病理切片的制作过程

1.7.1 修整组织

将手术切取的乳腺肿瘤切成一个平整面，各组织块不宜太大，以便固定剂穿透和组织脱水等操作，通常以10 mm×10 mm×3mm或5mm×5mm×3mm为宜。找到不同的部位切取2块，以备后用。

1.7.2 组织洗涤

组织经修整后，组织中的福尔马林等必须冲洗干净，尤其是含有重金属的物质存在。因为残留在组织中的福尔马林，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察，所以组织修整后应冲洗12h左右。

1.7.3 组织脱水

组织经洗涤后，组织中含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去。

80%乙醇溶液：2h

95%乙醇溶液:1h

95%乙醇溶液:1h

100%乙醇溶液:30min

100%乙醇溶液:30min

1.7.4 组织透明

由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。

二甲苯Ⅰ：30min

二甲苯Ⅱ：10min

1.7.5 组织浸蜡

浸蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便组织包埋。浸蜡时间根据组织的透蜡时间较长，需3h左右。浸蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。

石蜡Ⅰ：1h

石蜡Ⅱ：1h。

石蜡Ⅲ：1h

1.7.6 组织包埋

将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块的过程。包埋时，将纸盒放在温箱旁边，用镊子夹取组织平放于纸盒底部，，再用温镊子轻轻拨动组织，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，沿壁倒入包埋用的纸盒中，速度要慢。待石蜡凝固（约30min）后放入冰箱保鲜层内以备后用。包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡，新的石蜡一般要熬顿几次，以免石蜡固定后有气泡，影响切片。用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间。

1.7.7 组织切片

（1）从冰箱里拿出蜡块，进行修快

（2）将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。

（3）将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。

（4）摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。

（5）调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左

右。

（6）调整厚度调节器到所需的切片厚度，先调约为25um，待切平后改为5um。

（7）一切调整好后方可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-60r/min。

（8）切成的蜡带到10-20cm长时，右手用另一支毛笔轻轻地将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。

（9）感觉效果较好的蜡片一小段，用单面刀片切取，再放入约43℃的水浴锅中展片，观察切片是否良好。

（10）切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。

1.7.8 贴片

（1）取清洁的载玻片一片，滴一滴粘片剂于玻片中央，然后用洗净的手指加以涂抹，便成均匀薄层。

（2）然后用载玻片直接去滤已经展开的蜡片，将蜡片贴在均匀的粘片剂薄层上。注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上，并使之处于稍偏玻片的一端，一端便于后面的染色步骤，另一端便于粘贴标签。

1.7.9 烘片

把载玻片摆好片位置，放在平盘上置于60℃温箱烘干，经过5小时干燥后即可取出存放于切片盒待染。

1.7.10 脱蜡

染色液多数为水溶液，因此，染色前必须将蜡脱去，使切片中的材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反，但是，由于蜡片较薄，所需时间比脱水浸蜡要短的多。

（1）石蜡切片经二甲苯Ⅰ脱蜡10min；

（2）石蜡切片经二甲苯Ⅱ脱蜡10min；

1.7.11 渗水

放入100%、95%、80%等各级酒精溶液中浸泡，再放入蒸馏水中，使水渗进切片组织。

（1）无水乙醇浸泡1min；

（2）无水乙醇浸泡1min；

（3）95%乙醇浸泡2min；

（4）95%乙醇浸泡2min；

（5）80%乙醇浸泡2min；

（6）自来水洗2min；

1.7.12 染色

切片放入苏木精中染色约7min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。

1.7.13 水洗

用自来水流水冲洗约2min。冲洗过程中使切片颜色发蓝，此操作要注意流水不能过大，以防切片脱落，并可以随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。

1.7.14 分化

就是将细胞质着的色褪去，使细胞核着色更加鲜明，也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒钟。这一步骤是H.E.染色成败的关键，，如分化不当会导致染色不匀，或深或浅，得到的切片染色效果差。如果染色适中，可取消此步骤。本次实验操作在0.5%盐酸乙醇中浸泡30s；

1.7.15 漂洗

切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次2min。

1.7.16 反蓝

在饱和碳酸锂中浸泡2min；再用自来水洗2min；

1.7.17 复染

用0.5%伊红乙醇液对比染色2~5min。伊红主要染细胞质，着色浓淡程度应与苏木精染细胞核的浓淡程度相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。本次操作伊红染色6min；

1.7.18 逐级脱水

（1）80%乙醇脱水30s；

（2）90%乙醇脱水30s；

（3）95%乙醇脱水1min；

（4）95%乙醇脱水1min；