临床免疫学细胞因子测定及应用

第十五章细胞因子测定及应用本章考点1.细胞因子的概述2.测定方法及应用细胞因子在机体的免疫调节、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。

检测这类因子不仅是基础免疫研究的有较手段，亦是临床上探索疾病发病机制、判断预后和考核疗效的指标。

第一节细胞因子的概述（一）概念细胞因子是由免疫细胞产生的一大类能在细胞问传递信息，具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。

（二）共同特性（1）化学性质大都为糖蛋白。

（2）细胞因子可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发挥作用。

（3）一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型的细胞可产生一种或几种相同的细胞因子。

（三）类型细胞因子分类按其作用大致可分为免疫调节因子和免疫调控因子两大类。

主要的细胞因子有：白细胞介素、干扰素、生长因子、趋化因子家族、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、转化因子家族以及其他细胞因子等。

1.白细胞介素：白细胞介素（IL）是指免疫应答过程中白细胞间相互作用的细胞因子，名称后加阿拉伯数字以示区别。

现在已取得克隆化的基因、明确产物性质和活性的白细胞介素成员有15个IL在免疫细胞的成熟、活化、增生和免疫调节等一系列过程中均发生重要作用，此外IL还参与机体的多种生理及病理反应。

（1）IL-1、IL-2的性质及生物活性1）IL-1的性质：IL-1的产生细胞：几乎所有的有核细胞均可产生IL-1，主要以巨噬细胞为主，IL-1分子有IL-1α和IL-1β两种不同分子形式。

所有的有核细胞表面，都有IL-1受体（IL-1R），也分为IL-1R 和IL-2R两类。

IL-1的生物活性：局部免疫调节作用：①与抗原协同作用；②促进B细胞生长和分化及抗体形成；③促进单核-巨噬细胞等APC的抗原递呈能力；④与IL-2或干扰素协同增强NK细胞活性；⑤吸引中性粒细胞，引起炎症介质释放；⑥刺激多种不同的间质细胞释放蛋白分解酶并产生一些效应。

全身性作用：①有较强的致热源作用；②对IL-1的生成具有反馈调节作用；③合成和分泌大量的急性蛋白；④使骨髓细胞库的中性粒细胞的释放和活化；⑤与CFS协同促进骨髓造血祖细胞的增殖能力。

2）IL-2的性质：IL-2的产生细胞：IL-2主要由T细胞（CD4+）受抗原或丝裂原刺激后合成。

IL-2分子量为l5KD，是含有113个氨基酸残基的糖蛋白，具有一定的种属特异性。

IL-2受体：T细胞，NK细胞，B细胞及单核巨噬细胞表面均可表达IL-2R。

IL-2的生物活性：①刺激T细胞生长；②诱导细胞毒作用；③促进B细胞生长分化；④增强巨噬细胞抗原递呈能力、杀菌力及细胞毒性。

2.干扰素（1）性质与类型：干扰素是由多种细胞产生的具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白，根据其产生细胞的不同分为3类：α型、β型、γ型，根据干扰素的产生细胞、受体和活性等综合因素分为2种类型：Ⅰ型和Ⅱ型。

Ⅰ型干扰素又称抗病毒干扰素，其生物活性以抗病毒为主；Ⅱ型干扰素又称免疫干扰素或IFNγ，主要由T细胞产生，主要活性是参与免疫调节，是体内重要的免疫调节因子。

（2）诱发机制：正常情况下组织或血清中不含干扰素，只有在某些特定因素作用下才能诱使细胞产生干扰素。

Ⅰ型干扰素的主要诱生剂是病毒及人工合成双链RNA，某些细菌和原虫感染及某些细胞因子也能诱导产生。

Ⅱ型干扰素在免疫应答中受到抗原或丝裂原活化后由CD8+T细胞和CD4+T细胞产生，NK细胞亦可合成少量IFNγ。

（3）生物学活性：干扰素的生物活性有较严格的种属特异性，即某一种属细胞产生的干扰素，只能作用于相同种属的细胞。

主要有抗病毒作用、抗肿瘤作用、免疫调节作用。

3.肿瘤坏死因子（1）性质和类型：人肿瘤坏死因子（TNF）有两种分子形式，即TNFα和TNFβ。

TNFα由细菌脂多糖活化的单核巨噬细胞产生，可引起肿瘤组织出血坏死，也称恶病质素；TNFβ由抗原或丝裂原刺激的淋巴细胞产生，具有肿瘤杀伤及免疫调节功能，又称淋巴毒素。

（2）生物效应：TNF对多种肿瘤细胞均有杀伤或抑制作用，敏感性因肿瘤细胞类型而异；TNF呈剂量依赖性地抑制病毒介导的细胞病变的发展，对RNA病毒和DNA病毒均有抑制作用；TNF能够增强T细胞产生以IL-2为主的淋巴因子，提高IL-2R的表达水平，促进T细胞增殖；还能促进B细胞增殖、分化和产生抗体；TNF有中性粒细胞和单核细胞趋化作用，并使之活化和脱颗粒，释放炎症介质；TNF可刺激成骨细胞内的碱性磷酸酶活性，诱导成骨细胞吸收骨质、使软骨细胞进行软骨更新，抑制软骨形成。

（3）应用研究：由于TNF的抗肿瘤和免疫调节功能，TNF疗法的研究已被许多国家开展。

动物实验和临床经验表明，TNF对某些肿瘤具有明显的抑制作用，但副作用大，建立合理的用药方案及治疗措施，可望降低用量，减轻副作用，达到最佳治疗效果。

4.造血生长因子：红细胞生成素（EPO）：红细胞生成素（EPO）是一种糖蛋白，分子量约30～39KD，主要由肾小管内皮细胞合成，也可由肝细胞和巨噬细胞产生。

EP0是一种强效的造血生长因子，活性单一，只作用于骨髓巨核前体细胞，可刺激红祖细胞及早幼红细胞形成成熟的红细胞集落，EP0的产生受机体内血容量和氧分压的调节。

5.细胞因子受体：多数细胞因子受体属于几个大的多基因家族，每个家族的成员具有独特的结构特征，相互之间在进化上可能有一定关系。

细胞因子受体家族的划分不是绝对的，有的受体可归于多个家族。

细胞因子受体除镶嵌于细胞膜表面的形式外，还有分泌游离的形式，即可溶性细胞因子受体。

第二节细胞因子测定方法及应用一、测定方法检测细胞因子的方法主要有生物学检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法。

（一）生物学检测法生物学检测又称生物活性检测，是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。

由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSF刺激造血细胞集落形成，IFN保护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测。

生物活性检测法又可分为以下几类：1.细胞增殖法：许多细胞因子具有细胞生长因子活性，特别是白细胞介素，如IL-2刺激T细胞生长、IL-3刺激肥大细胞生长、IL-6刺激浆细胞生长等。

利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株（简称依赖株）。

这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。

例如IL-2依赖株CTLL-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可在体外长期培养。

在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖情况（如使用3 H-TdR掺入法、MTT法等）鉴定IL-2的含量。

除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原刺激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。

2.靶细胞杀伤法：是根据某些细胞因子（如TNF）能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。

通常靶细胞多选择体外长期传代的肿瘤细胞株，利用同位素释放法或染料染色等方法判定细胞的杀伤率。

3.细胞因子诱导的产物分析法：某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物质，如IL-2、IL-3诱导骨髓细胞合成胺、IL-6诱导肝细胞合成α1-抗糜蛋白酶等。

通过测定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性。

4.细胞病变抑制法：病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。

（二）免疫学检测法细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。

随着重组细胞因子的出现，可较方便地获得细胞因子的特异性抗血清或单克隆抗体，因此可利用抗原抗体特异性反应的特性，用免疫学技术定量检测细胞因子。

尽管细胞因子种类繁多，只要获得了针对某一因子的特异性抗体（包括多克隆抗体或单克隆抗体）均可采用相似的技术开展工作。

常用的方法包括ELISA、RIA及免疫印迹法。

目前，几乎所有常见细胞因子的检测试剂盒均有商品供应。

此外还可利用酶标或荧光标记的抗细胞因子单克隆抗体，原位检测因子在细胞内的合成及分布情况。

免疫学检测法可直接测定样品中特定细胞因子的含量（用ng／ml表示），为大规模检测临床病人血清中细胞因子的含量提供了方便。

本法仅测定细胞因子的抗原性，与该因子活性不一定相平行，因此要了解细胞因子的生物学效应，必须结合生物学检测法。

（三）分子生物学方法这是一类利用细胞因子的基因探针检测特定细胞因子基因表达的技术。

目前所有公认的细胞因子的基因均已克隆化，故能较容易地得到某一细胞因子的cDNA探针或根据已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探针。

利用基因探针检测细胞因子mRNA表达的方法多种多样，常使用斑点杂交、Northernblot、逆转录PCR，细胞或组织原位杂交等。

实验的关键在于制备高质量的核酸探针和获得合格的待测物（提取的mRNA样品或细胞／组织标本）。

核酸探针是指一段用放射性同位素或其他标记物（如生物素、地高辛等）标记并与目的基因互补的DNA片段或单链DNA、RNA。

根据其来源可分为cDNA探针、寡核核苷酸探针、基因组基因探针及DNA探针等。

其中cDNA探针和人工合成寡核苷酸探针常用于斑点杂交及Northern blot，而RNA探针因穿透性好更适用于原位杂交。

核酸探针技术的应用已经程序化，以cDNA探针为例主要包括：①质粒DNA的提取；②靶DNA片段的分离；③靶DNA片段标记；④待测样品mRNA的提取；⑤标记cDNA探针对待检样品的杂交；⑥放射自显影或显色分析。

近年来出现的RT-PCR检测特异性mRNA的方法也广泛用于细胞因子研究领域。

该法具有灵敏、快速等优点，甚至从l～10个细胞中就可检出其中的特异mRNA。

上述三种方法，各有优缺点，可互相弥补，在实际应用中，可根据各自的实验目的和实验室条件进行选择。

生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能，是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。

免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感度也低生物活性检测法（约低l0～100倍）。

分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供有关因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。

二、临床应用细胞因子测定可作为特定疾病诊断的辅助指标，用来评估机体的免疫状态、判断治疗及预后，用于临床治疗应用时的监测等。

习题79 细胞因子的生物学活性包括A.促进靶细胞的增殖和分化B.增强抗感染和细胞杀伤效应C.促进和抑制其他细胞因子和膜表面分子的表达D.促进炎症过程，影响细胞代谢E.中和及溶解病毒作用（或换成：直接刺激B细胞产生抗体）[答疑编号500734150101]『正确答案』A、B、C、D习题80 既能产生IL-2，又具有IL-2R的细胞是A.B细胞B.T细胞C.NK细胞D.单核-巨噬细胞E.K细胞[答疑编号500734150102]『正确答案』B习题81 IL-1的主要生物学活性是A.促进T淋巴细胞活化、增殖和分化B.增强CTL和NK细胞的杀伤活性C.协同IL-4刺激B细胞增殖、分化和Ig产生D.协同CSF促进造血细胞，刺激干细胞产生E.促进B细胞生长分化[答疑编号500734150103]『正确答案』A、B、C、D、E习题82 3H-TdR掺入试验测定白介素-2活性，下列哪种说法是正确的A.测得cpm值越高，说明IL-2活性越低B.测得cpm值越高，说明IL-2活性越高C.测得cpm值越低，说明IL-2活性越高D.测得cpm值与IL-2活性无关E.cpm值与IL-2活性呈不规则性变化[答疑编号500734150104]『正确答案』B习题83 关于用MTT比色法检测IL-2活性的表述，错误的是A.需要依赖细胞株B.活的增殖细胞具有吸收MTT能力C.颜色深浅反应细胞代谢活性的强弱D.可反应B细胞功能E.反应T细胞功能[答疑编号500734150105]『正确答案』D第十六章细胞粘附分子测定及应用（略）第十七章免疫球蛋白检测及应用本章考点1.免疫球蛋白（Ig）的概述2.Ig测定及临床意义3.M蛋白的检测及意义4.冷球蛋白测定第一节免疫球蛋白的概述一、概念1.免疫球蛋白（Ig）：是一组具有抗体活性和（或）抗体样结构的球蛋白。