现代医学实验学10医学机能实验学常用仪器介绍
[临床医学]机能实验
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机能实验基本知识和基本操作一、常用手术器械及执拿方法的介绍手术剪：手术镊：血管钳（止血钳）爱丽丝钳（Alice钳，组织钳，鼠齿钳）：二、家兔手术的基本操作练习捉拿称重麻醉▪麻药：乌拉坦1g/Kg (20%, 5mL/Kg)▪给药途径：耳缘静脉注射▪麻醉标准：角膜反射消失、肌张力下降、痛反射减弱或消失固定剪毛切口分离气管并进行气管插管辨认并分离颈总动脉、迷走神经、交感神经和减压神经辨认并分离颈外静脉腹腔注射注意事项：1、备皮时不要将皮肤提起来；2、手术要仔细柔和，尽量不要损伤小血管；3、静脉注射麻醉药时注射速度要适当；4、分离神经时首先要辨别三根神经的走向和位置，使用玻璃针进行神经分离。
生物信号采集与处理的基本知识坐骨神经-腓肠肌标本的制备课程性质：《机能实验学》是以生理学、病理生理学、药理学为基础，通过对三学科实验教学优化、融合、重组形成的一门独立的综合性实践课，是机能学教学的重要组成部分和重要的医学基础课程。
课程内容《机能实验学》包括三部分，第一部分，机能学科实验基本知识和技能；第二部分，经典生理学、药理学、病理生理学实验；第三部分，按系统、方法将正常机能活动、异常病理模型、代表性药物的作用有机结合起来的综合性实验。
教学目的通过技能训练和经典实验，培养学生基本的实验操作能力；通过综合性实验，培养学生运用已学的知识观察、综合、分析和解决实际问题的能力；通过了解科学研究的一般过程和具体的科研实践，培养学生的科学思想，开拓学生的知识视野，激发学生的创新意识，帮助学生树立严肃认真、实事求是、理论联系实际的优良的科学工作态度和作风。
学时安排及考核：总学时为80个学时，本学期32学时，下学期48学时。
该课程的考核方式为：平时成绩占总成绩的30%，实验操作考试占总学时的30%，实验理论笔试占总学时的40%。
对学习《机能实验学》课的基本要求课前认真预习相关内容；课中正规操作，做好实验记录；对实验中重要现象积极思考，并尽可能的做出合理的解释；课后认真完成实验报告，并对实验中出现的“异常现象”通过查阅教科书等进行深入研究和讨论；严格遵守实验室规则。
《人体机能学实验一》
《人体机能学实验（一）》（供基础医学专业使用）教学大纲人体机能学实验室编写2017年6月前言人体机能学实验（一）这门课程是研究人体的各种功能活动及其机理的一门学科，它是涵盖了生理学的基本实验内容的一门基础医学主干课程。
人体的功能十分复杂，在研究人体的生命活动规律及其机制时，必然要从不同的角度来探讨。
因此，人体机能学实验的研究内容包括了器官、系统不同水平及人体整体所表现的各种生命现象、活动规律以及各部分之间的相互关系。
本课程和生理学理论教学课程紧密联系在一起，在学生获得相关理论知识后，通过系统的机能学实验课程的学习，培养学生的动手操作能力，促进学生观察、分析和独立解决问题的能力，提高学生的综合素质。
本课程的主要内容：主要包括仪器介绍、常用实验动物的基本操作技术、电刺激与骨骼肌收缩的关系、蟾蜍坐骨神经动作电位的引导、传导速度和兴奋性不应期的测定等13个实验。
本课程的教学特点是，以学生操作为主，辅以适当的讲解、引导，通过系统的介绍机能学的实验原理与方法，结合机能学相关的重要理论，进行系统的整体、离体器官的实验。
此外，通过示范性实验教学以及播放实验录象，向学生介绍难度较大而先进的机能学实验技术。
人体机能学实验（一）该门课程的学习要求：要求通过该课程的学习，学生能熟悉机能学实验的基本方法与过程，并加深对理论课内容的理解，真正做到“理论联系实际”。
并通过系统化的学习，学生能够初步建立科学研究的概念与思路，具备广泛查阅文献的能力。
并在此基础上，创造性的拟定自己感兴趣的研究内容，提出科学严密的设计方案，正确可行的技术路线。
最终能够通过开放性实验，实施这一实验方案，真实地观察和记录实验结果，经科学分析、评估后，谨慎地得出小结和初步结论。
人体机能学实验（一）的实验项目类型主要包括：机能学实验基础知识，基本实验技能，经典验证性实验，综合性实验。
其中基础医学类专业实验项目类型主要为经典验证性实验和综合性实验。
本大纲按照高等医学院校基础医学专业学生的教学要求，结合我校教学计划的安排和理论教学大纲而编制，总学时为72学时。
机能实验学教学设计
机能实验学教学设计前言机能实验学是医学生必修的一门重要课程，学习此课程可以帮助学生深入了解人体生理功能，加强基础实验技能，以及对医学研究有良好的启发作用。
为提高机能实验学的教学质量，本文从实验内容、实验器材、教学方法等多方面来进行探讨，希望对教师们的教学有所帮助。
实验内容机能实验学的实验内容较为丰富，包括多项生理指标的检测、红细胞的形态与数量的观察、心血管功能的实验等。
以下是一些常见的实验：•血压测量实验•心电图检测实验•血红蛋白检测实验•红细胞形态观察实验•肌肉电图测量实验•神经肌肉传导速度检测实验通过把这些实验内容紧密结合起来，教师可以让学生对人体生理功能有充分的了解，为学生今后深入研究打下坚实的基础。
实验器材为确保机能实验学的教学效果，实验器材必须选择好品质的，具有较高可靠性的实验仪器。
以下是常见的实验器材：•血压计•心电图机•血红蛋白测定仪•显微镜•红细胞计数器•肌电图机•神经传导速度检测仪这里需要特别强调的是，机能实验学的器材必须保证精密可靠，以最大程度保证实验结果的准确性和可靠性。
教学方法为提高机能实验学的教学效果，教师必须采用一系列有效的教学方法。
以下是一些常见的教学方法：1. 生动形象的讲解教师应该尽可能生动形象地向学生介绍相关的生理课程，并在实验过程中让学生亲身体验，在理论与实践中相互补充。
2. 课堂互动教师和学生之间的互动是教学中不可缺少的部分，特别是在介绍实验的过程中，教师应该积极与学生进行互动，因为它可以让学生更好地理解实验原理和过程。
3. 实验操作在进行实验操作时，应该遵守原则，执行仔细，规范实验流程，并在实验过程中注重安全细节。
4. 数据分析与讨论教师应该引导学生进行数据分析，根据实验数据进行讨论，让学生思考和探索研究的方法和途径，激发学生的科研兴趣。
结论机能实验学是医学生非常重要的一门学科，也是一门极具挑战性的课程，对教师教学方法和教学效果提出了更高的要求。
通过采用上文提到的实验内容、实验器材和教学方法，能够提高机能实验学的教学质量，让学生更好的掌握实验技能，并对医学研究有一定的启发。
医学机能实验学实验报告
实验名称：传出神经系统药物对兔瞳孔的影响实验目的：1. 观察传出神经系统药物对兔瞳孔的影响。
2. 分析不同药物对瞳孔变化的生理机制。
实验原理：瞳孔的大小受自主神经系统的调节，主要受交感神经和副交感神经的控制。
交感神经兴奋时，瞳孔扩大；副交感神经兴奋时，瞳孔缩小。
通过观察不同药物对兔瞳孔的影响，可以了解药物对自主神经系统的调节作用。
实验材料：1. 实验动物：家兔 2 只2. 实验仪器：瞳孔观察仪、显微镜、显微镜支架、注射器、药物（阿托品、毛果芸香碱、肾上腺素、去甲肾上腺素）3. 实验药品：阿托品溶液、毛果芸香碱溶液、肾上腺素溶液、去甲肾上腺素溶液实验步骤：1. 将家兔固定于实验台上，用瞳孔观察仪观察并记录其瞳孔大小。
2. 依次给予家兔以下药物：a. 阿托品溶液：注射 0.5ml，观察瞳孔变化。
b. 毛果芸香碱溶液：注射 0.5ml，观察瞳孔变化。
c. 肾上腺素溶液：注射 0.5ml，观察瞳孔变化。
d. 去甲肾上腺素溶液：注射 0.5ml，观察瞳孔变化。
3. 观察并记录给药前后家兔瞳孔的变化，包括瞳孔大小、形状、反应时间等。
4. 重复实验，验证实验结果的可靠性。
实验结果：1. 阿托品溶液注射后，家兔瞳孔逐渐扩大，呈圆形，对光反应减弱。
2. 毛果芸香碱溶液注射后，家兔瞳孔逐渐缩小，呈圆形，对光反应增强。
3. 肾上腺素溶液注射后，家兔瞳孔逐渐扩大，呈圆形，对光反应减弱。
4. 去甲肾上腺素溶液注射后，家兔瞳孔无明显变化，对光反应减弱。
实验分析：1. 阿托品为副交感神经阻断剂，可阻断副交感神经对瞳孔的调节作用，导致瞳孔扩大。
2. 毛果芸香碱为副交感神经兴奋剂，可增强副交感神经对瞳孔的调节作用，导致瞳孔缩小。
3. 肾上腺素为交感神经兴奋剂，可增强交感神经对瞳孔的调节作用，导致瞳孔扩大。
4. 去甲肾上腺素为交感神经兴奋剂，但对瞳孔的调节作用较弱，故家兔瞳孔无明显变化。
结论：1. 阿托品和毛果芸香碱可分别引起家兔瞳孔扩大和缩小，证实了药物对瞳孔的调节作用。
《机能学实验》实验教学大纲(临床等)
《机能学实验》实验教学大纲（供五年制本科临床医学、麻醉学等专业使用）Ⅰ前言机能实验学是以生理学、病理生理学、药理学为基础，通过对三学科实验教学的优化、融合、重组形成的一门独立的综合性实践课，是以动物实验和人体功能观察为手段，探讨人体机能活动规律及其在疾病状态或药物干预下的变化规律及其机制的综合性实验课程，是机能学教学的重要组成部分和重要的医学基础课程。
主要内容包括基本实验技能、基本的经典实验、综合性实验和设计性实验。
编写本大纲的目的是要求学生通过该课程的学习，掌握常用实验仪器的原理及使用方法；掌握常用实验动物的选择和局部手术操作；掌握常用实验溶液的配制方法：学会实验资料的收集、整理和数据处理；学会对实验结果的分析、整理和实验报告的正确书写，从而提高对功能学科知识的进一步理解，提高解决实际问题的综合能力、提高科学思维的能力，培养对科学工作严谨求实的作风，为今后从事实际工作和科学研究奠定基础。
本大纲适用于五年制本科临床医学、临床妇产、急救医学、眼耳鼻喉科学、医学美容、医学影像学、麻醉学、法医学专业（方向）医学生使用。
现将大纲使用中有关问题说明如下：一为了使教师和学生更好地掌握教材，大纲中每一实验均由教学目的、教学要求和教学内容三部分组成。
教学目的注明教学目标，教学要求分掌握、熟悉和了解三个级别，教学内容与教学要求级别对应，并统一标示（核心内容即知识点以下划实线，重点内容以下划虚线，一般内容不标示）便于学生重点学习。
二教师在保证大纲核心内容的前提下,可根据不同教学手段,讲授重点内容和介绍一般内容。
三总教学参考学时：68学时。
四使用教材：《机能学实验指导》，自编，石京山，4版，2006年。
Ⅱ正文实验一概述一教学目的（一）明确机能实验课的目的和要求，严格遵守实验室的规章制度，认真做好每一次实验，在实验中不断掌握动物实验的基本操作技术。
（二）掌握BL-410、BL-420E和ASB240U生物信号采集系统操作。
实验室仪器设备一览表
实验室仪器设备一览表在现代科学研究中，实验室仪器设备是不可或缺的工具。
它们在实验数据收集、分析与处理等方面发挥着至关重要的作用。
本文将通过一个实验室仪器设备一览表，介绍一些常见的实验室仪器设备及其功能和用途。
一、基础仪器设备1. 显微镜显微镜是一种基础仪器，用于放大小尺寸的物体，使其能够被肉眼观察。
在生物学、医学和材料科学等领域，显微镜广泛用于观察细胞结构、细菌、组织切片以及纳米级物质等。
2. 天平天平用于测量物体的重量，能够提供高精度的质量数据。
在化学、物理和生物学的实验中，天平是进行精确配方、测量反应物质量和制备实验样品时必不可少的仪器。
3. 温度计温度计作为测量温度的工具，有多种类型，如汞温度计、电子温度计和红外线温度计等。
在化学、物理和环境科学等领域，温度计被广泛应用于实验室试剂的稳定性检测、反应温度的监测和环境温度的控制等。
4. pH计pH计用于测量溶液的酸碱度，可以通过电极测量得出具体的pH 值。
在化学、生物学和环境科学中，pH计常用于酸碱溶液制备、水质检测和生物体内环境的监测等实验。
二、分析仪器设备1. 紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计用于测量物质在紫外和可见光区域的吸收和透射性能。
在生物化学、药学和环境科学等研究中，紫外可见分光光度计可用于测定物质的浓度、反应速率和纯度等。
2. 气相色谱仪气相色谱仪用于分离和定量分析气体或液态样品中的化合物。
在化学、药学和环境科学等领域，气相色谱仪被广泛应用于物质成分分析、环境监测和病理诊断等。
3. 核磁共振仪核磁共振仪（NMR）通过测量物质中原子核的共振信号，获取样品分子结构和原子间的相互作用信息。
在有机化学、生物化学和材料科学等领域，核磁共振仪常用于化合物结构鉴定、药物代谢研究和新材料性能评估等。
4. 质谱仪质谱仪用于分析分子的质量和结构，能够快速确定化合物的组分和分子量。
在化学、生物学和医学等领域，质谱仪广泛应用于有机物质鉴定、蛋白质质量测定和药物代谢研究等。
《机能学》教学大纲
机能实验学课程教学大纲适用专业：临床医学专业七年制、临床医学专业五年制、医学工程专业、临床检验专业、临床药理学、口腔医学、预防医学专业等前言课程简介：机能实验学是研究生物正常功能、疾病发生及药物作用机制的综合性实践课程，实验教学的设置总共104学时,分为总论4学时、基本实验68学时、整合实验32学时等三部分。
实验总论介绍实验的总体要求等实验相关理论，实验设计介绍与实验有关的科研知识，为开放实验打好基础；基本实验为经过筛选的原机能学科的实验内容，目的是让学生掌握各机能学科的基本实验操作技能；整合实验是综合各机能学科相关理论知识的实验项目，目的是启发学生将有关机能知识有机地结合起来处理实际问题的能力。
基本实验包括16个实验。
实验内容包括了神经组织动作电位、大脑皮层功能、机体感受器等基本生理学实验内容；缺氧、急性右心衰竭等基本病理生理实验内容；药物机理、药代动力学参数、半数致死量等基本药理学实验内容以及实验设计等内容。
整合实验包括4个实验。
包括家兔有机磷中毒及解救、正常家兔磺胺嘧啶钠药动学参数的测定、呼吸运动的调节与呼吸衰竭的治疗以及多媒体模拟实验等。
每个实验8学时。
实验动物以蟾蜍、家兔、小鼠等为主；实验操作包括动物分组、捉拿，家兔耳缘静脉给药、麻醉、离体心脏标本制备；家兔耳缘静脉给药、麻醉、气管插管、动脉插管；小鼠腹腔内注射及颈椎脱臼处死等。
目的是使学生掌握机能实验学的基本操作技能、了解机能实验学实验方法，促进学生在实验操作中主动思考，积极动手，将实验与理论相结合，培养机能实验学研究的基本素养。
课程负责人及授课团队：课程负责人：赵红教授授课团队：李亘松教授张倩茹副教授宋阳副教授陈航副教授李凡高级讲师考评方式：实验理论考试、实验操作考试、实验设计使用教材及其他建议参考书：《人体机能学实验教程》2010年2月第一版人民军医出版社《生理学》2013年3月第八版人民卫生出版社《药理学》2013年3月第八版人民卫生出版社《病理生理学》2013年3月第八版人民卫生出版社教学目标：促进学生在实验操作中主动思考，积极动手，将实验与理论相结合，培养机能实验学研究的基本素养。
医学机能学实验
医学机能学实验1.支配心脏的神经有哪些？各有何作用？心脏受心交感神经和心迷走神经双重支配。
心交感神经的作用：心交感神经支配窦房结、房室交界、房室束、心房肌、心室肌，兴奋时，产生正性变时、变力、变传导作用（心率增快，心缩力增强，房室交界兴奋传导加快）心迷走神经的作用：心迷走神经支配窦房结、心房肌、房室交界、房室束及其分支，少数支配心室肌，兴奋时，产生负性变时、变力、变传导作用（心率减慢，心缩力减弱，房室交界兴奋传导减慢）2.血管受哪些神经支配？各有何作用？支配血管的神经主要有交感缩血管神经，分布在除毛细血管前括约肌以外的全身各处的血管平滑肌上，其作用是使血管收缩，外周阻力增大。
交感舒血管神经支配骨骼肌血管，与运动时骨骼肌血流调节和防御反应有关。
副交感舒血管神经只分布于少数器官，如脑、唾液腺、胃肠道腺体及外生殖器的血管，使血管扩张，仅具调节局部血流的作用。
3.手术中出血如何处理？1）组织渗血可用温热生理盐水纱布压迫止血。
2）较大血管出血必须要用止血钳夹住出血点及其周围少许组织，结扎止血。
4.夹闭一侧颈总动脉后血压的变化情况及为什么？血压升高。
机制如下：夹闭一侧颈总动脉后，同侧颈动脉窦血流量减少，颈动脉窦压力感受器发放冲动减少，窦神经传入冲动减少，导致：1）心迷走中枢抑制，迷走神经传出冲动减少，对心脏的抑制作用减小，心跳加快加强，心输出量增多，血压升高。
2）心交感中枢兴奋，心交感神经传出冲动增多，心跳加快加强，心输出量增多，血压升高。
3）缩血管中枢兴奋，缩血管交感神经纤维传出冲动增多，引起小动脉收缩，外周阻力增大，血压升高；小静脉收缩，回心血量增多，心输出量增多，血压增高。
5.电刺激迷走神经外周端，血压如何变化及为什么？由于电刺激迷走神经外周端，其中的副交感纤维兴奋，末梢释放乙酰胆碱，作用于节后神经元，使之兴奋并释放乙酰胆碱。
乙酰胆碱与心肌细胞膜上的M受体结合，M受体激活后转而激活G蛋白，G蛋白一方面调制K+通道，增强K+外流，使心肌细胞膜处于超极化状态，抑制细胞的活动；另一方面可抑制腺苷酸环化酶的活性，降低细胞内cAMP的浓度，调制钙通道，使钙通道关闭，产生负性变时、变力、变传导作用，使血压下降。
现代医学实验学6流式细胞仪
3.上单染管(CD4-FITC、CD8-PE)，准备补偿； （注： 保持电压绝对不变； 开始补偿前，将原 补偿全部归零；）
调节补偿原则
▪ 横平竖直 ▪ 即X-mean或Y-mean相
等
荧光补偿不足会导致弱阳性群体是假阳性颗粒增多， 而过度补偿则会丢失弱阳性群体而导致假阴
双色荧 光补偿1 （FITC中混入 了PE)
胞 结
核浆比例
特异性抗原
细 胞
（细胞表面/胞浆/核） 细胞内细胞因子
功 细胞活性
构 DNA含量与细胞周期 能 酶活性
RNA含量
激素结合位点
蛋白质含量
细胞受体
大小： 0.2~300um
流式细胞仪工作原理
将待测细胞染色后制成单细胞悬液 1.一定压力将待测样品压进活动室，不含细胞的磷酸 缓冲液（鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管进口 方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包 绕着样品高速活动，组成一个圆形的流束，待测细胞 在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 2.流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形 后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞 在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
➢流式细胞仪（Flow Cytometer) 对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存 贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物化学 参数，并可以根据预选的参数范围把指定的细胞亚群从 中分选出来。
流式细胞仪及流式细胞术的发展史
▪ 1930年，Caspersson 和Thorell开始致力于细胞的计数。 ▪ 1934年，Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人，他
液流驱动系统由单列匀速运动颗粒组成的液柱
机能实验学：机能实验学理论
（2）自发高血压肥胖大鼠SHR/N-CP （spontaneous hypertensive rat）用于研究Ⅱ型糖尿病；自发糖尿病大鼠 “BB”Wistar用于研究Ⅰ型糖尿病；盐敏感大鼠Ds用于高盐
对生理因素的影响。
3.药物学研究
（ 1 ）药物毒理学试验 急性、亚急性、慢性毒性试验、生殖毒性试验和药物依 赖试验等。
1.无菌动物：体内外均无任何寄生物的动物。 2.悉生动物：将已知菌植入无菌动物体内的动物， 即动物机体内带有已知微生物。 四级动物
一、常用实验动物的种类和特点
青蛙和蟾蜍（frog & hoptoad）
（一）生物学特性 两栖类变温动物，有两个心房、一个心室，房室区分不明显。
蟾蜍背部有许多突起毒腺，分泌毒素。 （二）在生物科学研究中的应用
1.药物对心脏的灌流实验。 2.药物对神经、肌肉、神经-肌接头的影响。 常用于： 蛙心灌流 坐骨神经-腓肠肌标本 坐骨神经-缝匠肌标本 备注：①蟾蜍雌性背呈灰黑色，雄性呈褐色，前肢二、三趾背面 皮肤上均有1块黑色；②把青蛙后肢提起，其前肢呈环抱状为雄 性，呈伸直状为雌性。
小白鼠（mouse）
医学实验中用途最广泛和最常用的动物。
课3、《机能实验学》教案--设计性实验
本科临床医学专业《机能实验学》集体备课教案（3） --“设计性实验”设计性实验（一）教学内容：1、实验设计概论2、实验设计讲座教学时数：5学时教学方法：讲授、讨论教学安排：集中讲授，实验设计概论（约100分钟）→实验设计讲座（约100分钟）→学生讨论、提问、教师答疑（约25分钟）。
实验设计概论§1 概述﹡机能实验学是一门什么课程？基础医学范畴？机能实验学是融合传统的生理学、病理生理学和药理学三门实验内容为一体的新型课程，是实验性很强的医学基础课程。
﹡实验教学的主要手段？人体实验：有一定局限性动物实验：主要是应用模拟人类疾病的动物模型进行实验研究，是生命科学领域研究正常机体机能代谢规律、疾病发生、发展、转归以及药物作用和机制的主要手段。
﹡实验教学的主要目的？培养学生动手能力、科学思维及创新能力。
﹡实验教学的主要内容？基础性实验：掌握基本实验技术及仪器，设备的使用，培养动手能力。
综合性实验：促进各学科知识的融会贯通。
设计性实验：掌握基本的科研工作方法。
§2 设计性实验给定实验目的要求和实验条件，由学生自行设计实验方案并加以实现的实验。
以学生为主，导师带教，学生自己选择题目、开题设计、实施实验、观察记录、论文答辩等，即创设“发现情景”，培养学生个性，让学生积极主动的去探索未知世界。
﹡实验设计目的1、充分认识实验在科学理论产生和发展中的作用。
2、培养创新能力3、培养一定的科研能力﹡实验设计三个基本要素1、处理因素：2、受试对象：3、实验效应：如：观察巯甲丙脯酸对肾性高血压大鼠的疗效（动脉血压变化是实验效应）﹡实验设计的基本原则1、对照原则：可使处理因素和非处理因素的差异有一个科学对比。
空白对照标准对照处理对照自身对照2、重复原则3、随机原则﹡实验设计的基本程序1、准备工作:广泛收集阅读资料；设想立题方向。
2、选题（立题）：3、设计实验方案：4、可行性分析和预实验：5、正式实验：6、整理、分析实验结果；7、完成论文﹡选题前的准备工作1、提出问题：2、建立假说：主要查阅文献、提出问题的创新点、国内外有关动态、注意别人如何建立假说、技术路线、综述、立工作假说。
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扇贝多肽（PCF）对UVB诱导 的HaCaT细胞FADD蛋白表达 的影响。FADD蛋白表达水平 以FADD与β-肌动蛋白（内参） 吸光度比值表示。
高效液相色谱仪
高效液相色谱分离是利用试样中各组分在色谱柱中的淋洗液和固定相间 的分配系数不同，当试样随着流动相进入色谱柱中后，组分就在其中的两 相间进行反复多次（103-106）的分配（吸附－脱附－放出），由于固定 相对各种组分的吸附能力不同（即保存作用不同），因此各组份在色谱柱 中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序离开色谱柱 进入检测器，产生的离子流信号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色 谱峰。
脱脂奶粉（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液 ） BSA(牛血清白蛋白） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）
六、一抗、二抗孵育
把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入一抗溶液 与滤膜温育，4℃过夜。
倒掉一抗溶液，用PBS漂洗滤膜3次，每次10min。 加入配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 室温一小时或4℃
标本制备 二聚体/多聚体存在：使用还原变性电泳，除非说明书上有特殊说明 多个亚型存在？（Isoforms） 蛋白降解？ 蛋白修饰
Western blotting 结果如图所示，FADD对照组有低表达，模型组表 达量明显增加，与模型组相比，各剂量PCF组FADD表达量均降低 （P<0.01），且随PCF剂量增加对FADD表达量抑制作用逐渐增强， 呈剂量相关性。
SDS是一种阴离子表面活性剂， 能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例 和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷， 掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
聚丙烯酰胺凝胶内部有大小不一的孔径，使得小分子快速通过，大分子受小孔 径阻挡跑的慢，从而形成跟分子量有关的梯度条带
蛋白样品的制备
（蛋白抽提、定量）
SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳
（SDS-PAGE凝胶制备、 上样）
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
➢ 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0 ，也可向公司购买。
的二抗。
➢ 二抗的使用：
根据说明书推荐浓度使用TBST稀释二抗。 如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索
最佳稀释度（1:1000-1:20000）。 孵育条件一般为室温1-2小时。
Santa cruz, Cell signaling, Invitrogen, Sigma, Abcam, R&D, Abnova, Chemicon, Calbiochem, Millipore, BD, Cayman, Roche, eBioscience, et al.
保持色谱柱的稳定性，因而：
1) 与固定相不互溶
（延长柱寿命）
2) 不发生不可逆吸附
3) 有合适的pH值
化学惰性—不与样品及固定相发生反应。
分离分析—流动相 2020/10/26
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适用于所选的检测器
1) UV： 在紫外线区“透明” 2) 示差：折射率与溶剂有较大差异 3) 电化学检测器：电惰性。 对样品有很强的溶解力。
制作标准曲线 （插入表格）
检测样品蛋白含量：取一管考马斯亮蓝+95 l 0.15mol/L NaCl
NaCl溶液+5l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入比色杯中测试。
20-30 ug 细胞/组织裂解物 100 ng 纯化蛋白
根据蛋白表达丰度调整适当的蛋白上样量 上样量一致：每孔上样量保持一致 上样前用loading buffer加热变性样本
分离分析—流动相 2020/10/26
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1类 脂肪族醚，三级烷胺 2 脂肪醇 3 四氢呋喃,吡啶,二甲基甲酰胺,二甲亚砜 4 乙二醇,乙酸,甲酰胺 5 二氯甲烷,1,2-二氯乙烷
6 乙腈,乙酸乙酯,二氧六环 7 苯,甲苯,二甲苯,硝基甲烷,硝基乙烷,甲乙酮 8 氯仿,水
分离分析—流动相 2020/10/26
过夜。 倒掉二抗溶液，用PBS漂洗滤膜3次，每次10min。
七、二抗与底物反应显色
ECL化学发光显色液
比较常用，结果容易控制，但是被催化是 灵敏度差一点
DAB显色液
比较灵敏，是HRP最敏感的底物
常用的有PVDF膜，硝酸纤维素膜或者尼龙膜
BSA或者脱脂奶粉(光明脱脂奶粉) 商业化的封闭试剂
高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱 柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高 压。一般可达150～350×105Pa。 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10 ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少 得多，一般少于1h。 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步 提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外， 用样量小，一般几个微升
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝 酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起 免疫反应。
再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或 放射自显影以检测特异性目的基因表达的蛋白成分。
➢ 有机溶剂提取法
对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。
原理—考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙
醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物， 该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低 成正比 。
Santa cruz, Cell signaling, Invitrogen, Sigma, Abcam, R&D, Abnova, Chemicon, Calbiochem, Millipore, BD, Cayman, Roche, eBioscience, et al.
➢ 二抗选择：根据一抗来源种属以及抗体Ig亚型选择合适
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检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化 为可供检测的信号，常用检测器有紫外吸收、荧光、示差 折光、化学发光等。
紫外可见吸收检测器（UVD）是HPLC中应用最广泛的 检测器之一，几乎所有的液相色谱仪都配有这种检测器。
荧光检测器是一种高灵敏度、有选择性的检测器，可检测能 产生荧光的化合物。某些不发荧光的物质可通过化学衍生化 生成荧光衍生物，再进行荧光检测。
显色底物：操作简单，灵敏度低，如TMB、
DAB、BCIP/NBT
化学发光底物：灵敏度高，需要曝光检测设
备（暗室、曝光设备和胶片）或者凝胶成像设 备。没有信号 背景 非特异性条带 条带大小不对
标本问题 标本中不含检测蛋白：设置阳性对照 上样量不够，或者蛋白表达丰度比较低：增加上样量 转膜问题
高效液相色谱仪在医药方面的应用
① 分离分析药物的组分含量 ② 药物生产中进行中间控制 ③ 分析药物在体内的残量 ④ 测定药物在各种器官中的代谢产物，特别是研究药物的代谢 产物在血清中存在的情况。
HPLC特点
采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器。 高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便。
四、Western Blot 转膜
分离的蛋白通过电转膜方式从凝胶中转移到杂交膜上 （PVDF或NC膜）：在之前需要“切胶”
PVDF膜：可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较 强，但价格比较昂贵。
NC膜（硝酸纤维素膜）：价格比较便宜，应用较广，结 合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋 白吸附容量高，亲水性较好。
医学机能实验学常用仪器介绍
1 蛋白印迹（Western blot） 2 高效液相色谱仪
3 其他相关技术和仪器的介绍
Western Blot中文一般称为蛋白质印迹
通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到 杂交膜上
分离的蛋白可以通过一抗/二抗复合物进行检测
是蛋白质分析的最流行的技术之一
它采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质， “探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
清洗与更换方便：可减少更换溶剂时的间隔 时间。
低价、毒性小、纯度高。
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1) 有合适的理化性质（沸点、粘度等，尽可能小 一些）
2) 合适的强度（分配系数要合适，简单样品可大， 复杂样品要小）
3) 混合溶剂（有等度和梯度之分）
4) 极性合适（需根据溶剂的性质而定）
封闭 封闭时间不够：延长封闭时间 优化封闭试剂的类型和浓度 封闭试剂和抗体有交叉反应：更换封闭试剂. 磷酸化抗体不能使用含有酪蛋白的封闭试剂：推荐BSA封闭
抗体孵育和检测 一抗/二抗浓度太高：降低抗体浓度 孵育温度太高：建议4度孵育过夜
其他 洗膜不充分：5*3mins，多次短时间的洗膜 曝光时间过长：缩短曝光时间 出现干膜现象：保证膜充分浸透，避免出现干膜 二抗非特异性：设置只加二抗对照
举例
应用高效液相色谱方法检测人血浆和尿液中左卡 尼汀(L-carnitine，LC)及其酰化物乙酰左卡尼汀 (Acetyl-L-cainitine，ALC)、丙酰左卡尼汀 (Propionyl-L-cainitine，PLC)含量
转膜不完全：转膜后使用丽春红染色，确定目的大小蛋白条带是否存在于膜上，使 用蛋白质Marker.