细胞培养技术总结-重要

细胞培养及检测相关技术小结

一、细胞培养基配制

以1000ml培养基为例。

1000ml成骨细胞培养基 = 850mlα－MEM培养液 + 150 ml 特级胎牛血清FBS (15%)

(1). α－MEM powder: 10.2 g/L ~~~ 8.67 g for 850 ml

(2). NaHCO3: 2.2 g/L ~~~ 1.87 g for 850 ml

(3). Twice distilled water 850 ml, dissolve the powder in water

(4). FBS (15%,v/v) 150 ml

(5). Filter to sterilized bottle

(6). Label the bottle and store in 4℃.

Notes: 4,5 should be operated in the sterile working place. And if necessary, we can add some antibiotics into the medium（usually in primary cell culture）. 二、PBS（10×）

NaCl: 80g/L

KCl: 2g/L

Na2HPO4: 14.4 g/L

KH2PO4: 2.4 g/L

PH=7.4, with HCl or NaOH

Too much PO42-is harmful to cell, so only very little amount is necessary. Get some certain to dilute this 10 times concentration PBS when we need.

三、胰蛋白酶Trypsin- EDTA 消化液(10×)

This solution is used for cell released from the culture flask。

The final concentration of EDTA is 0.05%;

The final concentration of Trypsin is 0.53 mmol/L.

Take 40 ml solution for example (10×)

(1). Trypsin: 40ml×0.05%×10 =0.02g

(2). EDTA: 40ml×0.53×10-3×376(molecular weight)×10-3×10 =0.0797g

(3). PBS 40 ml

(4). Filter and distribute it into 2 ml sterilized tubes.

四、细胞冻存液

细胞冻存液是DMSO（二甲基亚砜）和FBS的混合液，DMSO与FBS的体积比为1：2，混合均匀后过滤，加0.5ml混合液入灭菌过的冻存管，放进-20℃冰箱中备用。

五、传代

细胞买来时，多为老细胞，细胞活性不强，因此，需要先传代以恢复其活性。细胞刚买来时，培养瓶里面一般都装满了培养基，在操作时，需要先将培养基移出至干净灭菌的管子备用。

1.取光镜观察已长满细胞的培养瓶（下面按一瓶计算加入液体量），进行消化：

a)吸取19ml PBS（需用小滤膜过滤去除细菌等）

b)弃去旧培养基

c)用5ml PBS 晃洗培养瓶，弃去PBS，并重复一次。

d)在剩余的9ml PBS中加入1ml的trypsin+EDTA 消化液（消化液为10倍于正常浓

度）。过滤后加入培养瓶中。如果细胞贴壁不牢，只需要加一次，2ml；如果细胞贴

壁牢固，第一次可加入3~5ml，水平晃动几秒后弃去，再加入2ml消化液，晃动并

轻弹培养瓶底，同时在倒置显微镜下观察细胞形态，当细胞被完全消化下来时，加

入10ml细胞培养液，并将细胞液移至离心管。

2.离心，1200rev/min，5min。弃去上清液，晃动离心管使细胞分散，加入培养基10ml，

用两个培养瓶分装细胞液；

3.标记后半旋开瓶盖放入孵化箱进行培养。

Notes： 1. 细胞不能长时间处于无液体状态，因此在每个步骤之间，应该作好准备工作，如在步骤1.c)和1.d)之间，应该先准备消化液，再弃去第二次的PBS清洗液。

2. 通常情况下，成骨细胞的贴壁力较强，因此可以弃去第一次的消化液，再

加入第二次；反之，如遇到贴壁力较弱细胞，加入一次消化液肉眼可见细胞明显脱落，则只需加入这一次消化液。

3. 在显微镜下观察细胞脱壁情况时，细胞呈圆形并聚集成团，水平晃动培养

瓶时，细胞跟随瓶子晃动，在此，要确认细胞完全从瓶壁上消化下来。

4. 在分散离心后的细胞时，要确认细胞分散均匀，因为成团的细胞不利于细

胞生长，并且对LDH等实验结果影响较大。

六、换液

传代后，细胞生长每两天就需要换一次液，以补充细胞生长所需的养分。换液前，需在显微镜下观察细胞的生长状态，要特别注意细胞是否被污染，如果是被污染，应弃去污染的细胞。换液时，弃去旧培养基，加入新鲜培养基，每瓶5ml。

Day 0 Day 1 Day 2 Day 3

Day 4 Day 5 Day 6 Day 7

七、冻存细胞（缓冻）

1. 灭菌细胞冷冻管，灭菌前，半旋开管盖，灭菌完毕以后，旋紧；

2. 取出已准备好的细胞冻存液（见四）；

3. 按照传代的操作（见五）将细胞脱壁，分散后加入适量培养基，然后计数细胞，冻

存细胞时细胞的最佳密度为1e6 cells/ml；

4. 1ml细胞液进细胞冻存管（已有0.5ml细胞冻存液，混合均匀）；

5. 适量异丙醇C3H7OH进冷冻盒；（丙醇为一种冷冻介质，使冷冻速度为1℃/min）

6. 把冷冻管放进冷冻盒，放进-70℃的冰箱；

7. 一周后（一般大于24h即可），取出冷冻盒，把冷冻管放进液氮中-170℃冻存。

Notes: DMSO is harmful to cells at room temperature, but can protect cells at very low temperature.

八、细胞复苏（速溶）

1. 液氮中取出冷冻管，迅速放入小烧杯中，注意小烧杯中的水应该低于冷冻管口避免

污染，待细胞液融化后，用酒精擦拭管口，然后打开管盖将细胞液移至已灭菌烧杯；之后缓慢地加入10ml培养基，在10min内完成，（缓慢地让细胞内的DMSO释放出来）。

2. 分装细胞液，5ml/瓶，第二天换液去掉冻存液中的DMSO。

九、骨髓细胞原代培养（综合上述各步骤）：

1.购买约大鼠3只；灭菌实验用的器具。