胶体金标记技术
免疫胶体金技术
The gold conjugate must be purified from excess antibody and any small clusters removed before concentrating and storing. Spin the gold conjugate at speeds according to gold particle size . The gold conjugate will form a loose precipitate at the bottom of the tube. Discard the clear supernatant and resuspend the pellet with proper buffer.
. 劣质金外形不均一，且非球形，有凝集现象，颗粒间变异系数较大
How are the antibodies coupled to the gold?
Conjugation of antibodies to gold particles depends upon three separate but dependent phenomena : a). ionic attraction between the negatively charged gold and the positively charged protein b). hydrophobic attraction between the antibody and the gold surface c). Sulfur binding (Cysteine and Methionine)
胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。 需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可.
胶体金免疫标记原理
胶体金免疫标记原理咱先得知道啥是胶体金呢。
胶体金啊，就像是一群超级小的金粒子在溶液里开派对。
这些金粒子小得不得了，直径也就几个到几十个纳米。
它们在溶液里形成一种胶体状态，就像一群小精灵在水里欢快地游来游去。
胶体金有个很厉害的特性，就是颜色特别好看，不同大小的胶体金粒子还会呈现出不同的颜色呢，从酒红色到紫红色都有。
那这胶体金和免疫标记咋就联系上了呢？这就像是给胶体金找了个特殊的工作。
免疫标记呢，简单说就是要把能识别特定东西的抗体或者抗原给标记出来。
咱们身体里有免疫系统，抗体就像一个个小卫士，专门去识别那些外来的坏家伙，也就是抗原。
胶体金免疫标记就是把胶体金和抗体或者抗原结合起来。
想象一下啊，胶体金粒子就像一个个小珠子，抗体就像小钩子。
咱们通过一些巧妙的化学方法，就把小钩子挂到小珠子上啦。
这个过程就像是给小珠子穿上了一件有特殊功能的衣服。
当我们要检测一个样本里有没有特定的抗原或者抗体的时候，这个胶体金标记就大显身手了。
比如说我们怀疑一个样本里有某种病毒，这种病毒就是抗原啦。
我们把胶体金标记的抗体放进去，如果样本里有这个病毒，那标记了胶体金的抗体就会像找到目标的小导弹一样，“嗖”地一下就和病毒结合在一起。
然后呢，因为胶体金有颜色呀，一旦结合了，我们就能看到颜色的变化。
就好像是小珠子和病毒结合之后，它们就开始发光发亮，告诉我们：“我们找到目标啦！”如果没有那种病毒，那标记的抗体就找不到结合的对象，就不会有那种特殊的颜色变化。
这个胶体金免疫标记还有很多优点呢。
它操作起来比较简单，不需要那些特别复杂的仪器。
就像咱们做手工一样，只要按照步骤来，很容易就能完成检测。
而且它检测速度还挺快的，就像短跑运动员一样，很快就能出结果。
再说说这个胶体金免疫标记在实际生活中的应用吧。
在医疗领域，它可帮了大忙了。
比如说检测传染病，像新冠疫情的时候，胶体金法的检测试剂就发挥了不小的作用呢。
它能快速地检测出一个人是不是感染了新冠病毒。
胶体金标记工艺
胶体金标记工艺胶体金标记工艺是一种常用于生物医学领域中的标记技术。
该技术利用纳米级的金颗粒作为标记物，通过将其附着在生物分子表面上，实现对分子生物学、细胞生物学等领域中的生物实体进行追踪和观察。
在医学领域中，胶体金标记工艺具有较高的生物相容性和生物学稳定性，并且该技术标记出的分子具有较明显的颜色，方便观察和分析。
胶体金标记工艺的步骤主要包括：制备胶体金溶液、表面修饰、选择适宜子和标记反应。
首先，需要制备胶体金溶液，一般采用还原金盐的方法制备，即在还原剂的作用下，将金盐还原成具有红色或蓝色色泽的胶体金颗粒。
其次，在得到的胶体金颗粒表面修饰，以增强这些颗粒的稳定性和生物相容性。
接着，通过选择适宜的生物分子，例如抗体、酶、 DNA 等，将其与表面修饰的胶体金颗粒结合，形成金标记化合物，标记出需要研究的生物实体，例如细胞、蛋白质等。
胶体金标记工艺具有一些优点，包括：①生物相容性优良，可以应用于生物体内；②标记物稳定性高，可以长时间保存；③信号强度高，可观察性好。
此外，该技术在应用上有很大的灵活性，可以选择不同大小、形状的胶体金颗粒和不同种类的生物分子，作为标记物进行应用。
然而，胶体金标记工艺也存在一些挑战，例如：①标记物数量难以准确控制；②标记物存在信号交叉的情况；③标记物在复杂生物环境下的作用机理尚不完全清楚。
此外，胶体金标记工艺的应用需要严格控制实验条件，以避免样本干扰和实验误差的影响。
综上所述，胶体金标记工艺是一种应用较广泛的标记技术，不仅在生物医学领域有着广泛的应用前景，也在其他领域，例如材料科学和化学分析等方面有所涉及。
然而，对于该技术进行应用时需要注意实验条件的控制，以便能够获得准确可靠的实验结果。
未来，随着生物技术的发展，胶体金标记工艺将会在更多领域得到应用和推广。
胶体金免疫标记技术
胶体金免疫标记技术胶体金免疫标记技术一、胶体金的制备一、胶体金的制备 根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm 的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm 范围内。
范围内。
在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。
水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。
使用不同种类、使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。
即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。
还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，因此产生的胶体金粒子数量越多，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。
但体积也越小。
但体积也越小。
粒子直径每增加一倍，数量减少为粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。
以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm 的胶体金。
因此一般胶体金探针均使用该方法进行。
但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。
聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。
此时在溶液中添加此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能够去除这些残基。
双标记或制备5-10 nm 的胶体金时建议使用该方法。
的胶体金时建议使用该方法。
利用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150 nm 直径的胶体金。
但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。
因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 12-16 nmnm 直径的胶体金。
金。
除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5 nm 的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。
磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，题，但所形成的金粒子体积变化较大。
磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法故该方法已经很少使用。
已经很少使用。
氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g 或1g ），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 1.5 ml ml 试管分装为1 1 ml ml 保存（-20℃）。
免疫胶体金技术
面临挑战与解决策略
技术挑战
提高胶体金的合成效率、稳定性和生物相容性，降低生产成本，推动技术的实际应用。
应用挑战
拓展免疫胶体金技术在生物医学领域的应用范围，提高其在实际应用中的准确性和可靠 性。
法规与伦理挑战
建立健全相关法规和标准体系，规范免疫胶体金技术的研发和应用，确保其安全性和有 效性。同时，关注伦理问题，尊重人类生命和尊严，推动技术的健康发展。
环境毒理学研究
毒性评估
利用免疫胶体金技术，可以研究 环境污染物对生物体的毒性作用 ，评估其对生态系统和人类健康
的影响。
毒理机制研究
该技术可用于揭示环境污染物与生 物体相互作用的分子机制，为环境 毒理学的深入研究提供有力工具。
污染物代谢研究
通过免疫胶体金技术，可以研究环 境污染物在生物体内的代谢过程， 了解其在生物体内的转化和排泄途 径。
食品营养成分分析
蛋白质检测
利用免疫胶体金技术，可以准确测定食品中的蛋白质含量，为食品 的营养价值评估提供依据。
维生素检测
该技术可用于食品中多种维生素（如维生素A、维生素E等）的定量 分析，有助于评价食品的营养成分组成。
矿物质检测
通过免疫胶体金技术，可以检测食品中的矿物质元素含量，如钙、铁 、锌等，为食品的营养价值提供全面数据。
02
免疫胶体金制备技术
原料选择与处理
01
02
03
氯金酸的选择
选择高纯度的氯金酸作为 原料，确保胶体金的合成 质量。
还原剂的选择
常用还原剂如柠檬酸三钠 、抗坏血酸等，用于将氯 金酸还原为金颗粒。
溶液配制
将氯金酸溶解在适量超纯 水中，配制成一定浓度的 氯金酸溶液。
胶体金合成方法
胶体金标记抗体技术实验原理
胶体金标记抗体技术实验原理胶体金标记抗体技术是一种常用的生物分析技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
本文将介绍胶体金标记抗体技术的实验原理。
胶体金是一种具有特殊光学性质的纳米材料，其颗粒大小约为5-100纳米。
在胶体金标记抗体技术中，将胶体金颗粒与抗体分子进行特异性结合，使抗体的检测变得更加灵敏和准确。
实验过程中，首先需要制备胶体金溶液。
一般采用氢氯酸还原法，将金盐溶液与还原剂混合后，通过调节pH值和温度等条件，使金离子还原生成金纳米颗粒。
随后，通过离心等方式将胶体金颗粒分离出来，并进行洗涤和稳定处理。
接下来，需要将抗体与胶体金颗粒进行结合。
这一步骤需要将抗体分子与胶体金表面的化学官能团进行共价结合或吸附结合。
共价结合一般采用交联剂如戊二醛等进行，而吸附结合则是通过静电作用或亲疏水性相互作用实现的。
结合完成后，可以对标记的抗体进行检测。
常用的方法包括光谱分析、电化学分析和显微镜观察等。
通过测定胶体金颗粒的表面等离子共振吸收峰位移、电流变化或颗粒颜色变化等参数，可以定量或定性地检测目标物质的存在与否。
胶体金标记抗体技术的原理基于胶体金颗粒特殊的光学性质。
胶体金颗粒在可见光波长范围内具有很高的吸收和散射能力，这是由于表面等离子共振现象的存在。
当胶体金颗粒与抗体结合后，抗体的特异性识别能力可以将胶体金颗粒引导到目标分子的位置。
这种结合可以通过光谱分析等方法进行定量或定性检测。
胶体金标记抗体技术具有许多优势。
首先，胶体金颗粒具有较高的物理化学稳定性和生物相容性，可以在生物样品中稳定存在。
其次，胶体金颗粒的表面容易与抗体等生物分子进行结合，使得标记过程简单方便。
此外，由于胶体金颗粒的尺寸可调控性较好，可以通过调节颗粒大小来实现信号放大效应，提高检测的灵敏度。
总结起来，胶体金标记抗体技术是一种重要的生物分析技术，其原理是利用胶体金颗粒的光学性质和抗体的特异性识别能力进行目标物质的检测。
通过合理设计实验方案和优化实验条件，可以实现高灵敏度、高选择性和低成本的生物分析。
胶体金金标检验法
胶体金（金标）检验法胶体金是一种常用的标记技术，有其独特的优点。
近年已在各种生物学研究中广泛使用。
免疫胶体金技术的基本原理是：氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。
由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。
胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。
免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见紫色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。
为什么霍乱可以用胶体金（金标）检验法进行快速筛查？霍乱弧菌快速检测卡是利用单克隆抗体胶体金标记技术和膜层析技术研制而成，用于定性检测样本中可能存在的霍乱弧菌的特异性抗原A及O139血清型。
首先按常规方法制备并筛选出效价高的抗O1群A 抗原和抗O139抗原的单抗细胞株。
然后采用枸缘酸钠还原法制备胶体金颗粒，选择玻璃纤维吸附最适浓度的金标抗体。
按常规方法免疫家兔，制备霍乱弧菌的多克隆抗体。
根据检测对象（疑似病人粪便）的特殊性，研制了特异的稀释液。
一方面可裂解细菌，释放抗原，提高检测敏感性，另一方面可起到防止污染的作用。
经二年多的反复试制，我公司完成的霍乱弧菌O1群（O139）快速检测试纸，其对霍乱弧菌最低敏感性10分钟内106菌/ml阳性，达到临床最低检出量的要求，符合卫生部《霍乱防治手册》要求，且对高浓度的菌液109 菌/ml无前置反应；用萃取液、正常人粪便标本及其它大肠中寄生菌进行的特异性鉴定表明，该试纸条特异性为100%金特敏? 霍乱快速检测卡的特点是什么？最低检出量：不低于105cfu/ml适合临床需要。
快速出结果：稀释直接裂解细菌，10分钟观察结果满足疾病控制要求。
便利使用：独立包装，“插”式设计，操作简捷，避免二次污染。
胶体金标记抗体的方法
胶体金标记抗体的方法
论文题目：胶体金标记抗体的方法
一、背景介绍
胶体金标记抗体技术是一种用于识别特定的抗原分子的技术，经常用于实验，特别是免疫组织化学实验，因为它可以使实验处理变得非常容易和简单。
利用胶体金标记抗体技术，可以可靠的识别和定位细胞内外的抗原物质，由此可以定位抗原的生物功能。
改变标记抗体的发光属性，使得研究者可以使用它来测量抗原的广泛性和准确性，比如表观遗传的分布及活性等。
二、胶体金标记抗体的基本原理
胶体金标记抗体技术是将猪胰抗体固定到表面的胶体金粒子上，这些抗体除了能够和其特殊抗原结合之外，还可以结合各种抗原，使得它们可以同时具有多种抗原的识别能力，而不必更换抗体。
三、胶体金标记抗体的方法
1.准备胶体金标记抗体
首先需要准备好抗体，抗体需要具有较强的稳定性，能够长期稳定保存。
抗原物质可以通过血清或免疫实验中获得，此外，免疫实验也可以检测出异常表达抗原。
2.培养胶体金标记抗体
培养抗体需要使用胶体金粒子，这些粒子可以通过电离法制备。
制备好的胶体金粒子可以用来培养抗体。
培养抗体需要将抗体溶液稀释到一定浓度，然后将稀释好的抗体注射到胶体金粒子表面，使得抗
体结合到胶体金粒子表面上。
3.加入抗原
将抗原溶液加入胶体金标记抗体溶液，使抗体和抗原结合，产生特定的复合体。
4.检测抗原
完成抗原结合到胶体金标记抗体上之后，可以使用荧光显微镜或免疫荧光来检测结合的抗原，从而得到抗原的准确位置。
四、结论
胶体金标记抗体技术可以有效的识别不同抗原的位置，使得实验处理变得更加容易，并且效果也得到改善。
第5章 常见免疫学检测技术-胶体金免疫层析
夹心法反应演示
阳性
阴性
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
©②间接法检测抗体
间接法反应演示
阳性
阴性
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
©③间接竞争法
竞争抑制法反应演示
阴性
弱阳性
阳性
检测线颜色强度与样品浓度负相关
竞争法结果判断
（三）胶体金免疫测定技术
ª 2.胶体金免疫层析试纸条制作 § （1）试剂、耗材准备 § （2）金标抗体的制备 § （3）试纸条的组装 § （4）试纸条的优化 § （5）样品检测及分析
ª 2.胶体金（免三疫）层胶析体试金纸免条疫制作测定技术
§ （1）试剂、耗材准备
• 硝酸纤维素膜的参数：孔径、对称性、层析速度、表面 活性剂、蛋白结合力、强度、表面质量、厚度、批间均 一性等
• um 指的是膜孔径，但膜在生产过程中，由于干燥成型 等过程的非绝对均一，膜的孔径也是非均一的，不同厂 家膜孔径标准无法统一衡量
（三）胶体金免疫测定技术
ª 1.主要形式（基本原理） § 斑点金免疫渗滤/dot immunogold filtration
assay, DIGFA § 胶体金免疫层析/immunochromatography assay,
ICA--试纸条
（三）胶体金免疫测定技术
§ （1）斑点金免疫渗滤
原 • 以硝酸纤维素膜作为固相载体、包被抗 理 原或抗体
（二）胶体金的制备
® 一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣 酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等
ª 以柠檬酸三钠还原法为例 § 取0.01% HAuCl4 溶液100 mL 搅拌、加热、回
流，沸腾2 min, 迅速一次加入一定量的 1% 柠 檬酸三钠水溶液（现配），保持低沸，经由蓝、 灰、至呈现透明的橙红色停止加热。回流冷却至 室温（应为原体积，否则应用蒸馏水恢复体积） § 加入柠檬酸钠的量不同，胶体金颗粒大小不同
结核菌抗体检测试剂盒(胶体金法)
结核菌抗体检测试剂盒(胶体金法)简介结核菌抗体检测试剂盒(胶体金法)是一种用于检测结核菌抗体的试剂盒。
结核菌抗体检测是一种常见的诊断结核病的方法之一。
该试剂盒通过胶体金技术，能够快速、准确地检测出患者体内是否存在结核菌抗体。
原理结核菌抗体检测试剂盒采用胶体金技术，其原理主要包括以下几个步骤：1. 样品处理：将待测样品进行处理，去除干扰物质，并提取出结核菌抗体。
2. 抗原检测：将提取的结核菌抗体与试剂盒中的结核菌特异性抗原结合，形成免疫复合物。
3. 胶体金标记：将胶体金颗粒标记于抗原上，形成颜色变化。
4. 检测结果读取：通过目测或仪器读取，观察试剂盒内是否显示颜色变化，来判断结核菌抗体的存在与否。
优势结核菌抗体检测试剂盒(胶体金法)具有以下优势：1. 高灵敏度：该试剂盒能够对结核菌抗体进行高敏感度的检测，能够提高结核病的早期诊断率。
2. 高特异性：该试剂盒能够区分结核菌抗体与其他类似分子的差异，减少误诊率。
3. 快速便捷：试剂盒操作简便，结果快速可视化，可以在较短的时间内得出初步结论。
4. 高度标准化：结核菌抗体检测试剂盒采用标准化生产，保证了试剂盒的稳定性和可靠性。
应用范围结核菌抗体检测试剂盒(胶体金法)广泛应用于以下领域：1. 临床诊断：作为结核病的辅助诊断手段，可以用于结核病的早期筛查和诊断。
2. 流行病学调查：用于对结核病的流行病学状况进行调查分析。
3. 疫情监测：结合流行病学数据，对结核病疫情进行监测和预警。
注意事项结核菌抗体检测试剂盒(胶体金法)的使用需要注意以下事项：1. 严格按照试剂盒说明书进行操作，避免操作错误导致结果的不准确性。
2. 样品采集和处理要遵循规范，避免污染和交叉感染。
3. 结果的判断需要结合其他临床信息，不能单凭试剂盒结果作出诊断。
结核菌抗体检测试剂盒(胶体金法)是一种有效的结核病辅助诊断手段，能够提高结核病的早期诊断率和减少误诊率。
在使用时需严格遵守操作规范，结合临床信息进行判断。
胶体金标记技术
⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。
通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2，以A蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0。
以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。
（4）胶体金标记蛋白的纯化1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。
用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。
然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4℃离心1h；20nm～40nm胶体金结合物，14 000g，4℃离心1h。
仔细吸出上清，沉淀物用含1%BSA 的PB液（含0.02%NaN3），将沉淀重悬为原体积的1/10，4℃保存。
如在结合物内加50%甘油可贮存于-18℃保存一年以上。
为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10%～30%蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。
2）凝胶过滤法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。
将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1/5～1/10。
再经1 500r/min离心20min。
取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝胶S-400）层析柱分别纯化。
层析柱为0.8 cm×20cm，加样量为床体积的1/10，以0.02Mol/L PBS液洗脱（内含0.1%BSA，0.05%NaN3，pH8.2者用IgG标记物），流速为8ml/h。
按红色深浅分管收集洗脱液。
一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。
继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。
胶体金标记技术.ppt
胶体金标记技术
一、原理
胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏 血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗 粒（10、15、20、30、50nm），并由于静电作用成为一种稳 定的胶体状态，称为胶体金。
在适合的pH下，胶体金可与蛋白质分子的基团形成牢固 的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生 物特性。
➢ 胶体金免疫凝集试验。该试验具有试剂稳定、用量少、反 应快、结果易判定的特点。
➢ 胶体金免疫光镜染色。用标记有胶体金颗粒的抗体与组织 切片反应，在光学显微镜下观察胶体金颗粒结合部位，可 进行抗原定位分析。
➢ 胶体金免疫电镜染色。将病毒等抗原置于铜网上，加抗体 反应，再与SPA包被胶体金颗粒反应，在电镜下观察胶体 金结合部位，可用于抗原或抗体检测。
体效价水平。 如果T线无色带，则猪瘟抗体水平为0 如果T线颜色很深，则刚接种疫苗或野毒感染 如果Ab ≥24 ，则Ab水平较高 如果Ab < 24 ，则Ab水平偏低，不能抵抗猪瘟病毒感染
《动物检疫检验技术专业教学资源库》
胶体金标记技术 阳性 无效
阴性
无效
《动物检疫检验技术专业教学资源库》
胶体金标记技术
（2）将检测卡和检测样品恢复至室温后，再从铝箔袋中取 出，水平放置并做好标记。
（3）在检测卡的加样孔内加பைடு நூலகம்2-3滴待检学清，无气泡。 （4）静置20分钟，将观察窗内色带与比色卡色带滴度进行
对比，判断抗体效价水平。
《动物检疫检验技术专业教学资源库》
胶体金标记技术
3. 结果判定
（1）先观察C线，如果C线无色带，则检测卡无效，重新检测。 （2） C线有色带，再将T线的色带与比色卡色带比较，判断抗
胶体金试剂条检测igm原理
胶体金试剂条检测igm原理一、抗原抗体反应胶体金试剂条检测IgM的原理是基于抗原抗体反应。
IgM是免疫球蛋白的一种，是感染早期出现的抗体。
当人体受到某些病原体感染时，IgM会迅速产生并作为免疫反应的第一道防线。
因此，检测IgM对于感染性疾病的早期诊断具有重要意义。
抗原抗体反应是一种特异性结合反应，即抗原和抗体能够以共价键结合的方式识别和结合。
在胶体金试剂条检测中，抗原通常是一种与IgM特异性结合的分子，当这种抗原与IgM结合后，就会形成抗原-抗体复合物。
二、胶体金标记胶体金标记技术是一种常用的免疫标记技术，其基本原理是以胶体金作为标记物，利用胶体金具有高电子密度的特性，对某些物质进行标记和示踪。
在胶体金试剂条检测中，胶体金标记的是抗体，即与抗原相对应的特异性抗体。
当抗原与抗体结合后，胶体金会聚集在复合物周围，形成肉眼可见的红色沉淀。
三、层析过程胶体金试剂条的层析过程是利用微孔滤膜的毛细管作用，使液体在纸或其他材料上扩散。
在胶体金试剂条中，微孔滤膜上固定有抗原或抗体，当待测样本滴加到试剂条上后，随着层析过程的进行，待测样本中的IgM与固定在微孔滤膜上的抗原或抗体结合，形成复合物。
随着液体扩散，复合物沿着滤膜移动，最终聚集在检测线上。
四、显色反应当复合物聚集在检测线上时，由于胶体金的聚集作用，检测线会出现明显的红色沉淀。
这是由于胶体金颗粒之间存在着静电作用，使得它们容易在静电引力作用下聚集在一起。
未结合的成分则继续层析至质控线处被吸收。
五、结果判断通过观察试剂条上的显色情况，可以对结果进行判断。
如果检测线出现红色沉淀，而质控线也出现红色沉淀，则说明待测样本中存在IgM抗体；如果检测线未出现红色沉淀，而质控线出现红色沉淀，则说明待测样本中不存在IgM 抗体；如果质控线未出现红色沉淀，则说明该试剂条可能已经失效或者实验操作存在问题。
胶体金标记蛋白实验报告
一、实验目的1. 掌握胶体金标记蛋白的基本原理和方法。
2. 熟悉实验操作流程，包括胶体金的制备、蛋白质的处理、标记反应和标记效果的检测。
3. 了解影响胶体金标记效果的因素，并优化实验条件。
二、实验原理胶体金标记蛋白技术是一种基于抗原抗体反应的标记技术。
该技术利用胶体金颗粒的高电子密度特性，在抗原抗体反应处聚集形成肉眼可见的粉红色斑点，从而实现对蛋白质的定性或定量检测。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：蛋白质、胶体金溶液、磷酸盐缓冲液（PBS）、碳酸钾、盐酸、牛血清白蛋白（BSA）、透析袋等。
2. 实验试剂：氯金酸、还原剂（硼氢化钠、抗坏血酸盐等）、蛋白质A、抗体、FITC标记抗体等。
四、实验方法1. 胶体金的制备（1）取一定量的氯金酸溶液，加入适量的还原剂，搅拌均匀，观察溶液颜色的变化。
（2）待溶液颜色变为红褐色时，停止加入还原剂，继续搅拌5分钟。
（3）用碳酸钾溶液调节pH值至8.5左右，静置过夜。
2. 蛋白质的处理（1）将蛋白质溶液透析过夜，去除多余的盐离子。
（2）将蛋白质溶液离心，去除聚合物。
3. 胶体金标记蛋白（1）取一定量的胶体金溶液，用碳酸钾溶液调节pH值至蛋白质的等电点或偏碱性。
（2）将蛋白质溶液与胶体金溶液混合，搅拌30分钟。
（3）加入适量的BSA，封闭非特异性结合位点，继续搅拌30分钟。
（4）离心收集标记蛋白，用PBS洗涤，去除未结合的胶体金。
4. 标记效果的检测（1）采用肉眼观察法，观察标记蛋白的颜色变化。
（2）采用紫外-可见光分光光度法，检测标记蛋白的吸收峰。
（3）采用荧光显微镜观察，检测标记蛋白的荧光强度。
五、实验结果与分析1. 胶体金制备过程中，溶液颜色由金黄色逐渐变为红褐色，说明胶体金已经形成。
2. 蛋白质溶液透析后，颜色清澈，无杂质。
3. 胶体金标记蛋白过程中，溶液颜色由红褐色变为粉红色，说明蛋白质已成功标记。
4. 标记蛋白的吸收峰位于特定波长，说明标记成功。
5. 荧光显微镜观察结果显示，标记蛋白具有明显的荧光信号。
胶体金标记技术在免疫学中的应用
胶体金标记技术在免疫学中的应用胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。
1．液相免疫测定：将胶体金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原，如间接血凝一样，用肉眼可直接观察到凝集颗粒。
利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理，建立均相溶胶颗粒免疫测定法（Sol particle immunoassay ,SPIA）已成功地应用于PCG的检测，直接应用分光光度计进行定量分析。
2．金标记流式细胞术：胶体金可以明显改变红色激光的散射角，利用胶体金标记的羊抗鼠Ig抗体应用于流式细胞术，分析不同类型细胞的表面抗原，结果胶体金标记的细胞在波长632nm时，90度散射角可放大10倍以上，同时不影响细胞活性。
而且与荧光素共同标记，彼此互不干扰。
3．胶体金固相免疫测定法（1）斑点免疫金银染色法（Dot－IGS／IGSS）是将斑点ELISA与免疫胶体金结合起来的一种方法。
将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点，此称为斑点免疫金染色法（Dot－IGS）。
此反应可通过银显影液增强，即斑点金银染色法（Dot－IGS／IGSS）。
（2）斑点金免疫渗滤测定法（dot immuno－gold filtration assay, DIGFA）此法原理完全同斑点免疫金染色法，只是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。
在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。
此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。
免疫电镜胶体金标记法-1
免疫电镜胶体金标记法-1金标法是Faulk和Taylor（1971）提出的，并首先用于免疫电镜。
它是利用胶体金在碱性环境中带有负电的性质，使其与抗体相吸附，从而将抗体标记。
当用金标记的抗体与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色，不需加外进行染色。
在电镜水平，金颗粒具有很高的电子密度，清晰可辨。
因此，免疫电镜胶体金标记法近年来被成功地应用于生物学的各个方面，并取得了要喜的进展，解决了一些过去未能解决的问题，80年代以来似有取代免疫电镜 PAP技术的趋势。
胶体金标记抗体技术在电镜水平应用有许多优点：首先，手续不如PAP法烦琐，不需用H2O2等损伤微细结构的处理步骤，对微细结构的影响较少。
其次，金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下金颗粒清晰可辨，易于与其他免疫产物相区别。
因此，金标法还可以和PAP法相结合进行双重或多重染色的超微结构定位。
另外，利用不同直径的金颗粒标记不同的抗体，是研究突触小泡内神经递质共存的有力工具。
由于抗原抗体反应部位结合金颗粒数量的多少可进行粗略的免疫细胞化学定量研究。
金标抗体还可加入培养液中，对培养细胞内抗原进行标记定位。
曾有报告用金标记法于细胞内骨架的研究获满意的效果。
由于金具有强烈的继发电子的能力，因此，不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察，也可以用于扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。
金标液无毒性，对人体无损伤。
胶体金及胶体金标记物的制备见第五章第3节。
在原位分子杂交技术在电镜水平的应用中，胶体金的标记术被科技工作者认为是当前最理想的标记物。
一、电镜水平的免疫金染色法应用于电镜水平的免疫法，可分为包埋前染色和包埋后染色，由于包埋前染色对细胞膜的穿透性差，一般只用于细胞表面的抗原标记，如需穿透细胞膜，则需辅以冻融法或加入Triton X-100、皂素等活性剂，后者会加重细胞超微结构的破坏，因此，现较普遍采用包埋后染色，现分别介绍如下：1、包埋后染色（1）超薄切片厚50～70nm左右，载于200～300网孔的镍网上。
胶体金标记技术
胶体金标记技术胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。
由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精确。
因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。
现已广泛应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂的制造等领域。
用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初，1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。
1971年，Taylor又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。
近年来的研究表明，胶体金也可作为体外免疫加层试验的指示物。
由于胶体金作为标记物具有很多优点，因此自其问世以来，在国内外的许多研究领域中得到了迅速的发展。
近年来，它更多的被应用于免疫学和细胞学相关分子水平的检测中。
尤其随着人们物质生活的改善，有关人类健康的问题在现实生活中已显得非常突出。
从90年代至今的多篇报道都是关于动物体或人体相关抗体和病原体检测的。
制备方法在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界线十分清楚。
金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称其为胶体金。
胶体金的制作方法有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。
通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例（即增加或减少还原剂的量）可得到所需不同直径的金颗粒。
但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，所以目前常用后两种方法，以柠檬酸三钠还原法为例，有两种方法。
1．Frens标准方法：1)取0.01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL。
2)约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色，3)继续煮沸约5分钟后结束反应。
4)冷却后用0.1M K2CO3溶液调至所需PH值。
5)此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。
胶体金标记技术原理
胶体金标记技术原理
免疫胶体金技术的基本原理：
胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。
胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。
根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。
吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。
用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。
这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。
免疫金标记技术（Immunogold labelling technique）
主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。
金标抗体原理
金标抗体原理今天来聊聊金标抗体原理。
咱们先从一个生活中的小现象说起。
大家都看过神秘的预言纸条在水里显字的魔术吧？其实金标抗体原理有点像这个魔术通过特别的方式让原本隐藏的东西显现出来，只不过金标抗体原理背后是纯纯的现代生物技术啦。
那金标抗体到底是什么原理呢？金标抗体法属于胶体金标记技术。
胶体金是一种纳米级别的金颗粒，直径在1 - 100nm。
这些小小的金颗粒就像是一个个小的信号球。
这个技术把抗体和金颗粒结合起来，就像是给抗体穿上了一件金光闪闪的外套。
打个比方吧，如果把我们的身体想成一个复杂的迷宫，抗原呢就像是藏在迷宫里的小坏蛋。
我们的身体这个迷宫里还有很多各种各样的东西，怎么找到这些小坏蛋（抗原）呢？这就要说到金标抗体了。
金标抗体就像是一个个带着金色信号灯的小警察（这个比喻虽然不完美，但能帮助理解），它们专门去找那些跟它们匹配的小坏蛋（抗原）。
当这种带着金颗粒标记的抗体和抗原结合的时候，在检测的区域就会因为有金颗粒的聚集而显示出颜色变化。
比如检测怀孕的时候，其中的人绒毛膜促性腺激素（hCG）就是抗原。
在验孕棒上如果有金标抗体和hCG结合了，就会在特定的区域显示出红色或者其他颜色。
老实说，我一开始也不明白为什么小小的金颗粒和抗体结合就能起到这么精准的检测作用。
后来查询了很多资料才知道，这是因为胶体金本身就具有高电子密度的特性，能够很容易被肉眼所识别的同时，抗体又是特异性很高的生物分子，两者结合就像最精准的锁和钥匙一样，能准确地识别并结合相应的抗原。
说到这里，你可能会问那这个技术就这么十全十美了吗？当然不是。
在实际应用中也要注意一些条件，比如说温度、检测时间等都会影响结果的准确性。
而且金标抗体检测还可能假阳性、假阴性，像是如果检测前喝了大量的水可能会稀释尿液中的hCG浓度，就可能导致假阴性。
在在传染病的快速检测方面也广泛应用此技术，比如快速检测新冠病毒的抗原检测试剂很多就是基于金标抗体原理的。
这种原理的检测方式最大的有点就是快速、便捷，不需要昂贵的仪器设备就能获得初步的检测结果，在很多需要即时检测的场景，像是基层医疗单位，野外急救环境等都能快速确定患者可能的感染情况。
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胶体金免疫分析技术随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。
前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。
这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。
它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA 和斑点免疫层析分析DICA。
本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。
金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，是于1971年建立的一种信号显示技术。
此技术最初用于免疫电镜检查，由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。
此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。
近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。
胶体金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。
与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA 需数小时才能显示的结果。
因为在GIFA和GICA中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。
这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。
在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。
同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需时间较长。
故此技术做到了名副其实的POCT。
原理：将氯金酸（HAuCl4）用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒（胶体金），标记金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）或抗体，用于免疫印迹、免疫组织化学定位或快速免疫渗滤、免疫层析实验。
金标记免疫渗滤技术的原理同一般的免疫斑点试验，也是用已知抗原或抗体包被NC膜，再用金标记抗体或抗原来进行快速快速测定，阳性时斑点呈胶体金的红色。
改进之处为采用了渗滤装置，更加简便。
金标记免疫层析则是利用NC膜条状纤维的毛细管作用，使样品在涌动中与金标记物及包被在NC膜上的抗原或抗体结合，出现呈色的阳性信号。
胶体金的制备：在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界线十分清楚。
金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称其为胶体金。
胶体金的制作方法有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。
通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例（即增加或减少还原剂的量）可得到所需不同直径的金颗粒。
但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，所以目前常用后两种方法，以柠檬酸三钠还原法为例。
Frens标准方法：（1）取0、01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL.（2）约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色，（3）继续煮沸约5分钟后结束反应。
（4）冷却后用0.1M K2CO3溶液调至所需PH值。
（5）此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。
该法制备得到的金颗粒直径约为41nm，如前所述，要想得到更大或更小的金颗粒，该方法依然可行，唯一不同的是需要改变加入还原剂的量。
另外，采用此标准方法所需反应时间最短。
附注：有研究者已经注意到影响胶体金质量及其稳定性的几种因素，制备过程中器具若全部使用干净的玻璃器皿，溶液一律用0.2µm滤膜过滤后使用，水用玻璃三蒸水，推荐使用超纯水，采取这些措施后制得的胶体金很稳定。
这些措施表明即使很微量的污物都会对胶体金制备带来不良影响。
虽然经常可见推荐使用硅化玻璃器皿的说法，其实使用普通玻璃器皿同样也能制出高质量高稳定性的胶体金。
免疫金的制备胶体金与抗原（或抗体）的结合物称为免疫金或胶体金标记物，在免疫组织化学技术中，又习惯称之为金探针。
胶体金标记蛋白的原理是：在碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与蛋白质所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合，这种结合对所标记蛋白的生物学活性无明显影响。
环境pH和离子强度是影响胶体金与抗原（抗体）吸附的主要因素，胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及浓度等也影响蛋白质的吸附。
一般制备方法为：1、胶体金pH的调整（用K2CO3或HCL溶液调节pH至选定值。
原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可以略偏碱。
但各标记物的最适反应pH往往需多次试验才能确定）；2、蛋白质最适标记量的确定（将待标记蛋白作一系列稀释后各取一定量加入装有一定量胶体金的试管中，然后分别加入NaCl溶液，混匀静置数小时，对照管与加入蛋白量不足的管颜色会由红变蓝，而蛋白量足或超过的管保持红色不变，其中含蛋白最低的一管即为稳定胶体金所必须的最适标记量。
以此比例并增加10%-20%即为标记全部胶体金溶液所需的蛋白总量）；3、标记过程（在电磁搅拌棒下将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，反应一定时间后加入BSA并调整至pH8.5，放置室温继续反应数分钟）；4、离心去除未结合的蛋白质（各粒径的金粒子所需的离心转速与时间均不一样。
离心后去上清液，将沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮，恢复至原体积后再离心。
如此洗涤2-4次，以彻底除去未结合的蛋白质）。
NC膜硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。
国内NC膜的分类主要有两种：135s和180s。
分类是依据现在大部分厂商用的4cm膜平均水的层析时间。
换算为孔径就是135s=8um，180s=6um。
那么从这个公式中可以看出，在通过同一长度位置时，金溶液通过的速度是快速膜>慢速膜。
那么通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。
反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。
同时还有一个问题是，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。
所以这里就有一个读数时间/反应灵敏度/非特异性结合的均衡。
综合以上，结论为膜孔径越小灵敏度越高。
但是同时也减慢了跑板速度，增加了非特异性结合的机会，也就是假阳性的升高。
所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜，找到合适的平衡点至关重要。
根据专家研究135s的一般用在双抗体夹心法，180s的一般用在竞争法。
胶体金免疫分析技术一、斑点金免疫渗滤试验原理：胶体金免疫渗滤分析（DIGFA）原理与操作步骤基本与ELISA相同：加样品于固定有配体（抗体或抗原）的硝酸纤维素膜上，通过渗滤在膜中形成抗体-抗原复合物，洗涤渗滤后，再加液体的胶体金标记抗体。
当结果为阳性时，在膜上固定有抗体-抗原-胶体金标记抗体复合物而呈现红色斑点。
技术类型：1、双抗体夹心法用抗体结合在微孔膜中央，滴加待检标本，若标本中待测抗原与膜上抗体上结合，然后滴加金标抗体，再加洗涤剂洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。
2、间接法用抗原包被在微孔膜上，滴加待测标本，滴加洗涤剂洗涤后，滴加金标抗抗体，加洗涤剂洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。
该法由于血清标本中非目的性的IgG的干扰，易导致假阳性结果，临床上运用较少。
装置示意图装置分解图二、斑点金免疫层析试验原理：斑点金免疫层析实验（DICA）是胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合的以微孔滤膜为载体的快速固相膜免疫分析技术。
与胶体金免疫渗滤实验的过滤性不同，DICA中滴加在膜一端的标本溶液受载体膜的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体（或抗原）结合而被固化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判定实验结果。
技术类型：1、双抗体夹心法如上图所示，G处为金标记抗体（免疫金），T处为包被抗体，C处包被抗金标抗体，B处为吸水纸。
测试时A端滴加待测标本，通过层析作用，待测标本向B端移动，流经G处时将金标抗体复溶，若待检标本中含有待测抗原，即形成金标抗体-抗原复合物，移至T区时形成金标抗体-抗原-抗体复合物，金标抗体被固定下来，在T区显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标记抗体移至C区被抗金标抗体捕获，呈现红色质控线条。
2、竞争法如上图所示，G处为金标抗体，T处包被标准抗原，C处包被抗抗体，测试时待测样本加于A端，若待测标本中含有待测抗原，流经G处时结合金标抗体，当混合物移至T处，因无足够游离的金标抗体与膜上的标准抗原结合，T处无棕红色线条出现，实验结果为阳性，游离金标记或金标记复合物流经C处，与该处的抗金标抗体结合出现棕红色的质控带，若标本中不含待测抗原，金标抗体则于T处膜上的标准抗原结合，在T处出现棕红色的线条，实验结果为阴性。
3、间接法为了消除待测血清标本中大量的非特异性IgG与特异性IgG竞争结合金标记抗人IgG，降低试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗体常设计成反流免疫层析法。
测试卡可分为左右折叠的两部分，右面中央纵向贴有NC膜条为膜上包被有抗原线T，E处为含能与蛋白结合的有色染料的样本加样区，F处为吸水材料；左面中央开有观察窗口B，C处固定有金标记羊抗人抗体，A、D处为吸水材料。
测定时先将缓冲液加在D处层析至C处使金标物复溶，然后将标本加在E处使其与染料一起在膜的层析作用下向F端移动，若标本中有待测抗体存在，则于膜上抗原结合形成抗原抗体复合物，待有色染料延伸至膜上标记线G处，在F处加缓冲液，合上测试卡，A的强大吸水作用使膜上液体反向移动，标本中非特异性IgG及无关物被洗回E处，随后而来的金标羊抗人抗体与抗原抗体复合物结合，出现棕红色线条。
无棕红色线条出现则表明血清中无特异性抗体。
该法有效的排除了非特异性抗体对测试的干扰。
临床应用应用范围包括感染性疾病抗原、抗体检测，如HBsAg、疟原虫抗原、TB—Ab、HP—Ab、HIV—Ab 等；各种蛋白质抗原检测，如AFP、CEA、肌红蛋白、肌钙蛋白、尿微量白蛋白、OB 等；激素检测，如HCG、LH、FSH、TSH 等；药物检测，如吗啡、可卡因等。