必修一 蛋白质提取与分离

②底塞的制作：
打孔
挖出凹穴
安装移液管头部
覆
盖尼龙网
100目尼龙纱包好
底塞中插入玻璃
管
注意：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹 穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋 白质分离不彻底。
实验操作
（三）纯化——凝胶色谱法
实验操作
（三）纯化——凝胶色谱法
2．凝胶色谱柱的装填
（1）凝胶的选择： 交联葡聚糖凝胶G-75
实验操作 （二）粗分离——透析
实验操作 （二）粗分离——透析
实验操作 （二）粗分离——透析
提示： 1、缓冲溶液的作用：模拟细胞内的pH环境，保证血 红蛋白的正常结构和功能。 2、维持小分子扩散驱动力和透析速率： ①膜两侧溶液趋于平衡时，需要置换缓冲液； ②缓冲液和样品的最佳体积比为500：1。 3、装样时，不可装太满，须留出一半空隙，适当排出 空气，以防溶剂渗入造成样品体积增加而引起透析袋 涨破。
①性质：一些微小的多孔球体，球内含许多贯穿的通 道；具有多孔的凝胶叫分子筛。 ②化学本质：多糖类化合物： ③实例：葡聚糖、琼脂糖：
混合物 洗 大分子流动快 上 柱 脱 小分子流动慢
收集 大分子
收集 小分子
洗脱：
从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
原理： 当不同的蛋白质通过凝胶时
实验操作 （一）样品处理
2.血红蛋白的释放
红细胞
烧杯
加蒸馏水 到原血液 的体积
40%体积甲苯
红细胞 红细胞
红细胞破裂，释放出血红蛋白 磁力搅拌器搅拌10min
实验操作 （一）样品处理
磁力搅拌
实验操作 提示：
（一）样品处理
1. 蒸馏水的作用是_____使__红___细__胞__大__量___吸__水__胀__裂_____。 2. 加入甲苯的作用是___溶__解__红___细__胞__的__细___胞__膜_______。 3. 充分搅拌的目的是___加___速__红__细__胞___的__破__裂_________。
白 4个亚铁红素基团
相对分子量： 约为64000-68000KD
实验操作 （一）样品处理
1. 洗涤红细胞
3g柠檬酸钠 500 r／min
离心2min
血液 低速短时 100mL 间离心
吸出血浆 5倍体积生理盐水
血浆 红细胞
红细胞
缓慢搅拌10min 重复洗涤3次，直至上清液没有黄色
采样分离－吸浆倒红－加液搅拌－重洗三次
“G“——凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。 75——凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。
第3层： （ 血红蛋白 ）的水溶液层 （ 红色透明 ）的液体
第4层： 其它杂质（暗红色 ）的沉淀层
实验操作 （一）样品处理
提示： 1、红细胞混合液含有： 细__胞___破__碎__物__、___脂__质__、__甲__苯__ 等 2、滤纸的作用： ___过__滤__除__去__脂___质__和__细__胞___破__碎__物 3、分液漏斗的作用是：_分__离___血__红__蛋__白___和__有__机__溶__剂
实验操作 （二）粗分离——透析
实验操作
（三）纯化——凝胶色谱法
混合物 洗 大分子流动快 上 柱 脱 小分子流动慢
收集 大分子
收集 小分子
洗脱：
从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
实验操作
（三）纯化——凝胶色谱法
1、凝胶色谱柱的制作
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用 砂纸磨平。
实验操作 提示：
（一）样品处理
1、柠檬酸钠的作用是 ：___防__止__血___液__凝__固__________ 抗凝剂都要迅速、轻柔、反复混合均匀
2、低速短时离心： _防__止__白___细__胞__和__淋___巴__细__胞__沉___淀__ 3、洗红细胞的目的是：____去__除__杂__蛋__白____________ 4、缓慢搅拌的目的是： ___防__止__红___细__胞__破__裂________
相对分子质量较小 容易进入
凝胶内部的通道
相对分子质量较大 无法进入凝胶 内部的通道
只能在凝胶外部移动
路程较长 移动速度较慢
路程较短 移动速度较快
相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
血液组成成分
1、样品 处理
2、粗分离
（1）洗涤红 细 胞 （2）释放血红蛋白 （3）分离血红蛋白 （4）透析血红蛋白
实验操作 （一）样品处理
3.分离血红蛋白溶液
红细胞 混合液
中速长时 离心
2000 r／min 离心10min
脂类物质 细胞破碎物沉淀
静置片刻
滤纸 过滤
烧杯 离心管
有机溶剂 血红蛋白
实验操作 （一）样品处理
第1层（最上层）： （无色透明）甲苯层
第2层： （ 脂溶性物质 ）的沉淀层， （ 白 ）色薄层固体
ຫໍສະໝຸດ Baidu
实验操作 （二）粗分离——透析
目的：除去样品中分子量较小的杂质。 说明：透析膜是半透膜， 蛋白质是大分子，它不 能透过透析膜，而小分 子物质可以自由通过透 析膜与周围的缓冲溶液 进行溶质交换，进入到 透析液。
实验操作 4、透析
（二）粗分离——透析
透析袋
1ml血红蛋白溶液
磷酸缓冲液300-500ml 20mmol/L， pH为7.0
3、纯化
凝胶色谱法进行纯化
4、纯度鉴定 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验操作 ①血液组成
（一）样品处理
水分
血浆蛋白
血浆
无机盐
血 液
固体物质 磷脂
葡萄糖等 白细胞
血细胞 血小板
红细胞 （最多）
血红蛋白 （90％）
材料：哺乳动物血液
实验操作 （一）样品处理
亚铁血红素基团
血 2个a－肽链
红 蛋
2个β一肽链
专题5 课题3 血红蛋白的提取和分离
蛋白质提取和分离原理
蛋白质提取与分离的依据—— 蛋白质的物理化学性质差异 1.分子的大小 2.电荷性质和多少 3.溶解度 4.吸附性质 5.对其他分子亲和力
凝胶色谱法
根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小， 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。
凝胶
透析12小时液
实验操作 （二）粗分离——透析
步骤
1、透析袋准备：将透析袋剪成10-20cm的小段， 在10mmol/LNaHCO3-1mmol/LEDTA中煮沸 30min，用蒸馏水洗净，备用。 2、装样：取一段透析袋，将其一端用透析夹夹住， 由开口端加入1ml血红蛋白溶液，用透析夹夹住袋口。 3、透析：取大烧杯加入缓冲溶液或去离子水，将装 好样的透析袋悬于烧杯中部，期间，多次置换缓冲 溶液。