第四章 酶法分析

优点：



不需要特殊复杂的设备和仪器 灵敏度高 重复性好 对健康无害
应用前景



食品卫生 环境污染生化 指标 临床医学
“瘦肉精”快速检测新技术 ——竞争酶标免疫法
“瘦肉精”（学名盐酸克伦特罗）为一种人工合成的 作用于β —肾上腺受体的兴奋剂，常用来防治哮喘、肺气 肿等肺部疾病，当其应用剂量达到治疗量的5—10倍时， 可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此将其俗称为“瘦 肉精”。
应用时应考虑两个问题，即工具酶的用 量与反应的平衡点。
终点法要操作中应注意：
(1)被测的底物浓度必须十分小，并控制反 应于1级反应水平。因为这样可以使反应迅速 达到平衡点防止过多的产物生成，避免逆反 应；减少工具酶的用员。 (2)其它因素应尽量处于最适水平，双底物 反应的另一底物应具有足够高的浓度。 (3)酶的用量要高，以保证反应较快地达到 终点。
底物？ pH？ 温度？ 样品？
二、测定中应注意的问题 1.初速度
底物浓度对酶速的影响
浓度选择： a） [s]>=100Km； b） 有时不宜采用高底物浓度（有 毒性、价高、溶解度小、抑制 酶反应等)则根据具体条件，通 过实验选一适当浓度。
作用于待测酶产物的其它酶；
（如腈水合酶与酰胺酶） 其它因素。
三、酶标免疫分析法
Enzyme Immunoassay (EIA)
在70年代初，从放射免疫分析发展起 来的一种称为“酶标免疫”的分析方法， 它是将免疫学的专一性和酶的高效催化能 力有机地结合在一起，建立的一种高度特 异、灵敏的分析方法。
放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)是用放射 性同位素标记抗原Ag*，该抗原与未标记抗原Ag竞 争结合抗体(Ab)结合位点时的能力相同，所以反应 生成的Ag*-Ab复合物与Ag的量呈负相关。Ag*-Ab的 生成量可通过测定其放射活性得到，然后根据已知 浓度抗原的标准曲线就可以计算出样品中抗原浓度， 这种分析方法称为放射免疫分析。
A
E1
B
E2
C
被测反应的产物是某脱氢酶的底物,即B 是脱氢酶E2的底物,测定系统中加入足量的 脱氢酶E2和NADH,使反应进行到C,然后通过 NADH的特征变化而测知。
HK 被测反应：
G + ATP
G6PDH
G-6-P + ADP NADPH + 6-PGCOOH
偶联指示反 应： G-6-P
+ NADP
（关键是工具酶的专一、高纯、且过量，以保证被测反应的v是总反
应系统中的限速因子，测得的指示反应速度 和E1浓度间呈线性关系）
举例：α-淀粉酶活力测定
1.标准碘液法 原理：淀粉对碘呈蓝黑色的特异性逐渐消失， 消失的速率与酶活性有关。 方法：终止法 稀盐酸 测吸光度 2.DNS法 α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷 键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精 等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又 称为液化酶。 方法：终止法 热变性 测吸光度
三 酶活力的测定方法
（二）动力学法 是连续测定酶反应过程中底物、 产物或辅酶的变化量，可以直接测 定酶促反应的初速度。
三 酶活力的测定方法
（三）酶偶联法
指选择另一种酶与酶发生偶联反应， 即第一种酶E1所催化的产物作为E2的底 物，通过测定第二个酶促反应产物的量 变化来测的活力，此法适用于活力不高 或所催化产物不便测定的一些酶活力测 定。
第四章 酶分析法
酶分析法：
酶活力测定（酶研究的一部分） 酶法分析（酶作为分析的工具）
前者的目的在于检知样品中某种酶 的含量或活性，后者则主要用于测定与 生物学有关的样品中酶以外其它物质的 含量。两者检测对象不同，但原理基本 一致：酶的专一性、高效性，通过酶反 应速度测定物质的变化进行定量分析。
酶分析
空白是指待测酶反应以外的其它反应（杂酶、 自发反应）引起的变化量 空白值可通过不加底物、不加酶、或两者都加 而预先使酶失效而测定 例如： GPT 测定中 —— 先不加底物；
酸性磷酸酯酶中 —— 先不加酶； 对照是指用标准酶（或纯酶）测得的结果， 与样品酶对照来定量。
三 酶活力的测定方法
（一）终止法 是使酶促反应进行一定时间后， 终止其反应，再用化学或物理方法 测定产物或底物变化的量。

测酶活力就是在确定的最适反应条件下 测定酶促反应速度，
酶促反应速度取决于那些因素 ——速度方程
？
测定酶活力的基本要求：
1、要使反应系统中除待测酶浓度是影响反应速度 的唯一限制性因素（反应速度定量酶活力）； 2、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大 能力）； 所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下 几方面做工作：
第一节、酶活力的测定
一、酶活力测定（一）基本定义
二、
酶活力
（一） 酶活力 酶活力activity： 酶催化一定化学反应 的能力。用酶催化的反应速度来表示酶 活力，即用单位时间内，单位体积中底 物的减少量或产物增加量来表示。
转换频率：单位时间转化的底物分子数。
Kcat,单位1/s
（二）酶活力单位及比活力
（三）、酶法分析包括两个步骤：
1.酶反应 在适宜的条件下进行催化反应
2.检测 测定反应前后物质的变化情况，可以测 定底物的减少、产物的增加或辅酶的变 化
（四）酶法分析分类
1.单酶反应定量 使用单一酶与底物反应，然后测出物质 前后变化，确定底物的量。 2.偶联酶反应定量 利用两种或以上酶的联合作用，使底物通过 两步或多步反应，转化为易于检测的产物， 从而测定被测物质的量。 单酶反应的底物或产物不便用常规方法 检测时。


当人们食用含有残留的肉品（特别是内脏）后常 造成心动过速，低血钾，低磷酸盐血症，肌肉震 颤，头晕，口干，失眠甚至瘫痪等中毒症状，重 则引起人的死亡。 色谱分析法一直是用作检测“瘦肉精”的方法， 但是昂贵的设备及复杂的前处理工作不适用于基 层的快速检测，而采用竞争酶标免疫检测试剂盒 则可经济、快速地检测（100个样品3个小时）。
检测方法：

当人体被“非典”病毒感染并产生抗体之后，即用病人的 血清(抗体)与检测试剂进行反应，呈阳性反应的说明受试 者已受病毒感染。 但对于发病早期还未产生抗体的病人，阴性结果也不能说 明受试者未受病毒感染。仍需进行跟踪检测，如果超过 “非典”潜伏期之后仍没有检测出抗体则可排除患病的可 能。 所以，在ELISA法中，有IgM，IgG两种抗体产生的患者即 可确定为“非典”感染者。而对阴性结果仍需进行跟踪检 测。
海洋污染生化指标研究 ——金属硫蛋白酶免疫法

原理： 金属硫蛋白是一种能被重金属诱导的富含半 胱氨酸的低分子量蛋白质。当环境存在着诸如 汞、银、铅、镉等重金属时，便能诱导生物体 内金属硫蛋白的合成，且在一定浓度范围内成 正比。因此，海洋生物体内的金属硫蛋白可作 为重金属污染的指标来研究。
试验内容：
酶活力单位U（active unit）：是根据 某种酶在最适条件下，单位时间内被酶 作用的底物的减少量或产物的生成量来 规定的，表示酶活力高低。 IU：umol/min Kat：mol/s
1 Kat=6×107 IU
酶的比活力 指每mg酶蛋白（或每mg 蛋白氨）所含的酶活力单位数即：比活 力=活力单位数/酶蛋白（氮）mg
表示酶制剂的纯度，比活力愈高，酶愈纯。
（二）测定方式有二：
1. 测定一定时间内的化学反应的量 通常测定在一定时间内最适于酶的条件下 酶促反应产物的生成量。 如蛋白酶的活力，可据酶催化酪蛋白水解 生成的酪氨酸与酚试剂作用蓝色反应，再用 比色法测定之。 2. 测定完成一定量反应所需的时间，测定酶 所催化的一定量底物的减少或一定量产物的 生成所需的时间，酶活力与之成反比。
第二节 酶法分析
在进行酶法分析时，先要根据分析 对象选择适它的“工具酶”，然后再通 过酶反应的测定，并借助相应的校正曲 线来检知它们的浓度或含量。在上述几 种检测对象中，除了底物可以采用总变 量分析法（终点法）外，相同，但其所用 的酶量必须一定，除了相应的被测因素 的浓度应控制在限速水平以外，其它反 应成份均须保证处于恒定和最适。
四 酶循环分析法
酶循环分析法是在上述酶分析基础上， 为适应神经生化等定量测定单个神经细胞 中的酶及其它微量物质的需要，通过两种 相关的酶反应组合、放大而发展起来的一 种超微量分析法，它具有极高的灵敏度， 可测定10-15克分子水平的生物物质。
原理：酶循环分析法是利用在专一性上
相互关联的两种酶反应相互组合、循环， 使微量的酶活性或其它物质增幅放大以达 到定量测定目的的分析方法。


在对SARS这种高传染性疾病的斗争中， ELISA能够 作出快速的检测，尽量缩短具传染性的病人与人群 的接触。
综上所述，酶标免疫分析法具 有广阔的应用前景，这需要我们去 逐步开发！
酶标仪
即酶联免疫检测仪，是酶联免疫吸附 试验的专用仪器。可简单地分为半自动和 全自动2大类，但其工作原理基本上都是 一致的，其核心都是一个比色计,即用比 色法来分析抗原或抗体的含量。 ELISA测 定一般要求测试液的最终体积在250u l以 下，用一般光电比色计无法完成测试，因 此对酶标仪中的光电比色计有特殊要求。

筛选了对镉敏感的底栖鱼类,并确定了镉诱导 鱼金属硫蛋白的最适诱导条件。
从镉诱导的鱼肝脏分离纯化金属硫蛋白并对某 些性质（氨基酸组成、分子量、等电点等）进 行研究。


纯化的金属硫蛋白对兔进行免疫，兔抗血清纯 化后并标记辣根过氧化酶，ELISA法测定金属 硫蛋白。
非典型肺炎ELISA检测技术

酶联免疫吸附分析 的特点是特异性强、 反应灵敏、检出率 高，是世界卫生组 织(WHO)推荐的病 原抗体临床检测的 主要方法。
（Enzyme Assay）
以酶为分析对象，目的是检测食品、药物 体液等生物样品中酶的含量或活性； 如：血液中谷丙转氨酶、淀粉酶等测定；