第1讲细胞因子与细胞粘附因子的测定(精)

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第一讲 细胞因子与细胞粘 附因子的测定
任春锋
第一节 生物学测定方法 一、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法 二、细胞毒活性测定法 三、抗病毒活性测定法 四、趋化活性测定法 五、生物学活性测定方法学评价
第二节 免疫测定方法 一、ELISA方法 二、流式细胞分析法 三、酶联免疫斑点试验 四、免疫学测定方法学评价
一、促进细胞增殖和增殖抑制测定法
是最常用的细胞因子生物活性测定方法:以细胞因 子依赖性细胞株为靶向,通过观察特定的 细胞因子刺激或抑制依赖性细胞株增殖来 评估细胞因子的活性水平。
细胞增殖检测方法分类
直接计数法 简便、直观,但费时、主观因素影响大、难
以标准化和自动化,不适用大量标本检测,因此 常用其他间接指示细胞增殖的方法检测 细胞代谢活性测定方法
细胞粘附因子
是介导细胞间及细胞与细胞外基质间粘附作用 的分子,其化学本质为糖蛋白,可以细胞膜表面表 达和可溶性两种形式存在。
细胞因子的主要生物学作用
1、抗感染和抗肿瘤 2、免疫调节作用 3、刺激造血细胞增殖分化 4、参与和调节炎症反应 5、其它
细胞因子以生物学作用进行划分的分类
白细胞介素(Interleukin)—— IL-1、IL-2、…… IL-18 干扰素(Interferon)—— IFN-、IFN-、IFN- 肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor)—— TNF- 、 TNF- 集落刺激因子(Colony-stimulating factor)—— M-CSF、G-CSF 转化生长因子(Transforming growth factor)—— TGF- 趋化因子(Chemokine)—— IL-8、GROs、MCP-1 生长因子(Growth factor)—— EGF、FGF、IGF、PDGF
原 殖或抑制方法一样,以已知活性的细胞因子标准品为对照。死、活细胞情况可用
理 同位素51Cr释放法判断,或应用台盼兰染色死细胞后直接计数。也可通过结晶紫、
萘酚蓝黑、MTT、NBB等着染活细胞,再用脱色液脱出染料后酶标仪比色测定吸光
值。死细胞数、51Cr释放量越高或比色测定的吸光值越低,表明待测细胞因子的细
胞毒活性则越高。应用系列稀释的细胞因子标准品,制作其活性与剂量关系的标
准曲线,以此作为待测品活性的定量测定的基础。
本法常用于TNF等的测定
三、抗病毒活性测定法
常用于检测抗病毒活性的细胞株 Wish、Hep2/c 人干扰素
L929
小鼠干扰素
Ratec
大鼠干扰素
A549
MDBK 多种族的IFN-α和IFN-γ
第三节 分子生物学检测方法 一、Northern和Southern Blot 二、PCR和RT-PCR 三、原位杂交、原位PCR和原位RT-PCR
第四节 细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用 一、临床应用原则 二、特定疾病诊断的辅助指标 三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后
细胞因子
是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌 的活性物质,其主要生物学功能是介导和调节免疫 应答及炎症反应,其化学本质是蛋白质或多肽。
细胞因子的作用特点
1、分泌特点:自分泌、旁分泌、内分泌性 2、多源与同源性 3、高效性 4、多效性(pleiotropy) 5、重叠性(redundancy) 6、协同性 7、拮抗性 8、网络性


作用于分泌细胞

自身
子 分
自分泌 autocrine




旁分泌 paracrine
作用于比邻 细胞
B B细胞
B
更有效地诱导IgE 类别转换
IFN- 阻断IL-4诱 导类别转化的作用, IL-4抑制IFN-
细胞因子检测的方法
免疫学检测方法——抗原性检测 细胞生物学检测方法——生物活性检测 分子生物学检测方法——基因表达检测
粘附因子以结构特点进行划分的分类
1、粘蛋白样家族(integrin family) 2、免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily,IgSF) 3、选择素家族(selectin family) 4、整合素家族(Integrin family) 5、钙离子依赖性家族(简称钙粘素Cadherin) 6、其它未归类的粘附分子如CD36、CD44、CD45等
加入MTT前温育时间(h) 96/48 96 96 72
120 72
44
56 22-24
72
检测细胞因子 IL-6 IL-11 IL-13
TGF-β TNF
TNF IL-2 IL-3
二、细胞毒活性测定法
基 本
对指示细胞具有破坏作用的细胞因子,若与细胞共育将会导致细胞死亡。因 此,待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系,以检测培养细胞的死 细胞数作为判断指标,死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。试验时,与细胞增
3H-TdR、125I-UdR掺入法或MTT等比色法 细胞代谢产物测定法
代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标 记或可溶性分子测定法
(1) 放射性核素掺入法
原理:通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方 法。在细胞的增殖过程中,DNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱 基的需求增多,若将核苷标记上可以示踪的同位素(3H/125I ),通 过检测细胞内的同位素含量,则可反映细胞增殖的程度。
பைடு நூலகம்2) MTT 比色法
特点:不使用放射性核素, 以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关
与同位素掺入法相比
测定步骤类似
掺入物:MTT而非3H-TdR; 反应条件:选用的细胞及其浓度、 培养时间不同
细胞增殖或抑制活性检测的MTT比色法常用靶细胞
细胞株/原代细胞 B9,MH60,BSF2,TTD1
UT-7
CCL-64* DA3.15, IF M14/NES60.4
所需浓度(细胞数/ml)
2×105 2×105
105 5×104
105 5×103 5×104 1×105
105 105 3×104 105
1.5×105
5×108 5×104 5×104
3H-TdR前培养时间
48 56 24 24 24 48 36 24 72 24 66 72
细胞病变程度分为5个等 级,即:
“0”,表示无明显CPE; “1+”,CPE≤25%; “2+”,CPE为25~50%; “3+”,CPE为50~75%; “4+”,CPE为75~100%。 根据病变程度找出CPEI50的标 本稀释范围,并以此计算出距 离比例和确定IFN效价。
该法操作复杂、影响因素较 多,在试验前应对所用的病毒 进行滴定。
• 粘附因子功能及应用:主要功能是调节细胞与 细胞、细胞与间质之间的相互作用。病理情况 下,由于粘附因子在细胞表面或血循环中的数 量和质量有所改变,进而影响原有细胞与细胞、 细胞与间质之间的平衡,因此,细胞内外粘附 因子的测定对于某些疾病的发生发展机制探讨、 辅助诊断、治疗监控及预后方面有重要应用价 值。
第一节 生物学测定方法
生物活性测定法原理
根据细胞因子特定的生物学活性,应用相应的靶细胞 指示系统,同时与标准品对比测定,从而得知样品中 细胞因子的活性水平,一般以活性单位(U/ml)表示
有助于细胞因子 检测的活性作用
刺激细胞增殖或集落形成的活性 维持细胞生长和存活的特性 抑制细胞生长或破坏细胞的效应 促进细胞趋化或抗病毒作用
细胞病变抑制法结果判断举例*
标本稀释度 log4 3 4 5 6 7 8
两孔平均 CPE 0 0 0
1.5 2.5 0
细胞病变 抑制程度
4 4 4 2.5 1.5 0
细胞病变 抑制积累
16 12 8 4 1.5 0
细胞病变 积累
0 0 0 1.5 4 8
细胞病变 抑制率
16/16 (100%)
12/12 (100%)
B9-11 B9-1-3 KYM-1D4
MV-3D9 WEHI-164/clone13
32D/Mp110S
L929 CTLL-2 小鼠基质细胞, 32DCL-27
细胞终浓度(细胞数/ml) 5×104/2×105 5×104 5×104
2×103
5×103 2×103
1×103
2×105 105
1.5×105
4-8
M-CSF/G-CSF
(2) MTT 比色法
原理:一种不使用放射性核素,以细胞代谢作为 细胞增殖指示物的细胞因子生物活性间接测定方法。
MTT在活细胞线粒体中的在脱氢酶的作用下,被还 原成不溶于水的蓝紫色产物(formazan),其量与细胞 增殖的程度呈正比。二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积 在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色深浅与所含的 formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。
8/8 (100%)
4/5.5 (73%)
1.5/5.5 (27%)
0/8(0%)
*结果:CPEI50稀释度介于4-6-4-7之间,距离比例为(73-50)/(73-27)
=0.50,效价为46.5;同法计算IFN标准品的CPEI50稀释度,将IFN效价 换算成国际单位,IFN国际单位=样品CPEL50的稀释度/标准品CPEI50稀 释度×标准品的单位。
72
72 24 24
3H-TdR后培养时间 检测细胞因子
18-20 16 4-6 4-8 4-6 6 12 12 6 4-6 6 6
6
8 4-8
IL-1 IL-1 IL-2 IL-3 IL-4 IL-5 IL-5 IL-5 IL-5 IL-7 IL-9 IL-11 SCF (干细胞因子) TGF-β GM-CSF
靶细胞
趋化因子
滤膜:计数受趋化细胞
趋化试验原理示意
各类细胞因子检测的常用靶细胞-1
细胞因子 IL-1
IL-2 IL-3
实验系统 D10(M)增殖法 EL-4(M)增殖法 A352(H)增殖抑制法 CTLL(M)增殖法 KG-1(H)增殖法 TF-1(H)增殖法
IL-4
CTLL(M)增殖法
IL-5
血液循环
内分泌 endocrine
远距离作用
多效性 IL-4 pleiotropy
活化、
B
增殖、
分化
胸腺细胞
增殖
肥大细胞
增殖
重叠性
IL-2、
redundancy IL-4、
IL-5
均有刺激B细胞
B
增殖的功能
协同性 synergy
IL-4 + IL-5
拮抗性 antagonism
IL-4 IFN-
Clone-IXN/2b(M)增殖法
中性粒细胞(M、H)趋化法
TF-1(H)增殖法
IL-3、IL-5
IL-6、IL-5
L929 (M、H)细胞毒法
wish(H)病变保护法
IFN- 、 IFN-
L929(M)病变保护法
IFN- 、 IFN-
五、生物学活性测定方法学评价
优点 • 生物学活性的测定 • 灵敏度高 缺点 • 特异性差 • 操作繁琐 • 易受干扰
常用于攻击细胞的病毒 VSV、EMCV及Sindbis virus等
检测抗病毒活性的方法 抑制病毒的致细胞病变效应(CPE)、
抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量
本法常用于IFN测定,IFN可诱导细胞产生抑制病毒RNA和DNA合成的酶,保护细 胞不受病毒感染,抑制病毒产生细胞病变效应(CPE)。细胞因子样品处理易感细 胞,使细胞建立抗病毒状态,然后用适量病毒攻击细胞,评价病毒的复制量或病毒 引起细胞病变被抑制的程度,即可判断样品中细胞因子的生物活性。
BCL-1(M)增殖法
干扰因素 IL-2、IL-4 IL-4
IL-4
GN-CSF、IL-5 IL-6、EPO IL-2 IL-4
各类细胞因子检测的常用靶细胞-2
细胞因子 IL-6
IL-7 IL-8 GM-CSF
TNF/ IFN
实验系统
干扰因素
B9(M)增殖法
IL-4、IL-11
BM60(H)增殖法
四、趋化活性测定法
趋化因子诱导细胞移动的方式
本法主要用于测定趋化因子和IL-8的生物活性测定。
趋化性(chemotaxis):
诱导细胞向由趋化因子低浓度出向趋化因子高浓度处作定向 移动的特性,可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验。
化学增活性(chemokinesis):
细胞因子增强细胞的随机运动能力的特性,可采用琼脂糖 小滴化学动力学试验检测。
结果客观易于自动化; 适用于大标本量的测定
方法的特异性受依赖细胞 株影响;放射性污染
常见细胞因子3H-TdR掺入检测法所需细胞及参考试验条件
细胞株
D10G4.1 L929 CTLL-2
FDC-P1,32DCL-27
CT.4S CH12 B13 T88-M BCL1
Clone-K,I×N/2bx
TS1 T10
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