PC12细胞的培养整理总结

一、PC12细胞的折光性本来就比较好，刚传代以及新分裂的细胞都是亮的，至于你说的贴壁的细胞，不知道是否是圆的，在牛血清的刺激下，特别是国产的，会使pc12细胞发生定向的分化，长突起，贴壁就比较牢。

PC12分为未分化的和分化的.前者是球状,成团生长;后者形成很多丝状体;而丁香园里有人说楼主的这种细胞严格来讲已经不能算是PC12了.

前几天为自己养的PC12是未分化还是分化型困扰,查了一些资料,现发上来希望能给有同样问题的战友有一点帮助!

培养条件:ＰＣ12细胞培养于铺有鼠尾胶原的玻璃培养瓶中,置于ＣＯ2培养箱(37℃,95%空气5%ＣＯ2),培养基选用ＤＭＥＭ(ｐＨ,高糖),加入10%灭活小牛血清及5%灭活马血清。

分化前:ＰＣ12细胞在培养基中多呈圆形,直径15～20μｍ,也有椭圆或多角形的,扁平的细胞少见,倾向于聚集成小团簇状(A图)。

分化后:加入ＮＧＦ后的24ｈ内细胞停止分裂,长出似交感神经元样的突起;第4～14ｄ,细胞体积增大,突起增多并增长,形成网络,数周后,突起可长达500～1000μｍ(B图)。

NGF可促进PC12细胞向类似交感神经元样的形态分化,最终导致PC12细胞在生理、生化方面都具有神经元样的功能[12]。分化后的PC12细胞对ACh的敏感性增大5~7倍

有的战友提到分化的PC12药敏性更好是不是因为分化后的PC12细胞对ACh的敏感性增大5~7倍

二、我养这个细胞一年多了，有点经验和大家交流一下。

1.我用的是15％的马血清和%的胎牛，胎牛要用进口的，国产的容易分化。

2.关于表面处理的问题，值得注意的是胶原和多聚赖氨酸使细胞贴壁的原理不太一样。多聚就是纯粹的物理黏附作用，而胶原则是刺激的细胞，使细胞的表达一些能有助于贴壁的蛋白，这种刺激作用还涉及到MAPK途径，所以如果做细胞信号转导的战友要注意到这点。相关的文献可以自己到pubmed上查找。

3.完全分化的细胞不能传代，因为贴壁已经很牢固，强迫其脱离可能造成，尤其是细胞的突起断裂，细胞存活率很低。

4.用NGF刺激的24－48h后，细胞可以消化下来传代或者冻存，用于继续培养。一般这种细胞叫做NGF activated cells。用于检测待测物的NGF样活性，指标是细胞突起的程度。

5.楼上有照片贴出来细胞呈现梭形，严格讲这种细胞已经不能叫做PC12了。严肃的话最好放弃。

6.该细胞容易聚集生长，传代种到新瓶子之前最好充分吹打，把细胞弄匀，否则传的细胞也呈现聚集的团，很难看。我的经验是消化液用EDTA加比较稀的胰酶，这样消化的细胞比较容易成单细胞悬液。

三、我目前已经养PC12一个多月了，经验谈不上很多，不过失败的教训倒是不少，可以拿出来和大家分享一下

1.细胞的培养基，我开始用10％FBS国产四季清的，DMEM，没加马血清和多聚赖氨酸什么的，因为条件关系，结果细胞贴壁性很好，生长速度还可以，3天1：2传代，在传到第5代时候，观察细胞状态下降，正常对照组也开始出现调亡，后查文献发现血清用多了，分析其内含有大量刺激生长物质，导致细胞出现分化，状态不稳定，目前改用5％FBS，DMEM，细胞生长速度明显放慢，现5天1：2传代，这和ATCC上PC12的倍增时间92小时比较接近。

2.传代时候的细胞密度，有人说传代时候细胞过密，可能导致细胞分化，但是我在细胞仅50～60％传代，细胞死亡率很高，因此目前改用80％传代，还算稳定，确实有分化的迹象，如，细胞出现多角形等，但属轻度，和楼主说的差不多，可能和我用国内血清有关。

3.胰酶对PC12无效。我个人提出胰酶消化PC12是个错误观点，其一针对悬浮PC12，胰酶消化的效果不好证实，其二，我养的PC12，性质贴壁，用100％胰酶消化1小时，愣是没动静，细胞甚至不变圆。最后用力拍打才可以，但代价是细胞损伤非常大，不好恢复。其三，ATCC上明确建议用细胞刮勺刮取PC12，目前我改用刮勺，细胞传代后状态要比用胰酶消化的好很多。

4.再者关于1640和DMEM的问题，我个人观点，二者的主要区别在于DMEM含糖量高，神经细胞都喜欢这，另外1640含一些离子，是防止培养的细胞贴壁。1640一开始主要应用于单克隆抗体的制备，其后因其比较适合国内特点，比如价廉物美啊，所以目前在很多细胞上都有应用，ATCC上建议用1640，更多的原因是防止贴壁，诱导分化。不过，2种培养基我都试过，好像在国产5％血清的条件下，1640培养基不能改变PC12性状。所以我采用DMEM，能量高啊。

5.因此我个人认为，5％的FBS，DMEM，足够PC12生长需要，4天左右1：2传代，可以不用贴壁处理（国产血清诱导轻度分化），如要求严格未分化，请参照ATCC推荐。

四、ATCC上明确说PC12倍增时间为48小时。

低分化:ＰＣ12细胞在培养基中多呈圆形,,也有椭圆或少量多角形的,扁平的细胞少见,倾向于聚集成小团簇状；

高分化:细胞长出似神经元样的突起,培养一定时间后,细胞体积增大,突起增多并增长,可形成网络。

细胞发生的分化的原因无非就是自发和诱发的，你这种情况诱发的可能性较大，我觉的是不是你的血清用的不当比如浓度偏高，再核对一下血清浓度，或者细胞接种密度太高、太低。由于血清中的各种生长因子和以及细胞代谢的自由基是最常见诱发细胞分化的因素。

张均田主编的<神经药理学研究技术与方法>中提到:在培养液中加入NGF（50ng/ml），可促使PC12细胞分化

正像上面的朋友们说的在培养液中加入NGF(50ng/ml)会使pc12分化而具有神经细胞的形态特征但要分化48小时以上才能看出来，表现为细胞体增大，有突触外伸。但需要注意的是分化后的细胞贴壁能力下降，因此在更换培养液时要小心，最好事先把培养皿用5ug/ml的poly-L-lysin 处理一下，这样即使分化后也不易剥离了。还有就是NGF对玻璃的粘着性很强，在使用和保存时一定要用塑料容器。

pc12 在未分化时贴壁生长，但最好用5%HS,5%FBS/DMEM培养液，据说PC12在完全没有HS的培养液中贴壁不好。我用的是CORNING的培养皿，PC12贴壁很好。已经经过胶原蛋白处理的，因此贴壁很好。

2.为何要自己处理成分化型的呢，上海脑所就有分化型的细胞株买。

3.分化型的不用PLL处理的，但你如果不放心，可以用ml 的PLL处理过夜就可以了。其实如果经费不足的话，国产的1%明胶同样处理过夜就可以了。PLL和明胶都用灭菌的去离子水配。分化的PC12细胞不用胰酶消化，未分化的才需要消化，就用％的胰酶消化就可，消化时在显微镜下观察突起变短，胞体变圆时就直接用培养基终止消化。

五、PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株，具神经内分泌细胞的一般特征，因其具可传代特点，广泛应用于神经生理和神经药理学研究。

关于这株细胞，血清的使用比例大家是怎么配的？看文献在马血清和胎牛血清的使用上很不同。大部分文献是10%马血清，5%胎牛。而ATCC更是15%马+%胎牛

1640和DMEM到底有多大区别？绝大部分人都用1640,也有小部分用DMEM,而ATCC是说