哺乳动物细胞表达 PPT课件

载体的选择取决于外源基因的导入方式和其调控元 件是否有利于转录和翻译。真核生物基因高表达载体 必须具有如下调控元件：
①原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复 制的复制子，便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基因， 以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。
②启动子和增强子； ③剪接信号； ④终止信号和polyA加尾信号。
• 稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培 养，载体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达 持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤， 稳定表达相对耗时耗力。
诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱 导后才得以开放。早期实验常使用糖皮质激素、重 金属离子等诱导体系来调控基因表达，但存在特异 性低和毒性高等诸多缺点；
COS细胞是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿 主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入 DNA的量或者采用基因组DNA 序列的情况都没有什 么限制，便于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性 克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突 变。
CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大 规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生 比， 是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。 已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量 较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%，而用细菌 表达可获得占总蛋白50%的蛋白表达水平.
质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据 质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体 分为整合型和附加体型载体两类。 整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能 稳定存在。而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自 我复制的附加体形式存在。 整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达 受插入位点 的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长 特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的 问题， 但载体DNA在复制中容易发生突胞表达载体的必要元件包括：一个
高活性的启动子、转录终止序列和一个有效的 mRNA翻译信号。可视实验需要加入标志基因、复 制起始点序列、内部核糖体进入位点等。基于启动子 ／增强子是表达载体中最重要的元件，我们这里仅对 它做简要介绍。
目前常用的强启动子包括人巨细胞病毒早期启动子 (CMV-IE)、人延伸因子1-亚基启动子和Rous肉 瘤长末端重复序列；Invitrogen公司开发的 pcDNA、pEF和pRL三种系列载体即分别是以这三 种启动子驱动目的基因的表达。 常用的增强子有Rous肉癯病毒基因长末端重复序列 和人巨细胞病毒增强子。 构建杂合的启动子是获得新启动子的一个重要途径。
3 整合位点的优化 目的基因在CH0细胞染色体上整合位点区域的状态
对于目的基因的表达与否、表达高低以及目的基因在 宿主细胞中的稳定性起着决定性的作用。只有那些整 合位点处于染色体转录活跃区的细胞形成的克隆才可 高水平表达目的基因。因此，保证将表达载体整合在 CHO细胞染色体上转录活跃位点的克隆挑选出来是 提高CHO细胞表达水平必需的一步
2 宿主细胞 哺乳动物细胞表达外源蛋白最初是将抗体基因重
新导人淋巴细胞中由病毒(如SV40)或lgG的启动子 增强子引导。产生的抗体具有相应的结合能力和数应 功能，但表达量很低。
常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细 胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸 腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。不同宿主细 胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同， 需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。
染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转 染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系 统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到 病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出 目的蛋白。
根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为 病毒载体与质粒载体。
病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白 与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。 常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病 毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外，杆状 病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受 重视。
为了将含目的基因的载体导入哺乳动物功物细胞．还必须 加入遗传选择标记。常用的标记基因有胸腺激酶(tk)基因、 二氢叶酸还原酶(dhfr)基因、新霉素(neo)抗性基因、 氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因等. dhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加。当 培养基中逐新增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度时，随着细胞对 MTX抗体的增加。dhfr基因与外源基因均明显扩增。据 文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列能 扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。
随着真核细胞在转录水平调控机制的进一步揭示， 杂合(或人工)启动子以及人工转录激活因子的构建将是 更为有效的提高转录效率的方法。
2 翻译水平 除了转录水平的调控外，翻译水平的调控(如
mRNA寿命、mRNA的翻译起始效率)和翻译产物 的加工修饰的效率等也对目的基因的表达产生重要 的影响。poly(A)的存在不但能影响mRNA稳定 性，而且也能部分起“翻译增强子”的作用，提高 mRNA翻译水平；内部核糖体进入位点(IRES)能 使同一mRNA中除第1个基因之外的其他基因也得 到有效表达；翻译增强子可提高翻译效率；通过使 用宿主细胞偏爱的密码子来对目的基因的密码子进 行优化也可以大幅度提高翻译效率
4 表达系统的选择
哺乳动物细胞表达系统中，重组蛋白的表达水平与许 多因素相关，如转录和翻译调控元件、RNA剪接过 程、mRNA稳定性、基因在染色体上的整合位点、 重组蛋白对细胞的毒性作用以及宿主细胞的遗传特性 等。选定表达系统之后，还需考虑表达载体与宿主细 胞的合理搭配问题。因此如果需获得一个基因的高表 达。最好多试用几种不同的载体及宿主细胞。
研究现状 ①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研
究迈向生产或中试生产阶段。 ②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞
系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激 活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生 成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。 有些产品已投入临床应用或试用。
与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在 于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖 基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能， 因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能 方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开 始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余 年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因 工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的 结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。
提高蛋白表达产量的措施
1．转录水平 在目的基因拷贝数一定、整合位点固定的情况下，转
录作为基因表达的第一步，提高转录效率对一个高效表 达载体的构建来说显得尤为重要。启动子及其相应增强 子、转录终止信号及polyA加尾信号对转录水平的高低 及mRNA的稳定性有很大影响，其中强启动子、强增 强子是提高转录水平的关键因素。
③虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表 达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处 在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/ l08细胞 /24小时。有人认为其限速步骤可能是在工程细 胞中重组蛋白的分泌效率较低。
1 表达载体 1．1 表达栽体的类型 哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转
期的调控机制等各方面机理认识的不断深入，可以通过 载体的系统优化，将编码细胞生长刺激因子、黏附因子、 扩展因子、抗凋亡因子、转录翻译的反式作用因子以及 其他细胞生长存活所必需的成分的基因和顺式表达调控 元件敲人宿主细胞，以提高其表达；
与此同时把不利于目的基因表达的基因从宿主细胞中 敲除或下调其在宿主细胞中的表达，从而把细胞改造为 能在PFM中培养、培养的前期细胞增殖快、当细胞密度 达到理想值时细胞长时间不增殖、抗凋亡能力强、高表 达目的基因的宿主细胞，最终大幅度降低哺乳动物细胞 生产蛋白质类药物的成本。
3 表达系统 根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分
为瞬时、稳定和诱导表达系统。 瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选
择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白 的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周 期短。大规模的瞬时表达技术是 近年来的一个研究热 点。已有报道能放大到100 L反应器中生产重组蛋白， 产量(分泌型蛋白)可达l~10 mg/L。不过该方法技 术条件要求高，如质粒的纯度、转染的效率等。
4 增加目的基因拷贝数 单拷贝或低拷贝目的基因，无论表达载体调控
元件如何优化、整合的染色体位点多么合适，其外 源基因表达量都是有限的。因此，通过增加目的基 因拷贝数来获得高表达重组药物的CHO细胞工程株是 基因工程药物研究中不可或缺的一步。
5 宿主细胞的改造 随着对细胞周期、细胞凋亡、信号传导，以及细胞周