合产生稳定的紫色络合物， 在540～560 nm的光吸收值与蛋白质的含量在一定范围内呈 线性关系。由于与双缩脲试剂与不同种类的蛋白质反应产物 的颜色差别极小，使得该方法比较适合总蛋白质的检测。
实验一蛋白质含量的测定
NH2
2NH3+ H2SO4(NH4)2SO4(2)
(NH4)2SO4+ 2NaOH2H2O +Na2SO4+ 2NH3(3)
反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。
（250g/ml）
未知蛋白质0.2 0.4 0.6
（约250g/ml）
蒸馏水1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 00.8 0.6 0.4
试剂甲5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
试剂乙0.5 0.50.50.50.50.50.50.50.50.5
2.试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。
3.标准蛋白质溶液：同基本法。
（二）操作步骤
测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。
（3）标准蛋白质溶液:
精确称取结晶牛血清清蛋白或—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250g/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。
2.器材
（1）可见光分光光度计
（2）旋涡混合器
（3）秒表
（4）试管16支
（三）操作方法
1.标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250g/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。
2NH3+ H2SO4(NH4)2SO4(2)
(NH4)2SO4+ 2NaOH2H2O +Na2SO4+ 2NH3(3)
反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。
（250g/ml）
未知蛋白质0.2 0.4 0.6
（约250g/ml）
蒸馏水1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 00.8 0.6 0.4
试剂甲5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
试剂乙0.5 0.50.50.50.50.50.50.50.50.5
2.试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。
3.标准蛋白质溶液：同基本法。
（二）操作步骤
测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。
（3）标准蛋白质溶液:
精确称取结晶牛血清清蛋白或—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250g/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。
2.器材
（1）可见光分光光度计
（2）旋涡混合器
（3）秒表
（4）试管16支
（三）操作方法
1.标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250g/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。
实验一动物细胞蛋白质的提取和含量测定
更应注意。如胃蛋白酶抑制剂可抑制酸性蛋 白酶，EDTA可抑制金属蛋白酶等。 （3）防止蛋白质巯基氧化：还原剂（如巯基 乙醇、二硫苏糖醇等）。
4、初提液的浓缩（利于下一步分离）：常用沉淀法，超滤法， 冷冻干燥法等。适当的沉淀剂可浓缩样品，并可去除核酸。
沉淀法：蛋白溶液中加入有机溶剂（如丙酮、乙醚等）， 通过其脱水作用和减少溶剂的极性使蛋白沉淀。或者加入硫 酸铵到一定浓度，蛋白可通过盐析作用沉淀。
（3）缺点
1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同， 因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。
2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污 剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的 NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。 3. 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计 算，而只能用标准曲线。
❖ 1、Lowry法（Folin－酚试剂法） ❖ 2、Bradford法 （考马斯亮蓝法） ❖ 3、紫外吸收法
这些方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因 为一种蛋白质溶液用这几种方法测定，有可能得出几种不同 的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。其 中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏 10～20倍.在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵 敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质； ④测定所要花费的时间。
❖ 3.逐管加入0. 5毫升试剂乙（Folin－酚试剂），同样立即充 分混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然 后在室温下放置30-60分钟。
❖ 4.以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，将样品和 待测品在可见分光光度计上于550nm处测定各管中溶液的吸 光度值。
4、初提液的浓缩（利于下一步分离）：常用沉淀法，超滤法， 冷冻干燥法等。适当的沉淀剂可浓缩样品，并可去除核酸。
沉淀法：蛋白溶液中加入有机溶剂（如丙酮、乙醚等）， 通过其脱水作用和减少溶剂的极性使蛋白沉淀。或者加入硫 酸铵到一定浓度，蛋白可通过盐析作用沉淀。
（3）缺点
1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同， 因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。
2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污 剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的 NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。 3. 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计 算，而只能用标准曲线。
❖ 1、Lowry法（Folin－酚试剂法） ❖ 2、Bradford法 （考马斯亮蓝法） ❖ 3、紫外吸收法
这些方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因 为一种蛋白质溶液用这几种方法测定，有可能得出几种不同 的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。其 中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏 10～20倍.在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵 敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质； ④测定所要花费的时间。
❖ 3.逐管加入0. 5毫升试剂乙（Folin－酚试剂），同样立即充 分混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然 后在室温下放置30-60分钟。
❖ 4.以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，将样品和 待测品在可见分光光度计上于550nm处测定各管中溶液的吸 光度值。
蛋白质含量测定
实验十六蛋白质含量的测定衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。
即可计算该样品的蛋白质含量。
一般食品蛋白质含氮量为l0％如肉、蛋、豌豆、玉米等，其换算系数为6.25，小麦取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，动物胶5.55。
一、目的与要求：掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。
包括样品的消化，蒸馏吸收及滴定与含氮量的计算。
二、原理：凯氏定氮法：食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。
然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反响式如下。
( 1 )2NH2(CH2)2COOH+13H2S04(NH4)2S04+6C02+12S02+16H2(2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4(3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O(4)(NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2三、试剂与仪器：1、硫酸钾2、硫酸铜3、硫酸4、2％硼酸溶液5、40％氢氧化钠溶液6、混合指示剂：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成．7、0.01mol/LHCL标准溶液或0．01mol/L硫酸标准溶液．8、KDN-08A(04A)定氮仪10、三角瓶250ml 3只。
11、量筒50ml、l0ml、l00ml。
12、吸量管10ml只。
13、酸式滴定管1支。
14、容量瓶100毫升1只。
15、小漏斗1只。
四、实验步骤1.样品处理：精细称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml 液体样品〔约相当氮30-40mg〕，移入枯燥的500ml定氮瓶中，参加0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20毫升硫酸，将消化管分别放入消化架各个孔呢，然后置于消化炉上，然后开启抽气三通上自来水龙头，使抽气三通处于吸气状态，接通电源，在加热初始阶段防止样品飞溅〔选用电压型控温的消化炉起先控制在150伏左右，15min左右后可满电压工作〕。
生化实验01-蛋白质含量的测定
1
灵敏度高：比双缩脲法高100倍。 适用范围：微量蛋白质（0.02～0.50mg/mL）测定。
干扰因素： 酚类、柠檬酸和巯基类化合物等还原性物质。
Designed by XK Wang
2
二、材料、设备与试剂
（一 ）实验材料 ：绿豆芽下胚轴 （二）设备 ：天平；分光光度计；移液器等。
（三）试剂
1. Folin试剂甲——试剂A：试剂B == 50：1
5 0.8 0.2
6样品液Biblioteka (1.0) 05mL，混匀后室温下放置5——10min 0.5mL（逐一加入并立即混匀），20-30min后，测定A650
比色测定：
1号管为空白，在650nm波长下用10mm的比
色皿测定各管的吸光度。 标准曲线绘制： 以标准蛋白含量（μg） 为横坐标，吸光度（A650） 为纵坐标，在坐标纸上绘 制出标准曲线。
Designed by XK Wang
5
A650
0
蛋白质/ μg
（二）样品中蛋白质的提取及测定
0.2～0.5g绿豆芽下胚轴于研钵中 —→加1—2mL 水—→研磨成匀浆后定容至25mL —→室温下放置10— —20min（间歇震荡） —→过滤后得到待测溶液。 取待测液1.0mL进行测定（参考制作标准曲线的步
N：样品稀释倍数）
Designed by XK Wang
7
六、分析讨论 注意事项：
1. 试剂乙在碱性环境中不稳定。 2. 酚类、柠檬酸、还原性糖类等物质有干扰。
Designed by XK Wang
8
骤）。
Designed by XK Wang
6
四、原始数据 五、结果计算
样品中蛋白质的含量（mg/g）＝
灵敏度高：比双缩脲法高100倍。 适用范围：微量蛋白质（0.02～0.50mg/mL）测定。
干扰因素： 酚类、柠檬酸和巯基类化合物等还原性物质。
Designed by XK Wang
2
二、材料、设备与试剂
（一 ）实验材料 ：绿豆芽下胚轴 （二）设备 ：天平；分光光度计；移液器等。
（三）试剂
1. Folin试剂甲——试剂A：试剂B == 50：1
5 0.8 0.2
6样品液Biblioteka (1.0) 05mL，混匀后室温下放置5——10min 0.5mL（逐一加入并立即混匀），20-30min后，测定A650
比色测定：
1号管为空白，在650nm波长下用10mm的比
色皿测定各管的吸光度。 标准曲线绘制： 以标准蛋白含量（μg） 为横坐标，吸光度（A650） 为纵坐标，在坐标纸上绘 制出标准曲线。
Designed by XK Wang
5
A650
0
蛋白质/ μg
（二）样品中蛋白质的提取及测定
0.2～0.5g绿豆芽下胚轴于研钵中 —→加1—2mL 水—→研磨成匀浆后定容至25mL —→室温下放置10— —20min（间歇震荡） —→过滤后得到待测溶液。 取待测液1.0mL进行测定（参考制作标准曲线的步
N：样品稀释倍数）
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7
六、分析讨论 注意事项：
1. 试剂乙在碱性环境中不稳定。 2. 酚类、柠檬酸、还原性糖类等物质有干扰。
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8
骤）。
Designed by XK Wang
6
四、原始数据 五、结果计算
样品中蛋白质的含量（mg/g）＝
检测生物组织中的糖类、脂肪、蛋白质课件 高一上学期生物人教版(2019)必修1
①加入 2mL待测 组织样液
②加入1mL 双缩脲试 剂A液
鸡蛋清稀释液2ml 生豆浆2ml、 熟豆浆2ml、
③加入4滴 双缩脲试 剂B液
试剂 变紫色
待测液中有蛋白质
3、脂肪的检测和观察 待测材料：花生种子
取材 制片
花生种子（浸泡）去种皮，将子叶切成薄片
① 选最理想的薄片 ② 滴2～3滴 苏丹Ⅲ染液 染色3min ③ 用1～2滴 体积分数为50%的酒精溶液 ④ 制成临时装片
五、实验结果与结论：（书P19)
鸡蛋清、 生豆浆、 熟豆实浆验，结梨果匀浆、蔗糖水实、验蒸结馏水论。
待测样品
梨匀浆
出现砖红色沉淀 待测组织含还原糖
白萝卜匀浆
出现砖红色沉淀 待测组织含还原糖
蔗糖溶液
试剂为浅蓝色 待测组织无还原糖
花生种子
有橘黄色小颗粒 待测组织含脂肪
生豆浆 熟豆浆 鸡蛋清
试剂变紫色
试剂变紫色 试剂变紫色
某生物兴趣小组在野外发现一种果肉为白色的不知名野果。该小组把 这些野果带回实验室欲检测其中是否含有还原糖、脂肪和蛋白质。下
列叙述正确的是（A）
√ A. 可利用苏丹Ⅲ染液对该野果进行脂肪的检测实验
B. 若向该野果的组织样液中加入斐林试剂并水浴加热后出现较深的砖红 色，说明该野果中含有大量的葡萄糖 还原糖 C. 进行蛋白质的检测时可用斐林试剂的甲液和乙液代替双缩脲试剂的A 液和B液，因为它们的成分相同 CuSO4的浓度不同 D. 还原糖检测实验结束后，应将剩余的斐林试剂装入棕色瓶，以便长期 保存备用 现配现用
本节实验课作业：
学案：p11-p12的基础认知 P14全部、P15的学以致用、P16的3，4，
课时训练：p3: 过关检验3,4 p4素养提升2,3
蛋白质含量测定ppt课件
（三）蛋白质的胶体性质
蛋白质是生物大分子，分子量可自1万至100万之 巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之 内。蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体，因为蛋 白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带 有相同电荷，相互排斥。蛋白质水溶的沉淀反应 如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等 电点状态或失去水化层（消除相同电荷， 除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定 并将产生沉淀。
（二）蛋白质的两性电离 蛋白质是由氨基酸组成，其分子末端除有自由的 α-NH2和α-COOH外，许多氨基酸残基的侧链上 尚有可解离的基因，这些基团在溶液一定pH条件 下可以解离成带负电荷或正电荷的基团。当蛋白 质溶液在某一pH时，蛋白质解离成正负离子的趋 势相等，即成兼性离子，净电荷为零，此时溶液 的pH称为蛋白质的等电点（isoelectric point,PI）。 蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带 负电荷，小于等电点时则带正电。 电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。 电泳种类：自由界面电泳、区带电泳（纸电泳、 凝胶电泳等）
4. 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有 些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功 能，称为复性(renaturation)。所示。但是许多蛋 白质变性后，空间构象严重被破坏，不能复原， 称为不可逆性变性。 5. 蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能 溶解于强酸或强碱溶液中，若将pH调至等电点， 则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状 物仍可溶解于强酸和强碱中。如再加热则絮状物 可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸 和强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用 (protein coagulation)。
H2NCH2COOH +3H2SO4 → 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 (l) (1) 2NH3 +H2SO4 → (NH4)2SO4 (2) (NH4)SO4 +2NaOH → 2H2O+Na2SO4 +2NH3 (3) 此法灵敏度低,适用于0.2-1.0mg 氮,误差为2%, 费时8-10小时,将氮转化为氨,用酸吸收后滴 定.
福林酚测蛋白质 (1)课件
福林-酚法 测定蛋白质的含量
实验目的
• 学习测定蛋白质浓度的原理和方法 • 熟练分光光度计，微量移液器的操作以及标
准曲线的制作
实验原理
第一步——双缩脲反应（蛋白质与碱性铜试剂反应）
在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物
分光光度计的原理
实验方法
制作标准曲线：
(1）选择标准蛋白溶液(牛血清白蛋白），配制一定浓度母 液
2：调节吸量体积：
将微量移液器调至所需体积，千万不要将读 数的调节超出最大值和最小值；
操作步骤
4. 更换吸头： 吸取不同的液体，一定要更换枪头，防止
试剂交叉污染，更换枪头时，对着废弃桶，轻轻按 下卸载吸头的弹射器，吸头自然脱落在废弃桶内。 5. 微量移液器的放置：
实验完毕后，将移液器调回到接近最大量程， 使弹簧处于松弛状态，放到或者悬挂在架子上。
注意事项：
➢ 及时做好标记 ➢ 加入试剂后应立即混匀 ➢ 测定所加入的蛋白质量应在标准曲线范围之内
注意事项
➢ 比色皿有光面和毛面，勿用手触摸光面，使用时光面对准光路。 ➢ 装液体时，需达到比色皿2/3左右；若液体不慎溢出，需用纸巾
吸干，仪器如果沾有液体，请迅速擦干。
操作步骤
1：选择量程
根据转移液体的量，选择正确量程的微量移液 器
注意事项
1. 吸取不同的液体时，切记要更换吸头， 2. 调节移液器时，动作要轻缓，千万不要将读数的调节超出最大值和最小
值，否则会造成损坏。 3. 吸取液体时，动作要轻缓，防止液体随着气流进入移液器的上部； 4. 带有残余液体吸嘴的移液器不能平放。 5. 每次实验完毕后将微量移液器调至接近最大刻度，使弹簧处于自然伸展
状态。 6. 必须定期让专业人员进行校正，不能火烧灭菌，不能摔。
实验目的
• 学习测定蛋白质浓度的原理和方法 • 熟练分光光度计，微量移液器的操作以及标
准曲线的制作
实验原理
第一步——双缩脲反应（蛋白质与碱性铜试剂反应）
在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物
分光光度计的原理
实验方法
制作标准曲线：
(1）选择标准蛋白溶液(牛血清白蛋白），配制一定浓度母 液
2：调节吸量体积：
将微量移液器调至所需体积，千万不要将读 数的调节超出最大值和最小值；
操作步骤
4. 更换吸头： 吸取不同的液体，一定要更换枪头，防止
试剂交叉污染，更换枪头时，对着废弃桶，轻轻按 下卸载吸头的弹射器，吸头自然脱落在废弃桶内。 5. 微量移液器的放置：
实验完毕后，将移液器调回到接近最大量程， 使弹簧处于松弛状态，放到或者悬挂在架子上。
注意事项：
➢ 及时做好标记 ➢ 加入试剂后应立即混匀 ➢ 测定所加入的蛋白质量应在标准曲线范围之内
注意事项
➢ 比色皿有光面和毛面，勿用手触摸光面，使用时光面对准光路。 ➢ 装液体时，需达到比色皿2/3左右；若液体不慎溢出，需用纸巾
吸干，仪器如果沾有液体，请迅速擦干。
操作步骤
1：选择量程
根据转移液体的量，选择正确量程的微量移液 器
注意事项
1. 吸取不同的液体时，切记要更换吸头， 2. 调节移液器时，动作要轻缓，千万不要将读数的调节超出最大值和最小
值，否则会造成损坏。 3. 吸取液体时，动作要轻缓，防止液体随着气流进入移液器的上部； 4. 带有残余液体吸嘴的移液器不能平放。 5. 每次实验完毕后将微量移液器调至接近最大刻度，使弹簧处于自然伸展
状态。 6. 必须定期让专业人员进行校正，不能火烧灭菌，不能摔。
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室温放置5分钟后测595nm的光吸。 考马斯亮蓝染料极易吸附于比色皿壁，每次测量后应用乙醇 洗涤后，用双蒸水清洗。
生物化学与分子生物学基础实验 注意混匀，但不要剧烈震荡。
Folin-酚试剂法（Lowry法）
原理： Folin- 酚试剂法的显色试剂由试剂甲和试剂乙 组成。 试剂甲中的Cu2+碱性条件下与肽键形成络合物并被还原 成Cu+。 Cu+ 以及蛋白质中的 Tyr 等的侧链基团与试剂乙反应， 试剂乙中的磷钼酸盐 — 磷钨酸盐被蛋白质中的 Tyr 和 Phe 残基还原，产生蓝色化合物（钼兰和钨兰的混合 物），显色反应在30分钟内接近极限。
生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
优点： • 不需添加任何试剂，因而对样品没有任何 破坏； • 测量极其简单迅速； • 蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。 • 适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白 质。
生物化学与分子生物学基础实验
RNA和DNA在此波 长均有强吸收 , 所以一定要考虑样品中是否有核酸 . 要得到准确可靠的结果，必须严格控制样品溶液的 pH和化学组成，使待测样品和标准样品的实验条件 一致。
实验一 几种蛋白质定量测 定方法的比较
生物化学与分子生物学基础实验
实验目的
1 掌握紫外吸收法、Folin－酚试剂法 （Lowry法）和考马斯亮蓝染色法 （Bradford法）测定蛋白质含量的原 理和方法 2 掌握分光光度计的原理和使用方法
生物化学与分子生物学基础实验
选择合适的蛋白质含量测定方法主要 基于几点考虑：
5
3.0
6
4.0
7
0
双蒸水（ml）
蛋白质含量 (mg/ml)
4.0
0
-
2.0
0.5
-
1.0
0.7 5
-
0
1.0
-
0
未知蛋白溶 液（ml）
-
-
-
4.0
A280
生物化学与分子生物学基础实验
考马斯亮蓝染色法（Bradford法）
原 理 ： 该 方 法 由 Bradford 于 1976 年建立。在酸性条件下， 考马斯亮蓝与蛋白质结合后最 大光吸收波长由 465nm（红色） 转移为 595nm（蓝色），起作 用的主要氨基酸是 Arg，另外， His, Lys, Tyr, Trp 和 Phe 也 有作用。 2 － 5min 呈最大光吸收，至少 可稳定1小时
敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。
•
•
用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准 蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，误差 较大。
生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
操作步骤
管号
标准蛋白溶 液（ml）
0
0
1
1.0
3.0
0.25
2
1.5
2.5
0.375
3
2.0
4
2.5
1.5
0 . 62 5
生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
蛋白质在紫外光区（190nm-360nm）有两个 强烈吸收峰：280nm和190nm。 280nm有吸收的电子所需能量较少，因为这些 光子存在于芳香环的共轭双键中，色氨酸(Trp)、和 酪氨酸(Tyr)有芳香环，可吸收280nm波长的光子， 苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）也有微弱吸收。 蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关， 因此相同浓度的不同种类蛋白质，其280nm的吸收 值差别很大(图1)。
①有多少样品可供分析; ②蛋白质样品浓度大约是多少; ③样品中含有哪些可能影响定量的化学物质； ④所选方法是否简单、可靠； ⑤含量测定的专一性要求是否很高。
生物化学与分子生物学基础实验
常用的方法
物理性质：紫外吸收法 化学性质：Folin－酚试剂法（Lowry法），BCA法 （Bicinchoninic acid 法），凯氏定氮法，双缩脲 法（Biuret法），胶体金测定法，等等 染色性质：考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、银染 法 测定绝对含量应用凯氏定氮法（蛋白质的含氮量 为16％）。
考马斯亮蓝染色法（Bradford法）
实验操作步骤
管号 标准蛋白 ul 蒸馏水 ul 待测蛋白 ul Bradford 试剂 A595 0 0 100 5ml 1 10 90 5ml 2 20 80 5ml 3 40 60 5ml 4 60 40 5ml 5 80 20 5ml 6 100 0 5ml 7 0 0 100 5ml
生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
肽键在190nm有强吸收峰。 一般分光光度计在190nm的光强较弱，且O2在 此波长有吸收，因此通常使用205nm或210nm 波长，Trp, Phe, Tyr, His, Cys, Met, and Arg的 侧链在此波长有吸收。优点：灵敏，较稳定。
缺点: 干扰因素多。许多化学物质特别是含C ＝C双键和C＝O双键的物质在此波长范围有 吸收，所以必须严格控制反应条件。
生物化学与分子生物学基础实验
考马斯亮蓝染色法（Bradford法）
简便, 迅速，灵敏度较高。只需要一种反应 试剂 影响因素较少。去污剂和两性物质对测定有 干扰 小于3000Da 的多肽无法测定 蛋白浓度高时非线性 配制的染色液需过滤除去未溶解的考马斯亮 蓝G250
生物化学与分子生物学基础实验
颜色深浅与蛋白含量成正比，可在640nm下测光吸收。
生物化学与分子生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
• 酸、铜离子螯合剂（如EDTA、柠檬酸等）、还原剂（如巯基乙 醇、DTT、苯酚等）干扰本反应。
•
•
不同蛋白质主要因其所含的Tyr含量不同而呈现不同的吸收强度。
进行测定时，加试剂乙时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH 条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当试 剂乙加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在 磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。这一步 混合速度要快，否则会使显色程度减弱。 因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控 制时间。 费时较长，试剂配制较繁琐。
生物化学与分子生物学基础实验
图1.蛋白质和核酸的紫外吸收光谱 图A是15μ g /ml蛋白的吸收光谱。图A中插图是 1mg/ml的牛免疫球蛋白 IgG(I)、牛血清白蛋白 (B) 和白明胶 (G) 的吸收光谱，缓冲液为： 0.01% Brij35,0.1M K2SO4,5mM KH2PO4,pH7。 图 B 是 10 μ g /ml RNA 和 DNA 的吸收 光谱。