硫酸铵溶液饱和度

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第二节 蛋白沉淀法
3. 蛋白质沉淀法
针对某一类或某一种蛋白的沉淀法，常见沉淀剂有：

碱性蛋白质：多价阳离子的碱性蛋白质，如鱼精蛋白 ，除能有效沉淀核酸外，还能沉淀某些蛋白质。

凝集素：凝集素是一种特殊的蛋白质，对糖蛋白中糖 链末端序列具有明显、特异的凝聚力。该法反应条件 温和，特异性高。 重金属：重金属盐（如铅盐、汞盐）作为蛋白质沉淀 剂，也能将蛋白质或酶沉淀。但应控制条件，并尽快 透析除去重金属，防止变性。
钙盐沉淀法：

在核酸提取液中加入一定体积比(一般为1/10)的10%氯化 钙溶液，使DNA和 RNA均成为钙盐形式，再加进1/5体积 的乙醇，DNA钙盐即形成沉淀析出。
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第二节 蛋白沉淀法
2. 有机溶剂沉淀法
原理：

有机溶剂对许多溶于水的小分子生化物质以及核酸、 多糖、蛋白质等生物大分子都能发生沉淀作用。 有机溶剂的沉淀作用主要是降低溶液的介电常数从而 增强分子之间的相互作用，使其溶解度降低。 对于具有表面水层的生物大分子来说，有机溶剂可破 坏溶质分子表面的水膜，使这些大分子脱水而相互聚 集析出。不同溶质要求不同浓度的有机溶剂，因此可 用有机溶剂进行分步沉淀。
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第三节 核酸沉淀法
LiCl。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA。 CTAB。CTAB可从含多糖的裂解体系中沉淀核酸。 精胺

精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。 原理：精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩而 发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分开， 达到纯化DNA的目的。

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第二节 蛋白沉淀法
4. 聚乙二醇沉淀法
聚乙二醇（PEG）和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚 合物可是蛋白质发生沉淀作用。该法条件温和，不易使蛋 白变性，且沉淀完全，应用范围广。
5. 选择性沉淀法
根据各种蛋白质在不同理化因子（如温度、酸碱度和有机 溶剂等）作用下稳定性不同的特点，用选择性沉淀法，使 杂蛋白变性，而欲分离的有效成分则存在于溶液中（或者 发生可逆性沉淀），从而达到分离有效成分的目的。
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第二节 蛋白沉淀法
2. 有机溶剂沉淀法
常用溶剂：甲醇、乙醇、丙酮。
优点：有机溶剂沉淀法分辨能力比盐析法高，沉淀不用脱 盐，过滤比较容易。 缺点：对某些具有生物活性的大分子，容易引起变性失活 ，操作常在低温下进行；分离效果差，共沉作用大；离子 强度及离子种类对其也有影响。

盐析的缺点：样品继续纯化时须脱盐。

硫酸铵的缺点是铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白 质的定性分析造成一定困难。
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第二节 蛋白沉淀法
1. 盐析法
硫酸铵盐析

固体法。在大体积粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵 ，当达到一定饱和度时，蛋白质便可沉淀下来。 饱和溶液法。较固体法温和，但不适用于大体积样品 ，会导致样品体积大量增加。
V ：表示需要加入的硫酸铵溶液体积（ml） V0 ：表示原来溶剂的体积（ml）
S1与S2同上
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S3 ：表示需要加入的硫酸溶液的饱和度
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硫酸铵分级沉淀示例：
各溶解度区段的沉淀效果（尿素酶）：
名称 硫酸铵饱和度/ %（25℃） 沉淀物酶活力单位/ U 0~25 0 25~35 112 沉淀效果 35~45 6850 45~55 3020 55~65 27
生物化学技术原理及应用
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第二章 沉淀法
沉淀法是纯化生物大分子常用的一种经典方法。该 法操作简单，成本低廉，一般包括盐析沉淀、有机 溶剂沉淀和选择性沉淀等类型。
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第二章 沉淀法
基 本 原 理 蛋白沉淀法 核酸沉淀法
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硫酸铵盐析
固体法
g = 533(S2-S1)/(100-0.3S2)
g = 541(S2-S1)/(100-0.3S2)
S1：表示需要达到的百分饱和度
(20 ℃)
(20 ℃)
S2：表示原溶液中的百分饱和度
g：1升溶液中需加入固体硫酸铵的克数
饱和溶液法
V = V0(S2-S1)/ (S3-S1)

异丙醇

优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的 DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放臵。 缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以

挥发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
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第三节 核酸沉淀法
等电点沉淀法：

脱氧核糖核蛋白的等电点为pH4.2；核糖核蛋白的等电点 力pH2.0-2.5；tRNA的等电点为pH5。所以将核酸提取液 调节到一定的pH，就可使不同的核酸或核蛋白分别沉淀 而分离。
时间。结晶的形成和生长需要一定时间，不同化合物结晶时间 长短不同。 晶种。不易结晶的生化物质常需加晶种。有时用玻璃棒摩擦容 器壁也能促进晶体析出。
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第三节 核酸沉淀法
核酸分离纯化应维持在0-4℃的低温度条件下，以防 止核酸的变性和降解。为防止核酸酶引起的水解作 用，可加入十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸 (EDTA)、8-羟基喹啉、柠檬酸钠等以抑制核酸酶的 活性。 常用的沉淀分离法有：
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第二节 蛋白沉淀法
6. 结晶沉淀法
结晶是溶质呈晶态从溶液中析出的过程。
初析出的结晶多少总会带一些杂质，因此需要反复结晶才 能得到较纯的产品。从比较不纯的结晶再通过结晶作用精 制得到较纯的结晶，这一过程叫做重结晶（或称再结晶、 复结晶）。 结晶是分离纯化蛋白质、酶等生化产品的一种有效手段。 变性蛋白质不能结晶，所以凡结晶状态的蛋白质都能保持 天然状态。晶体内部有规律的结构，决定了晶体的形成必 须是相同的离子或分子，才可能按一定距离周期性地定向 排列而成，所以能形成晶体的物质是比较纯的。
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调整硫酸溶液饱和度计算表
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第二节 蛋白沉淀法
1. 盐析法
盐析的影响因子：
① 蛋白质浓度对盐析的影响：蛋白质浓度过大，盐析时
发生共沉现象，分离效果不好；蛋白质浓度太稀，耗
盐量过大，蛋白质回收率也低。一般控制样品液蛋白 浓度在0.2%-2%为宜。
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第二节 蛋白沉淀法
1. 盐析法
原理：

根基蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随着盐浓度的增高 而上升（盐溶）

但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降 ，直至蛋白质析出（盐析）。
盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度 降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水 化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子之间相互聚集 并从溶液中析出。
聚乙二醇（PEG）

优点：可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量 的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行DNA沉 淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L的 MgCl2。要接着加乙醇沉淀核酸或用氯仿抽提除去DNA 沉淀中PEG。
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第二节 蛋白沉淀法
1. 盐析法
盐的选择

一般蛋白沉淀时选用硫酸铵，原因：

溶解度大，对温度不敏感 分级效果好 有稳定蛋白质结构的作用 价格低廉，废液可以肥田
④ 温度对盐析的影响：在低离子强度或水中在一定范围
内蛋白质的溶解度随着温度的升高而增加；但在高盐
溶液中，温度的升高有时反而下降。一般情况下在０ ~４℃操作。
⑤ 其他：在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加入一定
量EDTA，以除去沉淀剂中带入的金属离子。再者是 加硫酸铵的时间要控制好，一般2h左右。
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有机溶剂沉淀法


等电点沉淀法
其它沉淀剂沉淀法：聚乙二醇（PEG），十六烷基三 甲基溴化铵（CTAB），LiCl，精胺，钙盐。
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第三节 核酸沉淀法
有机溶剂沉淀法

乙醇

优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发 除去，不影响以后实验。

缺点：需要量大，一般要求低温操作。
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第一节 沉淀的基本原理
沉淀法也称溶解度法。
其纯化生物大分子的基本原理是：

根据各种物质结构的 差异 （如蛋白分子表面的疏水基 团和亲水基团之间比例的差异）来改变溶液的某些性 质（如pH、极性、离子强度、金属离子等），就能致 使抽提液中有效成分溶解度的变化。
则可通过选择适当的抽提溶剂使欲分离的有效成分最 大溶解，而杂质最小溶解；或者相反。从而达到分离 的目的。


透析法。将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大 体积盐溶液中，通过透析作用改变蛋白质溶液中的盐 浓度。该法盐浓度以连续状态变化，避免局部盐浓度 过高的不良影响，分级效果好。但受透析袋容积、盐 析速度、及硫酸铵耗费大的制约，仅用于精确、样品 体积小的试验中。
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第一节 沉淀的基本原理
蛋白沉淀法：


盐析法
有机溶剂沉淀法 蛋白质沉淀法

聚乙二醇沉淀法 选择性沉淀法 结晶沉淀法
核酸沉淀：

有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 其它沉淀剂沉淀法：聚乙二醇（PEG），十六烷 基三甲基溴化铵（CTAB），LiCl，精胺，钙盐。
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6. 结晶沉淀法
影响结晶的因素：

纯度。各种物质在溶液中均需达到一定的纯度才能析出结晶， 这样就可使结晶和母液分开，以达到进一步分离纯化的目的。 浓度。结晶液一定要有合适的浓度，结晶的大小、均匀度和结 晶的饱和度有很大关系。

Байду номын сангаас
pH。pH的变化，可以改变溶质分子的带电性质，是影响溶质 分子溶解度的一个重要因素。一般结晶液所选用的pH 与沉淀 大致相同。 温度。冷却的速度及冷却的温度直接影响结晶效果。
② 离子强度和离子类型对盐析的影响：离子强度越大，
蛋白质的溶解度越低，越容易产生盐析现象；离子半 径小而价数高的离子在盐析方面影响较强，离子半径 大而价数低的离子对盐析影响弱。
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盐析的影响因子：
③ ＰＨ对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，溶解度
越大；在净电荷为零时，溶解度最低。一般将ＰＨ值 调到蛋白质等电点附近，这样有利于盐析。