细胞培养心得

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293和293T
293T细胞的培养心得293T细胞的培养与传代Jurcat细胞的传代
悬浮细胞培养方法Jurcat细胞培养方法
293T细胞的培养心得
点击次数： 12 发表于：2008-08-24 23:25转载请注明来自丁香园
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293T细胞差点被我养死，幸好我又将它起死回生，一点心得。

细胞传代：当细胞在细胞培养瓶内长满达到80％时就要传代，一传二，24小时后再传代。

48小时传就不好了，如果在24小时后细胞没有长到80％，应该换新的培养基，不然，培养基变黄，细胞脱落。

细胞消化：将细胞培养瓶竖立放置，吸走培养基，如果培养基中的脱落细胞较多，说明细胞现在很容易脱落，只要加入1ml的PBS+EDTA(0.02%)，来回轻微晃动培养瓶直到细胞完全脱落，加入10mlMEM(10%杭州四季青胎牛血清），混匀，不能吹打，分装2瓶，如果细胞没长满就脱落，则只需加入5mlMEM，不分装。

如果培养瓶中的细胞贴壁较牢固，培养基上清没有细胞脱落碎片，且细胞长满达到80％以上，吸走培养基，加入5ml 的PBS+EDTA(0.02%)，迅速轻微晃动，竖立培养瓶，吸走，加入1ml0.05%胰酶，37度消化不超过3min，细胞完全消化脱壁，取出加入10ml培养基轻微吸打混匀，分装2瓶。

培养基：MEM(GIBCO)+10%胎牛血清（杭州四季青）＋双抗
293T细胞的培养与传代
点击次数： 24 发表于：2008-08-25 20:47转载请注明来自丁香园
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293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。

大家注意293T细胞的一个重要特性：室温下不贴壁，但37度时可以重新贴壁。

我的293T细胞时老板从美国千里迢迢带回来的，当时正是冬天，老板把瓶子放在大衣口袋里在飞机上折腾了两天，等拿到实验室已经看不到贴壁的细胞了。

我以为在外面这么久细胞可能已经冻死了，肯定没救了。

但本着死马当活马医的想法在培养箱里放了一个星期，还是不见起色。

正准备丢的时候，一次上网查293T细胞的特性时看到：“室温下不贴壁，但37度时可以重新贴壁”。

如获至宝，赶紧跑到实验室在显微镜下仔细寻找，竟然真的发现少量贴壁细胞，后来经过我们的细心呵护，这些细胞终于活了下来。

通过这个也让我明白了一个道理，不到最后时刻不要轻言放弃。

言规正传，这个细胞我按照老板在美国的习惯处理：
用90％的DMEM＋10％的胎牛血清培养37度培养箱。

这个细胞增殖很快，大概2－3天就要传代。

需要提醒的是：细胞贴壁很疏松，换液时注意不要用力摇晃培养瓶，否则有可能会把细胞摇下来。

细胞容易消化，我用0.02 g/L蛋白酶E消化半分钟就可以了。

要注意的是：消化下来的细胞容易成团，要吹打很久才能把细胞打开。

否则传代后细胞会成团生长，不均匀，影响试验结果。

Jurkat细胞（人外周血白血病T细胞）的传代
点击次数： 46 发表于：2008-08-24 23:07转载请注明来自丁香园
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Jurkat细胞（人外周血白血病T细胞），是一种悬浮细胞。

我的经验如下：
1、培养液：RPMI1640，15％小牛血清，2％Na2CO3，1％HEPES，青霉素100IU ／1ml，庆大霉素100IU／ml；
2、培养条件：5％CO2，37度，30％湿度；
3、细胞复苏：要快速将冻存管放入37度水中，不断轻轻摇晃，直到细胞完全溶解，加入10ml左右的培养液，800～1000rpm，10分钟离心，之后倒掉液体，加入新的培养基就可以进行培养了；
4、细胞培养：起初进行传代时由于细胞刚刚复苏，长得比较慢，所以可以3～4天传一代，传过两代后，一般2～3天传一代，每次传代后在倒置显微镜下观察细胞形态，在传过几代合适的时候可以进行实验。

5、细胞冻存：1000rpm离心后，弃去液体，加入含有15％DMSO的冻存液，按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－80℃1小时）→液氮。

6、我在做细胞培养时的一些小经验：
（1）细胞培养箱在每使用1个月最好用酒精擦洗一次，这样可以减少污染；
（2）虽然说加样器放在紫外下照射会不准，但我们还是丢了一把1ml的加样器在超净台，没有拿出来过，我想这样也许会减少污染；
（3）小牛血清我们用的是国产的，所以在一开始的时候加了15％的小牛血清，但细胞总是长不好，后来摸索条件，把小牛血清的量调到了20％，细胞生长旺盛；
（4）HEPES虽然贵点，但加上去后细胞会长的不错；
（5）在超净台操作前要用0.1％的新洁尔灭或75%酒精擦手。

悬浮细胞培养方法求心得
点击次数： 226 发表于：2008-08-03 19:17转载请注明来自丁香园
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goingba网友的观点：
悬浮细胞最好养，不用消化，关于几天离一次心，要看你的细胞生长状态了，我养过血液肿瘤细胞，增值比较快。

我一般是第二天半量换液（加等量培养基后一分二），第三天若长得比较满，就离心换液。

若你不想每天都去管它，你可以把细胞密度中的相对稀一点（不能太稀，太细了细胞不好好长），可以2-3天换一次液（半量，不用离心），这要看细胞状
态，和你试验进度，若你急着用细胞，那就将细胞中密一点，天天换液，用胎牛血清，这样细胞会疯长的。

要是比较娇气的细胞，象RPMI-8226，一定要用胎牛血清，2-3天半量换液，依据细胞状态再离心换液，等细胞进入对数生长期了，养起来也就好养了。

若是正常人T 细胞，也要3-5天换一次液，最好3天的时候加入些新培养基，我曾经有一次1周忘了换液（因为T细胞增殖很慢，或者说在体外不给刺激基本不增殖，所以培养基的颜色不发生改变，但他也消耗营养），最后作流式发现细胞大部分凋亡和死亡了。

有关jurkat的培养方法
jurkat,就是1640 10%NBS，养，没什么特殊要求。

我是用培养皿在养jurkat，换液的时候不想293那样方便，每次都要离心。

但我听说离心多了对细胞不好，请问可有什么好办法不用离心也能换液的？谢谢！
建议你先看看细胞培养方面的书。

里面对悬浮细胞怎么培养说得很清楚。

悬浮细胞换液当然要离心，只要注意离心速度和时间，对细胞没什么影响。

谁说要震荡培养了?
我之前也是找了几本细胞培养的书，但是都没有悬浮培养细胞的具体方法。

能介绍下合适的书吗？谢谢了
悬浮细胞比贴壁细胞还要容易培养,换液过程中不需要消化, 只需要离心去上清,新鲜培养基重悬细胞沉淀,再进行培养就是了,培养过程中注意观察细胞状态,一般为晶莹剔透的,粘连在一起的状如葡萄串状,很容易吹散, 每天至少观察一次, 一般3天左右换液一次.。