糖化血红蛋白的检测
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糖化血红蛋白的检测
(一)糖化血红蛋白检测技术的分类及评价
HbA1c检测技术繁多,目前临床常用的检测方法可分为两大类。一类利用糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白电荷差异进行分离,包括:离子交换HPLC、毛细管电泳法、等电聚焦电泳法等;另一类则利用血红蛋白糖基化基团与非糖基化基团结构的不同开展检测,包括:硼酸盐亲和层析法、免疫法和酶法。
离子交换HPLC作为DCCT(美国糖尿病控制与并发症研究)和IKPDS (英国糖尿病前瞻性研究)的推荐方法,具有精密度和准确性良好、方便快捷、干扰因素较小等优点。其缺点在于成本较高,部分产品受血红蛋白浓度和血红蛋白变异体的影响。卫生部临检中心室间质评结果显示,采用该方法的实验室从2013年的278家上升到2018年的1284家,显示近年来离子交换HPLC早我国临床实验室得到广泛应用。
毛细管电泳法是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的液相分离分析技术,可分离HbA2、血红蛋白C(HbC)、血红蛋白E(HbE)、血红蛋白S(HbS)、血红蛋白D(HbD)、胎儿血红蛋白(HbF)、HbA0,以及其他血红蛋白和HbA1a、HbA1b、HbA1c。该方法具有所需样本量少、可自动化、重复性好、可用于β-地中海贫血以及其他血红蛋白合成障碍性疾病的筛查等优点,但存在检测成本较高、检测速度慢等缺点。
硼酸盐亲和层析法则利用m-氨基苯硼酸与结合于血红蛋白的葡萄糖顺位二醇基发生特异性反应,该方法检测总的糖化血红蛋白,包括HbA1c和其他位点的糖化血红蛋白。其优点在于所需标本量少、检测速度快、可用于POCT、受血红蛋白变异体影响最小。其缺点在于受HbF影响,无法发现Hb变异体。
大多数免疫测定法能特异地识别血红蛋白β链N端糖基化的氨基酸(通常是开始的4~10个氨基酸),免疫法又可分为免疫化学发光法、免疫比浊法、乳胶凝集法和免疫层析法。该方法优点包括:特异性高、可自动化、成本低廉、无Hb变异的干扰。缺点在于:受乳糜血和胆红素影响,无法发现Hb变异体。
酶法则使用一种特异性酶酶切N端缬氨酸来测定HbA1c。由于采用比色法,该方法不需要昂贵、精密的检验仪器,实验室常用的全自动生化分析仪即可完成检测。其优点在于:方便快速、成本低廉。但目前国内不同厂家生产的试剂质量良莠不齐,不同检测系统间的精密度和准确性差异明显。建议临床实验室在引入该方法前严格开展性能验证工作,验证能否满足临床要求。
鉴于离子交换HPLC为每个患者样品提供了一张便于判断的层析图,很多临床实验室将其作为HbA1c的首选方法。但该方法受血红蛋白变异体的影响,会掩盖HbA1c而导致结果错误。因此,有专家提出,实验室采用离子交换HPLC 检测HbA1c时,应选用两种检测方法。审核离子交换HPLC结果前,首先筛查层析图是否存在异常血红蛋白,如果存在,则可以选择免疫法或毛细管电泳法进行复查,确保HbA1c检测结果准确。
(二)糖化血红蛋白检测中的干扰问题
在糖化血红蛋白检测过程中,多种因素均会引起血红蛋白数量与质量变化,最终干扰HbA1c的检测结果。
1、生理因素:如种族差异、年龄差异、性别差异,地区差异(高原与平原地区)和妊娠(妊娠中期女性HbA1c水平略降低,而妊娠晚期略升高)。
2、病理因素:任何引起红细胞寿命延长或缩短的疾病,均可造成HbA1c 的检测结果假性升高或假性降低。脾切除、再生障碍性贫血、维生素B12缺乏及肾损伤等疾病造成HbA1c结果的假性升高;溶血性贫血、大量失血、脾肿大、风湿性关节炎及慢性肝脏疾病等造成HbA1c结果的假性降低。与此同时,各种导致高甘油三酯血症和高胆红素血症的疾病可造成HbA1c水平的升高。
血红蛋白病和血红蛋白变异体也会影响HbA1c的检测结果。常见的血红蛋白变异体包括HbS、HbE、HbC、HbD,在全球范围内:HbS、HbE、HBC、HbD的分布依次减少。此外,HbF也是影响HbA1c的检测结果的常见因素。NGSP(美国国家糖化血红蛋白标准化计划)列出了常见血红蛋白变异体对不同检测系统的影响,并每年进行更新。
3、药物的影响:如长期大剂量服用维生素C和维生素E会造成HbA1c 的检测结果假性偏低;而长期大剂量服用乙酰水杨酸盐、慢性麻醉剂、羟基脲、嗜酒会导致结果假性升高。
目前,日本、美国、欧洲和WHO已先后将HbA1c纳入糖尿病的诊断标准中,同时针对不同人群,提出不同的监测和管理方案,便于开展不同的治疗。时至2018年,我国中华医学会糖尿病分会发布的《中国2型糖尿病防治指南(2017版)》,HbA1c仍未能纳入糖尿病的诊断标准。可喜的是,该指南已将HbA1c纳入糖尿病患者的治疗和管理工作中。
目前我国HbA1c检测工作尚面临许多问题,仍有医疗机构和试验时采用非标准化的检验方法进行HbA1c检验。卫生部临检中心室间质量评价数据显示,低压液相法历年结果的CV为5.67%~79.35%.这种不稳定的检测系统,阻碍了我国HbA1c的标准化进程,妨碍了HbA1c在临床中队糖尿病诊断和管理的正确使用,这也是我国临床医生诟病已久的问题。