生化实验讲义：实验十一亲和层析最后

实验十一亲和层析纯化胰蛋白酶一、引言前面我们所学的凝胶过滤法、离子交换法以及电泳等一系列分离纯化生物大分子的手段，比起早期采用的盐析法，有机溶剂及等电点沉淀法等，分离效果要好得多。

但是，这些方法中，或是利用生物大分子在一定条件下不同的溶解度、电荷分布、总电荷的不同，或是依据其分子的大小和形状的不同。

一句话，多是利用生物分子间物理和化学性质的差异来进行分离纯化的。

由于这些方法的特异性比较低，加之待分离物质之间的物化性质差异较小，常常要综合不同的分离方法。

经过许多步骤才能使生物分子达到一定的纯度。

这样既费时间，又费试剂，有时最后产品还不能令人满意。

另外，有些生物大分子，往往在生物组织或发酵液中的含量很低，相对地说杂质很多，特别是一些具有生物活性的分子，往往由于分离纯化的步骤很多，时间过长，造成破坏以致失活，产率很低。

这就促使人们去寻求新的方法来解决存在的问题。

亲和层析法是近十多年来迅速地发展并广泛被采用来分离纯化生物大分子的一种十分有效的方法。

它具有分离快速，纯化效率高。

特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。

有时一次被分离物质的纯度可提高几倍，十几倍甚至几百倍。

因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。

二、实验目的与要求1. 理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；2. 理解和掌握亲和层析实验操作技术；3. 学会一种测定蛋白水解酶活力及比活的方法。

三、基本原理简言之，亲的层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。

这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。

许多生物分子都有一种独特的生物学功能。

即它们都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。

如：酶和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物）的结合。

特异性的抗体一抗原（包括病毒、细胞）、激素与其受体、载体蛋白，基因与其互补DNA、mRNA及阻遏蛋白的结合，植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多糖的结合等。

均属于专一性而可逆的结合。

这种分子之间的结合能力叫做亲和力。

亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。

所以有人称为“生物专一吸附技术”或“功能层析技术”。

在实际工作中，只要把被识别的分子，称为配基（ Ligand ），在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（Matrix, 如Sepharose 4B）制成亲和吸附剂，然后装柱。

再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子，这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留，只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。

当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件，使结合在配基上的物质解离下来。

这样，原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。

其过程可用简图表示如下：亲和层析原理示意图本实验为了纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂，从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。

鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。

在pH = 7~8的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在pH =2~3时，又能被解离下来。

因此，采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和层析直接获得活力大于10,000 BAEE单位/ 毫克蛋白胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多。

纯化效率可达到10 ~ 20 倍以上。

四、试剂与器材主要试剂：丙酮三氯乙酸 HCl NaOH NaCl NaHCO3 Na2CO3 氯代环氧丙烷乙腈甲酸 Tris CaCl2 KCl DEAE-纤维素 Sepharose-4B. 新鲜猪胰脏鸡蛋清乙酸二氧六环二甲基亚砜主要贮存溶液：1. 鸡卵粘蛋白层析液（1升）0.02mol/L pH = 7.3 Tris -HCl Buffer。

2. DEAE-纤维素处理液：0.5 mol/L HCl 300ml 和0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 0.3升。

3. 卵粘蛋白洗脱液：0.02mol/L pH = 7.3 Tris -HCl Buffer 含0.3mol/L NaCl, 150ml.4. 标准胰蛋白酶溶液：结晶胰蛋白酶以0.001N HCl 配制成50g/ml。

5. 亲和层析柱平衡液：0.1mol/L pH = 8.0 Tris -HCl Buffer ,含0.5mol/LKCl 、0.05mol/L CaCl2, 500ml。

（配1000ml：12.1g Tris，37.5g KCl，5.6g Cacl2）。

6. 0.05 mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer 含0.2% Cacl2（全斑公用，配1000ml：6.05g Tris水溶后，先用4mol/L HCl调pH为8.0，然后方可加2g Cacl2 ）。

7. 亲和柱解吸液：0.1mol/L甲酸—0.5 mol/L KCl pH = 2.5 , 500ml。

（配1000ml：37.5g KCl，4.35ml 甲酸）。

8. Sepharose 4B胶清洗液：0.5mol/L NaCl 和0.1mol/L NaHCO3缓冲液，pH = 9.5, 各500ml.9. BAEE底物缓冲液：34mg BAEE 溶于50ml 0.05 mol/L pH = 8.0 Tris -HCl buffer 中，临用前配制，冰箱内可保存3天。

主要器材：恒温水浴，温度计，G2玻璃漏斗，抽滤瓶，布氏漏斗，离心杯（50ml），透析袋，层析柱（2×30cm,26×30cm），秒表，移液管，贮液瓶（1升），电磁搅拌器，pH计，紫外分光光度计，纱布，匀浆器，pH试纸。

五、实验操作步骤（一）鸡卵粘蛋白的分离及纯化1. 鸡卵粘蛋白（Ovomucoid）的一些性质:Ovomucoid是一种糖蛋白，在中性及偏酸性溶液中对热及高浓度脲、有机溶剂，均有较高的耐受性。

但在较酸、碱条件下，易引起变性。

Ovomucoid带有四种糖基，因此有较强的吸水性。

在50%丙酮或5%三氯乙酸盐的水溶液中，仍有较好的溶解度。

所以，选择合适的pH，丙酮浓度和三氯乙酸盐的浓度，可以从蛋清中除去大量的非卵粘蛋白。

由于Ovomucoid所带的糖基不同，电泳行为呈现出不均一性，等电点在3.9 ~ 4.5之间并呈现出四条电泳条带，但它们在生物学功能上差异不大，在氨基酸组成上几乎无差异，分子量约为28,000。

每1摩尔的卵粘蛋白分子能抑制1摩尔的胰蛋白酶。

所以每毫克高纯度的卵粘蛋白能抑制约0.84毫克的胰蛋白酶。

Ovomucoid 在 280nm处的百分消光系数A1%1cm.280 = 4.13. ，即蛋白酶浓度为1mg/ml时,溶液的吸光度A280 = 0.413 ，据此可以测定其溶液中蛋白质的含量。

2. Ovomucoid的分离及粗品制备：取2只鸡蛋，得蛋清约50 ml ，将其温热至25℃左右，加入等体积10 % pH = 1.0的三氯乙酸溶液（配制三氯乙酸：称取10克三氯乙酸，用70 ml 蒸馏水溶解，再用5mol/L NaOH 调pH = 1.0左右，最后加蒸馏水至100ml。

），这时出现大量白色沉淀，充分搅匀后，测定溶液的pH值，此时溶液的pH值应当是3.5±0.2 ,若偏离此值，用5N HCl或5mol/L NaOH溶液调pH = 3.5±0.2 ，注意在调pH值时，要严防局部过酸或过碱。

接着25℃放置4小时或过夜。

次日用4000~6000转/分离心20分钟，收集清液，再用三层纱布过滤并检查滤液的pH值是否仍为3.5±0.2，若不是，则要调回到此范围内。

然后将清液放冰浴冷却至0℃，缓缓加入3倍体积预先冷却的丙酮，用玻璃棒搅拌均匀并用塑料薄膜盖好防止丙酮挥发，放冰箱或冰浴中3 ~ 4小时后，离心（ 3000转/ 分，15 ~ 20 分钟）收集沉淀（清液留待回收丙酮）。

将沉淀抽真空去净丙酮，得到粗的卵粘蛋白。

将其用20 ml左右蒸馏水溶解。

若溶解后的溶液浑浊，可用滤纸过滤或离心去掉不溶物。

取上清装透析袋，并对蒸馏水透析去除三氯乙酸（或用Sephadex G - 25凝胶层析柱脱盐去除三氯乙酸）。

测定其抑制胰蛋白酶的比活力。

若比活力大于7000 BAEE / mg ，可直接用作亲和配基制备亲和吸附剂，否则应进一步纯化。

3. Ovomucoid的纯化DEAE-纤维素的处理：称取10克DEAE - Cellulose粉（DE - 32），先用约150 ml 0.5mol/L NaCl 0.5mol/L NaOH溶液溶胀30分钟，用G2漏斗抽干并用去离子水冲洗至中性，转入烧杯中再用约150ml 0.5mol/L HCl浸泡20分钟，再在G2漏斗中用蒸馏水洗至中性，最后用约150 ml 0.02mol/L pH=7.3 Tris-HCl缓冲液浸泡，抽真空去气泡后装柱（2cm×20cm柱），并用同一缓冲液平衡一个床体积即可使用。

将粗的Ovomucoid制品加入等体积的0.02mol/L pH=7.3 Tris-HCl绥冲液后上柱吸附，并用同一缓冲液洗杂蛋白至A280<0.05为止。

最后用含0.3mol/L NaCl的上述Tris - HCl缓冲液洗脱。

收集具有胰蛋白酶抑制活性的蛋白峰。

测定合并液的蛋白含量及卵粘蛋白的比活性及总活力。

最后将其对蒸馏水透析（或用Sephadex G-25）脱盐，精确调溶液pH = 4.0 ~ 4.5，加入3倍体积予冷的丙酮沉淀，放冰箱或冰浴3 ~ 4小时，然后离心（3000转/ 分，15 ~ 20分钟）收集沉淀（清液回收丙酮），真空下抽去丙酮即得卵粘蛋白干粉。

如将透析后溶液吹风浓缩，冰冻干燥则得海绵状松软白色干粉的卵粘蛋白。

鸡卵粘蛋白粗提物在DEAE-Cellulose柱上的层析图平衡缓冲液：0.02mol/L pH =7.3 Tris-HCl 缓冲液冲洗缓冲液：同上洗脱液：0.02mol/L pH = 7.3 Tris- HCl 缓冲液并含0.3mol/L NaCl （二）亲和吸附剂的合成目前有多种方法活化载体和偶联配基制备亲和吸附剂。

本实验采用氯代环氧丙烷活化载体与偶联配基（在附录中注明了溴化氰活化载体与偶联配基的方法）。

1. 载体Sepharose 4B 的活化 - 氯代环氧丙烷活化. 可用下面两种溶剂。

(1) 二氧六环取10ml 沉淀体积的Sepharose 4B于G2玻璃烧结漏斗中，抽滤成半干，先用约100 ml. 0.5mol/L NaCl 溶液淋洗，再用100~150ml蒸馏水洗涤，以除去其中的保护剂和防腐剂。