大鼠血浆中抗精神分裂症候选新药S_省略_体异构体的LC_MS_MS法测定_周一萌

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在线脱气仪、G1312 型泵、G1367D 型自动进样器、G1330B 型自动进样器控温盘和 G1316B 型柱温箱 ( 美国 Agilent 公 司 )。 1 消旋体 ( 纯度 99.8％， 批号 20101201)、 (R)-(+)-1(2， ee 99 ％，批号 20101210 ) 和 ( S ) - ( - ) - 1 ( 3，ee 99 ％，批
性强，急性毒性和不良反应小，无致突变性 [1,2]。 1 分子结构中含有一手性碳原子，根据我国手 性新药的临床要求，有必要对 1 及其立体异构体的 药理毒理及体内过程进行比较研究。根据药动学研 究结果，再综合药效及不良反应方面的结果，确定 适当的候选新药，以进行临床前系统研究及临床申 报，开发抗精神分裂症Ⅰ类新药。本研究旨在建立 一种样品处理简单、灵敏度高的 LC-MS/MS 法，拆 分及测定大鼠体内的 1 立体异构体，并应用于血药 浓度研究。 1 仪器与试药
Determination of the Stereoisomers of SIPI6360 in Rat Plasma by LC-MS/MS
ZHOU Yimeng1, SUN Jie2, SHI Jinmin2, TANG Liming2, LIN Mei2*, ZHOU Bin1*
(1. Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 200040; 2. Shanghai Institute for Food and Drug Control, Shanghai 201203)
号 20101212 ) 和 SIPI5652 ( 4，内标，纯度 99.64％，批号 20101106 ) 均由本院提供，结构式见图 1 ； 甲醇和乙酸乙酯 为色谱纯。 雄性 SD 大鼠 [ 300 ～ 390 g，上海西普尔 - 必凯实验动 物公司，合格证编号 SCXK( 沪 )2008-0016]。
LC-MS/MS 系统 ： API 4000 型质谱仪，包括 ESI 离子 源、Harvard 型微量恒速进样泵、Analyst 1.5 分析软件 ( AB SCIEX 公司 ) ； 1200 型高效液相色谱仪，包括 G1322A 型
中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 20wk.baidu.com2, 43(5)
ABSTRACT: A LC-MS/MS method was established for the determination of the stereoisomers of SIPI6360 in rat plasma. A Daicel Chiralpak IA chiral column was used, with methanol as the mobile phase. A tandem mass spectrometric detection was conducted using multiple reaction monitoring (MRM) under positive ionization mode with an electrospray ionization (ESI) interface. The (R)-(+)-form and (S)-(-)-form were well separated, and the calibration curves were linear in the concentration range of 0.5 - 100 ng/ml. The method recoveries were 94.0％ - 102.8％, with intra- and interbatch RSDs below 5.2％ and 11.4％. Key Words: SIPI6360; schizophrenosis; stereoisomer; LC-MS/MS; determination
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图 1 结构式
2 方法与结果 2.1 溶液配制 2、3 对照品贮备液 ： 分别精密称取 2、3 10 mg， 各置 100 ml 量瓶中，用甲醇溶解并定容，得浓度为 0.1 mg/ml 的 2、3 对照品贮备液。 内标溶液 ： 精密称取 4 10 mg，置 100 ml 量瓶 中，用甲醇溶解并定容，得 0.1 mg/ml 的内标贮备 液。精密吸取 1 ml， 置 500 ml 量瓶中， 用甲醇定容， 得浓度为 200 ng/ml 的内标工作液。 2.2 血样处理 精密吸取血样 100 l，置 1.5 ml 塑料离心管中。 精密加入内标工作液 10 l，涡旋混匀后加乙酸乙 酯 500 l，振荡提取 3 min，离心 (7 267×g)10 min， 精密量取上清液 400 l 置另一干净的 1.5 ml 塑料 离心管中，浓缩挥干，加甲醇 200 l 复溶，涡旋 1 min，离心 (65 403×g)10 min，取上清液进样分析。 2.3 色谱及质谱条件 色谱柱 Daicel Chiralpak IA 手性柱 ( 4.6 mm× 250 mm，5 m ) ； 保护柱 Daicel Chiralpak IA 柱 ( 4.0 mm×10 mm，5 m ) ；流 动 相 甲 醇 ；流 速 1.4 ml/min ； 柱温 40 ℃ ； 进样量 20 l。 离子源 电喷雾离子源，正离子扫描 ；检测方 式 多离子反应监测 ( MRM ) ；监测离子 [ M+H ]
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碰撞电压 46 V。 2.4 专属性试验 取空白血浆，按“2.2”项下方法 ( 内标工作 液以甲醇 10 l 代替 ) 处理后进样测定。另取添加 2(10 ng/ml) 或 3(10 ng/ml) 的血浆样品以及大鼠灌 胃 1 1 h 后的血浆样品，按“2.2”项下方法处理后 进样测定，色谱图见图 2。可见，在上述条件下， 血浆中内源性物质不干扰测定。 2.5 标准曲线 分别取 2、3 对照品贮备液适量，用甲醇稀释 成 2、3 浓度为 5、10、20、50、100、200、500 和 1 000 ng/ml 的对照品溶液。取空白血浆 100 l，加 入上述 2、3 对照品溶液各 10 l，制得含 2、3 浓度 为 0.5、1、2、5、10、20、50 和 100 ng/ml 的标准 血样。按“2.2”项下方法处理后进样测定，以样品 浓度 c 为横坐标，样品与内标峰面积之比 R 为纵坐 标，采用加权最小二乘法计算标准曲线，权重因子 R=4.13×10-2c+7.54×10-3， 为 1/c2，得回归方程。2 ： r=0.999 6 ； 3： R=6.20×10-2c-2.65×10-3，r=0.999 6。 结果表明，2 和 3 在 0.5 ～ 100 ng/ml 浓度范围内线 性关系良好。最低定量限为 0.5 ng/ml。 2.6 精密度与回收率试验 按“2.5”项下方法制备高、中、低浓度的质 控血浆样品 ( 2、3 浓度分别为 1、10 和 50 ng/ml )， 各 5 份，按“2.2”项下方法处理后进样测定，分别 测定 3 批，计算得批内 (n=5)、批间 (n=15)RSD 及 方法回收率 (n=5)，结果见表 1。
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2.7 稳定性试验 同上配制高、中、低浓度质控血浆样品，分 别于 -40 ℃冻融 3 次和室温放置 6 h 后按“2.2”项 下方法处理后测定，及处理后于 4 ℃ ( 自动进样器 样品室温度 ) 放置 24 h 再测定，考察样品稳定性。 结果显示，在上述条件下，2、3 含量的准确度为 85％～ 113％，RSD ( n =3 ) 均小于 10％，表明血样 在上述条件下基本稳定。 2.8 给药方法与样品采集 取雄性 SD 大鼠 6 只，试验前禁食 20 h，不禁
m/z 438.0→261.4(1)，m/z 424.0→261.4(4) ； 喷雾气 40 L/min，气帘气 35 L/min，碰撞气 5 L/min( 上述 气体均为高纯氮气 ) ； 离子源电压 5.5 kV ； 离子源 温度 650 ℃ ； 扫描时间 500 ms ； 解簇电压 107 V ；
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药品分析与质控
大鼠血浆中抗精神分裂症候选新药 SIPI6360 立体异构体的 LC-MS/MS 法测定
周一萌1，孙 杰2，石劲敏2，唐黎明2，林 梅2*，周 斌1*
(1. 中国医药工业研究总院上海医药工业研究院，上海 200040；2. 上海市食品药品检验所，上海 201203) 摘要 ： 建立了液相色谱 - 串联质谱法拆分并测定大鼠血浆中 SIPI6360 的立体异构体。采用 Daicel Chiralpak IA 手性柱，以 甲醇为流动相，采用 ESI 源正离子模式、多反应监测进行定量分析。结果显示，( R) -( +) -SIPI6360 与 ( S) -(-) -SIPI6360 立体异构体分离良好，在 0.5 ～ 100 ng/ml 浓度范围内线性关系良好。方法回收率为 94.0％～ 102.8％，批内和批间 RSD 小于 5.2％和 11.4％。 关键词：SIPI6360；精神分裂症；立体异构体；液相色谱-串联质谱；测定 中图分类号：R969；O657.7+2 文献标志码：A 文章编号：1001-8255(2012)05-0368-04
组分 RSD 批内 4.5 2.1 4.0 4.7 3 4.0 5.2 批间 6.9 11.4 8.4 9.3 2.8 7.6 方法回收率 95.5±2.4 102.8±3.0 99.8±5.5 94.0±5.3 97.5±1.8 98.9±1.3
水。灌胃给予 1(0.5％羧甲纤维素钠溶液 )，剂量为 8 mg/kg。分别于给药前和给药后 0.25、 0.5、 0.75、 1、 2、4、6、8、12 和 24 h 从大鼠眼眶后静脉丛取血 0.5 ml，置肝素抗凝试管中，离心 (1 163×g)10 min， 取上层血浆，- 40 ℃保存。按“2.2”项下方法处理 后进样测定。由标准曲线分别计算大鼠灌胃 1 后 2、 3 的血药浓度，药 - 时曲线见图 3，主要药动学参 数见表 2。
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A： 空白血浆 +2，B ： 空白血浆 +3，C ： 大鼠灌胃 (8 mg/kg) 给予 1 1 h 后血样 2-2；3-3；4-4
图 2 LC-MS/MS 图谱 表 1 精密度与回收率试验结果 /％
SIPI6360 ( 1 ) 为本院设计和合成的 3,4- 二氢喹 啉 -2 ( 1 H ) - 酮类新化合物。前期药理毒理学研究显 示，1 抗精神分裂活性显著，口服吸收好，脑靶向
收稿日期：2011-11-22 基金项目：国家“重大新药创制”科技重大专项资助 (2009ZX09103-007、2009ZX09103-048) 作者简介：周一萌(1979-)，女，副研究员，从事药物分析及药物 动力学研究。 Tel：021-55514600×289 E-mail：emeng1979@163.com 通信联系人：林 梅(1968-)，女，博士，主任药师，从事药品质量 控制及药物分析方法学研究。 Tel：021-50798202 E-mail：linmeish@yahoo.com.cn 周 斌(1968-)，男，博士，研究员，从事新药研究 和管理。 Tel：021-62472396 E-mail：zhoub@csipi.com.cn