细胞因子检测-应用手册
细胞因子检测
1.细胞增殖法
原理： 一些细胞因子可专一刺激某些细胞增殖，而且 细胞增殖的程度与这些细胞因子活性呈正相关。
如：IL-2 —— T细胞， IL-3 ——肥大细胞，IL-6 ——浆细胞。 这些只依赖某种细胞因子才能生长的细胞系称为 依赖细胞株。
如人IL-2对鼠T细胞有生长支持作用 一定数量鼠T细胞+ 每孔分别加不同剂量的IL-2
IL-6诱导肝细胞产生-抗用相关试验来检测 验干扰素含量。
血凝素生成抑制试验：
小鼠脑脊髓心肌炎病毒可感染人肺癌A549细胞，该病毒 在生长过程中可产生血凝素，使人O型RBC凝集
试验管：A549细胞（已长好） 加一定量干扰素 培
养一定时间 加病毒
第十四章 细胞因子检测 P150
一.细胞因子检测应注意的问题
1.欲了解机体免疫功能，应检测多项细胞因子， 如细胞免疫应测IL-2、TFN-γ等
2.局部取标本：细胞因子由局部细胞产生，在 血液中浓度极低，最好取局部体液或细胞
3.动态检测比较，如疾病的复发期、缓解期、 恢复期
4.同一细胞因子选用多种方法联合检测，各种 方法检测结果不一定平衡
二.检测方法（P161）
生物学方法 免疫学方法 分子生物学方法
（一）生物学方法
原理：根据不同细胞因子生物学活性（功能) 不同而设计的方法
如IL-2可促进T淋巴细胞生长； TNF可杀肿瘤细胞； CSF可刺激造血细胞形成集落； IFN可保护细胞免受病毒攻击。
具体方法：
细胞增殖法 靶细胞杀伤法 诱导的产物分析法 细胞病变抑制法
利用细胞因子基因探针检测特定的细胞因子 mRNA表达的技术
常用方法：斑点杂交、逆转录PCR、 Northern blot、细胞或组织原位杂交等
细胞因子7项检测的说明
细胞因子7项检测的说明1. 什么是细胞因子检测？好啦，今天咱们来聊聊一个听起来挺高大上的话题——细胞因子检测。
别担心，不用背什么复杂的术语，咱们就像在茶馆聊天一样，轻松愉快。
细胞因子，简单来说就是咱们身体里的一些小信使，它们帮助调节免疫系统，像个小精灵一样，在体内穿梭，传递信息。
细胞因子检测就像是给这些小精灵做个体检，看看它们的状态如何，能不能把咱们的免疫系统调得更加给力。
1.1 检测的意义说到检测的意义，简直就是一部大片啊！想象一下，你在打游戏，突然屏幕上出现了一个小提示：“你的角色状态不佳，快去补给！”这就是细胞因子检测的作用。
通过检测，我们可以了解到身体的免疫反应是否正常，是否存在潜在的疾病，甚至可以提前预判一些问题，像个神预言家一样，给咱们的健康把把关。
1.2 细胞因子的种类细胞因子可多了，七项检测听上去就像一场音乐会，里面有主唱、吉他手、鼓手等等。
它们分别是：肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL1、IL2、IL6、IL10），还有干扰素（IFN）。
每一项都有自己的特点，像不同乐器演奏出的旋律，合在一起才能奏响健康的交响曲。
2. 检测的过程说到检测，很多人会担心，啊呀，要抽血吗？对的，没错，细胞因子检测确实是需要抽血的，听起来有点紧张，但实际上，抽血就像是捡个小便宜，可能有点疼，但为了健康，值得啊。
首先，你得去医院或者诊所，前台的小姑娘会给你登记，像是在填一份VIP通行证，接着就是护士小姐姐出场，温柔地告诉你，稍微捏一下拳头，深呼吸，不用太紧张哦。
然后就抽一管血，咕咚一下，搞定！2.1 检测结果解读等着结果的时候，就像等快递，心里七上八下的。
结果出来后，你可能会看到一些数据，别慌，这些数字就像考试卷上的分数，医生会根据你的情况来给你解读。
比如说，如果某项细胞因子的水平偏高，那可能说明你的身体在和某种疾病作斗争，或者免疫系统在“开会”呢。
如果一切正常，那就恭喜你，继续保持健康的生活方式，咱们要做个“健康达人”！2.2 注意事项不过，做检测也有一些小窍门，首先，最好提前预约，不然一到医院就像去赶集，热闹得很。
细胞因子检查
细胞因子检查1.血清白细胞介素-1(IL-1)【正常值】因测定方法不同，故无统一正常值。
【临床意义】(1)IL-1是重要的炎性递质之一，是一种热原质成分。
在临床上，IL-1引起的发热机制，可能不同于细菌内毒素。
其发热，可充分调动机体的免疫功能，在对抗炎症、肿瘤中起积极作用。
(2)IL-1参与某些自身免疫性炎症反应，如在类风湿性关节炎中，升高的IL-1，通过刺激关节的滑膜细胞、软骨细胞、成纤维细胞，分泌大量前列腺素E2(PGE2)和一些酶类，参与关节滑膜、软骨的病理损伤过程。
现在临床上，已有应用IL-1的受体拮抗剂治疗类风湿性关节炎的报道。
2.血清白细胞介素-2(IL-2)【单位】千单位/升(KU/L)。
【正常值】5～15千单位/升。
【临床意义】通过人外周血、尿液或人淋巴细胞培养上清液中的IL-2水平的测定，可对恶性肿瘤、心血管疾病、肝病、红斑狼疮、麻风病及获得性免疫缺陷综合征等进行诊断、疗效观察及预后判定，并用于器官移植后有无排斥反应的早期诊断。
3.血清白细胞介素-3(IL-3)【正常值】因测定方法不同，故无统一正常值。
【临床意义】(1)增高:见于淋巴细胞性白血病、毛细胞性白血病、霍奇金病、淋巴瘤、急性粒细胞性白血病、单核细胞性白血病、肾移植排斥反应。
(2)减低:见于免疫缺陷性疾病、恶性肿瘤及应用糖皮质激素、细胞毒药物等。
4.血清白细胞介素-4(IL-4)【正常值】因测定方法不同，故无统一正常值。
【临床意义】IL-4在临床上涉及最多的是抗肿瘤治疗作用，已知IL-4受体在相当多的肿瘤细胞上表达，包括淋巴母细胞性白血病、多发性骨髓瘤、非霍奇金病、急性早幼粒细胞性白血病和某些实体瘤。
临床上，IL-4治疗霍奇金病、非霍奇金病、慢性淋巴细胞性白血病都有一定疗效。
5.血清白细胞介素-6(IL-6)【单位】皮克/毫升(Pg/m1)。
【正常值】放射免疫测定法:血清为56.37～150.33皮克/毫升。
【临床意义】(1)增高:见于机体损伤、炎症、类风湿性关节炎、多发性骨髓瘤、系统性红斑狼疮、肝炎、烧伤及肾脏移植排斥反应等。
细胞因子检测技术应用
细胞因子检测技术应用在免疫学领域中，对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答（B细胞免疫），细胞介导的免疫应答(cell mediated immune response，CMI)也是人们所关注的，而T细胞在CMI中起关键作用。
在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK 的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。
80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ ELISPOT ）。
作为一项新型的免疫酶技术——酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)，是从单细胞水平检测分泌抗体细胞(ASC) 或分泌细胞因子(CK) 细胞的一项细胞免疫学检测技术。
由于该方法具有较高的特异性和敏感性，易操作，成本相对流式细胞分析术也较低，已被广泛用于分泌CK细胞检测或ASC测定中，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
ELISPOT 法源自 ELISA，又突破传统 ELISA 法，是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展。
两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：（1） ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
（2） ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。
（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）由于是单细胞水平检测， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。
酶联免疫方法检测细胞因子步骤
酶联免疫方法检测细胞因子步骤酶联免疫方法是一种常用的实验技术，用于检测细胞因子的含量和活性。
这种方法结合了酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹（Western blot）的优点，可以准确、快速地检测细胞因子的表达和分泌水平。
下面我们将详细介绍酶联免疫方法检测细胞因子的步骤。
第一步：收集样本在进行酶联免疫方法检测细胞因子之前，首先需要收集样本。
样本可以是细胞培养上清液、血清、血浆、组织匀浆等。
在收集样本的过程中，需要注意避免污染和降解，以保证后续实验的准确性和可靠性。
第二步：制备样品收集到样本后，需要进行样品的制备工作。
对于细胞因子的检测，通常需要进行细胞裂解或离心等步骤，以获得纯净的样品。
此外，还需要对样品进行稀释或浓缩处理，以确保在检测过程中细胞因子的浓度在可检测范围内。
第三步：选择合适的试剂盒在进行酶联免疫方法检测细胞因子之前，需要选择合适的试剂盒。
试剂盒的选择要根据要检测的细胞因子种类和检测方法来确定。
一般来说，试剂盒中包含了抗体、标记物、基质和洗涤缓冲液等试剂，可以满足细胞因子的检测需求。
第四步：进行酶标记接下来需要进行酶标记的过程。
酶标记是酶联免疫方法的关键步骤，通过在抗体或抗原上标记酶，可以实现细胞因子的特异性检测。
常用的酶包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
在酶标记过程中，需要严格控制反应条件和时间，以确保标记的稳定性和活性。
第五步：进行反应在准备好标记的抗体或抗原后，就可以进行酶联免疫反应了。
首先将标记的抗体或抗原加入到微孔板或膜上，然后加入待测样品，进行孵育反应。
在孵育反应过程中，细胞因子将与其特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
然后进行洗涤，以去除非特异性结合的物质。
第六步：显色反应经过洗涤后，就可以进行显色反应了。
显色反应是检测细胞因子含量的关键步骤，通过在酶作用下的底物转化，可以产生可检测的颜色或荧光信号。
根据试剂盒中所提供的底物种类和反应条件，可以确定最适合的显色方案。
细胞因子的检测和应用详解演示文稿
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(4)细胞因子诱导的产物分析法
• 某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性
物质，如IL-2诱导骨髓细胞合成组胺、IL6诱导肝细胞合成a1-抗胰蛋白酶等。通过测 定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活 性
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靶细胞滤液
3~5μm孔径的微孔滤膜
受检的趋化因子
３７℃ 温育数小时 取膜固定、干燥、着染、脱色
将透明后的滤膜置油镜下检测细胞在 膜内通过距离，求其趋化单位
滤膜微孔小室法
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趋化因子或待测 液
细胞悬液
对照培养液
琼 脂 糖 平 板 法 将含小牛血清的1%琼脂糖倾于平皿，如上图操作后经３７
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实时荧光PCR技术
• 特点：实时（real time)测定 ，靶核酸扩
增和产物检测同时完成，扩增管在整个测定 过程中完全处于闭管状态，不容易出现扩增 产物对实验室的“污染”，对实验技术人员 的测定操作及实验室设置的要求都相 对要 低一些。
TaqMan技术
“分子信标”技术
自分泌（autocrine），少部分通过内分泌的形式作用于远处靶 细胞或靶器官；
• 4）多样性：一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型细胞也可产
生一种或几种相同的细胞因子。
• 5）网络性：协同效应；重叠效应；拮抗效应。 • 6）高效性：它们的受体亲和力高，表现很强的生物学活性，
是免疫球蛋白等分子远不能及的 。
细胞因子测定
细胞因子测定
（1）生物学检测法：又称生物活性检测，是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。
生物活性检测法又可分为：①细胞增殖法；②靶细胞杀伤法；③细胞因子诱导的产物分析法；④细胞病变抑制法。
（2）免疫学检测法：细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。
可利用抗原抗体特异性反应的特性，用免疫学技术定量检测细胞因子。
常用的方法包括ELISA、RIA及免疫印迹法。
（3）分子生物学方法：目前公认的细胞因子的基因均已克隆化，较容易地得到某一细胞因子cDNA探针或根据已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探针。
常使用斑点杂交、Northernblot、逆转录PCR，细胞或组织原位杂交等。
具有灵敏、快速等优点，甚至从l～10个细胞中就可检出其中的特异mRNA。
（4）临床应用：细胞因子测定可作为特定疾病诊断的辅助指标，用来评估机体的免疫状态、判断治疗及预后，用于临床治疗应用时的监测等。
临床免疫学细胞因子测定及应用
第十五章细胞因子测定及应用本章考点1.细胞因子的概述2.测定方法及应用细胞因子在机体的免疫调节、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。
检测这类因子不仅是基础免疫研究的有较手段，亦是临床上探索疾病发病机制、判断预后和考核疗效的指标。
第一节细胞因子的概述（一）概念细胞因子是由免疫细胞产生的一大类能在细胞问传递信息，具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。
（二）共同特性（1）化学性质大都为糖蛋白。
（2）细胞因子可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发挥作用。
（3）一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型的细胞可产生一种或几种相同的细胞因子。
（三）类型细胞因子分类按其作用大致可分为免疫调节因子和免疫调控因子两大类。
主要的细胞因子有：白细胞介素、干扰素、生长因子、趋化因子家族、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、转化因子家族以及其他细胞因子等。
1.白细胞介素：白细胞介素（IL）是指免疫应答过程中白细胞间相互作用的细胞因子，名称后加阿拉伯数字以示区别。
现在已取得克隆化的基因、明确产物性质和活性的白细胞介素成员有15个IL在免疫细胞的成熟、活化、增生和免疫调节等一系列过程中均发生重要作用，此外IL还参与机体的多种生理及病理反应。
（1）IL-1、IL-2的性质及生物活性1）IL-1的性质：IL-1的产生细胞：几乎所有的有核细胞均可产生IL-1，主要以巨噬细胞为主，IL-1分子有IL-1α和IL-1β两种不同分子形式。
所有的有核细胞表面，都有IL-1受体（IL-1R），也分为IL-1R 和IL-2R两类。
IL-1的生物活性：局部免疫调节作用：①与抗原协同作用；②促进B细胞生长和分化及抗体形成；③促进单核-巨噬细胞等APC的抗原递呈能力；④与IL-2或干扰素协同增强NK细胞活性；⑤吸引中性粒细胞，引起炎症介质释放；⑥刺激多种不同的间质细胞释放蛋白分解酶并产生一些效应。
全身性作用：①有较强的致热源作用；②对IL-1的生成具有反馈调节作用；③合成和分泌大量的急性蛋白；④使骨髓细胞库的中性粒细胞的释放和活化；⑤与CFS协同促进骨髓造血祖细胞的增殖能力。
细胞因子检测技术及其应用
一、细胞因子检测概述
一、细胞因子的类型与作用特点
二、细胞因子检测的特点与方法
细胞因子
由非神经—内分泌细胞产 生的一大类与免疫应答活动 密切相关的低分子蛋白与多 肽。
细胞因子的类型与作用特点
1、细胞因子的分类
2、细胞因子的作用特点
以生物学作用进行划分的分类
白细胞介素（Interleukin）—— IL-1、IL-2、…… IL-18 干扰素（Interferon）—— IFN-、IFN-、IFN- 肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor）—— TNF- 、 TNF- 集落刺激因子（Colony-stimulating factor）—— M-CSF、G-CSF 转化生长因子（Transforming growth factor）—— TGF-
显示检测结果
靶细胞的选择与培养
1、对所测的细胞因子有特异的敏感性 2、易培养、保存、生物学特性稳定 3、有良好的生长状态
4、种属适配
各类细胞因子检测的常用靶细胞
细胞因子 IL-1 实验系统 D10（M）增殖法 EL-4（M）增殖法 A352（H）增殖抑制法 IL-2 IL-3 CTLL（M）增殖法 KG-1（H）增殖法 IL-4 干扰因素 IL-2、IL-4 IL-4
二、细胞因子受体的检测
细胞因子受体的类型
膜型细胞因子受体
分泌型细胞因子受体
细胞因子受体的检测方法
膜型细胞因子受体的检测
配体检测法
抗体检测法
分泌型细胞因子受体的检测 标记抗体检测法
小结
细胞因子的检测技术发展较快 , 不断有新方法 出现 ,但是基本上都是利用其生物活性或免疫原性。 一方面由于待测生物样本中可能会存在细胞因子抗 体或相关分子、 可溶性细胞因子受体、 巨球蛋白 等干扰因素 , 另一方面 , 细胞因子的作用具有多向 性 ,其产生和作用受其他细胞因子的影响而增强或 抑制 , 每一种检测方法都有其优缺点和使用范围。 要想得到灵敏可靠的结果 , 一定要根据检测要求选 用合适的方法并严格控制测定条件 , 进行标准化的 检测。
细胞因子的检测与应用CBA
a
5
流式细胞术流程
样本收集及处理 制备单细胞悬液
免疫荧光染色
上机检测
数据分析
a
6
流式细胞术检测样本
可检测的样本种类多样
各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组 织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等
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7
流式细胞仪的检测范围
细胞结构
• 细胞大小 • 细胞颗粒度 • 细胞表面积 • 核浆比例 • DNA含量与细胞周
a
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a
37
CBA应用相关中文文献
a
38
CBA特点
• 液相中反应，同时检测多种蛋白 • 操作简单(标本制备和上机检测），省时省力 • 微量样本(5-50ul) • 灵敏度2.8pg/ml • 所有分析只需一组标准曲线 • 避免酶联反应信号放大带来的假阳性 • 更好的线性度和更宽的检测范围(5000pg/ml) • 流式细胞仪和CBA软件自动分析
a
23
传统的ELISA与CBA相比
ELISA
单一 样本量体积大
CBA
多元和同步 Elisa样本体积的1/6
灵敏度低，稳定性差
灵敏度高，稳定性好
每个蛋白分别检测，样本浓度 芯片式集成测定，所需样本浓度低
高，时间长，效率低 酶联放大效应，结果易失真
缩短时间，提高效率 流式荧光定量检测，避免假阳性
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a
19
F L -3H o r -NAI R
BD CBA Flex Set
1 2 3 4 56 78 9
A B C D E F G H I
F L4-H or R ed-A
a
20
CBA Flex Set的分析软件 － FCAP Array Software
细胞因子检测在疾病诊断和治疗中的应用
细胞因子检测在疾病诊断和治疗中的应用细胞因子是一类在人体细胞分泌的小分子信号蛋白，它们在调节和协调免疫、炎症反应等生理过程中起着重要作用。
细胞因子检测利用现代生物技术手段，通过检测体内细胞因子的水平来评估机体的炎症状态、免疫功能及疾病的发展程度，具有重要的临床意义。
本文将重点介绍细胞因子检测在疾病诊断和治疗中的应用。
一、细胞因子检测在疾病诊断中的应用1. 炎症性疾病的诊断：细胞因子检测可以通过检测体液中炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等的水平来判断炎症反应的程度和发展趋势，辅助医生进行疾病的诊断。
例如，在类风湿关节炎的早期诊断中，IL-6和TNF-α的检测可作为评估疾病活动性和预测关节损伤的重要指标。
2. 免疫相关疾病的诊断：细胞因子检测可以帮助诊断免疫相关疾病，如系统性红斑狼疮、银屑病等。
这些疾病具有免疫系统失调的特点，细胞因子的检测可以评估免疫功能的异常程度，并且对于监测治疗效果和预测预后也具有重要价值。
3. 肿瘤的诊断：细胞因子的异常水平与肿瘤的发展和转移密切相关。
常用的肿瘤标志物如癌胚抗原（CEA）、前列腺特异性抗原（PSA）等，都是与细胞因子有关的。
细胞因子检测可以提供肿瘤的相关信息，帮助早期发现肿瘤、评估肿瘤的恶性程度和预测疾病的预后。
二、细胞因子检测在疾病治疗中的应用1. 临床药物疗效评估：细胞因子检测可以作为评估临床药物疗效的重要指标。
例如，抗肿瘤药物治疗过程中，可以通过监测肿瘤坏死因子-α的水平来判断治疗效果，并相应调整治疗方案。
2. 细胞因子治疗：细胞因子检测可以帮助判断某些疾病是否适合进行细胞因子治疗。
例如，在免疫相关疾病如类风湿关节炎、狼疮等的治疗中，通过检测细胞因子水平，可以根据病情调整细胞因子的剂量和治疗方案，提高治疗效果。
3. 个体化治疗策略：细胞因子检测可以为制定个体化治疗策略提供依据。
不同疾病患者的细胞因子水平可能存在差异，通过检测细胞因子，可以为医生提供针对个体患者的治疗建议，提高治疗效果。
临床常用的细胞因子测定方法及临床应用
临床常用的细胞因子测定方法及临床应用临床常用的细胞因子测定方法主要包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、流式细胞术（FACS）和质谱法。
1. 酶联免疫吸附测定（ELISA）：这是一种常用的间接免疫测定方法，通过将待测细胞因子与特异的抗体结合，然后使用酶标记的二抗与抗原-抗体复合物结合，再加入底物，通过底物的酶作用来测定细胞因子的含量。
ELISA具有灵敏度高、特异性强、操作简单等优点，可以快速、准确地检测多种细胞因子。
2. 流式细胞术（FACS）：这是一种通过流式细胞仪检测细胞因子的方法。
通过将待测样本中的细胞与特异的荧光标记抗体结合，再经过流式细胞仪的激光照射和荧光检测系统，可以实时地监测细胞的表面标记物或细胞内的细胞因子含量。
3. 质谱法：这是一种通过质谱仪分析待测样品中细胞因子的方法。
质谱法将待测样品中的细胞因子通过质谱仪进行离子化和分子质量测定，从而得到细胞因子的质量和含量。
质谱法具有高灵敏度、高分辨率等优点，可以准确地分析复杂样品中的细胞因子。
临床应用方面，细胞因子测定方法主要用于以下方面：1. 诊断疾病：细胞因子作为炎症介质，在很多疾病的发生和发展过程中起到重要作用。
通过测定患者血清或组织中细胞因子的含量，可以帮助医生诊断疾病并评估疾病的严重程度。
2. 预测治疗效果：一些疾病的治疗效果与细胞因子的调节相关，通过测定治疗前后患者细胞因子的变化，可以评估治疗的效果和患者的预后。
3. 指导治疗方案：不同人群对同一疾病的治疗反应存在差异，通过分析患者的细胞因子水平，可以为临床医生制定个体化的治疗方案提供参考。
4. 疫苗评价：细胞因子测定方法可用于评价疫苗的免疫效果，包括检测疫苗接种后细胞因子的变化，评估疫苗的免疫保护效果。
总之，细胞因子测定方法在临床应用中具有重要的意义，能够为疾病的诊断、治疗和预后评估提供科学依据。
细胞内细胞因子的检测
细胞内细胞因子的检测细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。
研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。
早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-γ)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难推广，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还不清楚。
活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外，方法为破坏高尔基体，因细胞因子（即各种蛋白）在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。
因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。
近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。
这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
胞内细胞因子染色与传统的检测可溶性蛋白的方法如ELISA相比，具有显著优越性。
该法从单个细胞水平检测内多个细胞因子的同时，还可标记各种细胞表面分化抗原以及活化分子、趋化因子受体和黏附分子等，从而区分表达特定细胞因子的细胞亚群及其表型特征。
使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。
早在1986年，Mosmann等应用Th细胞克隆技术和细胞因子产生的不同，发现小鼠CD4细胞是一个不均一的亚群，可分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
后来在人类的CD4细胞群中也发现了Th1和Th2细胞亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应，在抗胞内病原菌感染中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫有关。
细胞因子检测技术及其应用
4.与癌转移有关的基因组成、识别、定位、性状和调控。
5.新抗癌药筛选、老抗癌药验证及其抗转移癌的作用和特点。
6.中药在癌转移防治上的作用特点。
本项工作自开展到现在已有11个年头。
100多年前有人就把肿瘤与肿瘤病人、肿瘤与模型宿主动物的关系比做“种子与土壤”的关系。
两者之间自然有个适应与否的问题。
对于模型现在称这种(瘤原与宿主)关系是在免疫原性上两者是否相互适应,相互一致。
例如Lewis 肺癌是一个高自发肺转移模型。
1951年它原发于一只C 57BL /6(黑)小鼠,当时成瘤率为100%,有4%消退,病理形态为未分化间变癌。
但这个模型引进我国后转移少见或不见。
原因是宿主变了,在免疫原性上它们不相适应了。
我们选建的上述3个模型的瘤原与宿主动物自然也有这种关系,也需要有高度地相互适应性。
要做到这一点,其必要的工作是:宿主动物保种和瘤原保种。
如果不能及时、切实地做好保种工作,就可能丧失这些模型,使它们象在我国的Lewis 肺癌那样“名存实亡”。
如能遵照国家有关规定结合模型的特殊需要做好保种,完全保留和充分发挥其高自发、双相“肺和浅表淋巴结”转移的特点,就能为国家创造经济效益和社会效益,为我国和世界肿瘤防治工作服务。
细胞因子检测技术及其应用鞠佃文 曹雪涛作者单位:200433上海,第二军医大学免疫学教研室 细胞因子具有极强的生物学活性,可作为药物用于临床许多疾病的治疗中。
细胞因子发挥治疗作用的浓度非常低,治疗指数也比较低,剂量的增加一般都伴随明显的毒副作用。
另一方面,细胞因子在体内具有重要的病理作用。
在感染、炎症、自身免疫病、AIDS 等疾病状态下,有些细胞因子明显增高。
通过检测血清或组织液中的细胞因子含量,可以对诊断和治疗作出评价,具有重要的临床意义。
根据检测原理和手段的不同,细胞因子的检测技术大致分为三类:免疫学方法、生物学方法和分子生物学方法。
细胞因子检测方法一、免疫学检测方法细胞因子作为一种蛋白质抗原,可以特异性与其单克隆抗体结合,利用抗原抗体反应检测细胞因子近年来发展比较快,其方法包括酶联免疫吸附(ELISA )、放射免疫(RIA)、免疫荧光等。
项目二十一 细胞因子检测
项目二十一细胞因子检测一、白细胞介素-2的测定(Determination of interleukin-2)检测IL-2主要有两类方法，一类是生物活性检测，另一类是抗体检测法(或称为免疫分析法)。
生物活性检测法是通过检测IL-2反应敏感细胞对待检样本中IL-2的增殖反应程度对IL-2进行分析，该方法比较敏感，但检测时间长，步骤多，影响因素多，因此结果容易波动。
免疫分析法比较简单、迅速、可靠，通过免疫分析法检测IL-2的方法也有很多，其中应用较多的是采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunoabsobent Assay, ELISA)，这里选取其中较为实用、敏感性及特异性较好的双抗体夹心法加以介绍。
【实验原理】将抗IL-2单抗结合到固相载体上形成固相抗体，然后通过加入待检标本，使标本中的相应抗原IL-2与抗体结合形成免疫复合物，洗涤后加入生物素标记兔抗人IL-2多克隆抗体，使之与免疫复合物中的IL-2抗原反应，再加入亲和素标记辣根过氧化物酶进行反应，最后加底物显色，通过分析酶促反应强度检测标本中IL-2的含量。
【试剂与器材】1．抗体和标记物包被用抗人IL-2单克隆抗体，生物素标记兔抗人IL-2多克隆抗体，亲和素标记辣根过氧化物酶。
2．包被缓冲液0.1mol/L Na2HPO4，用HCl调整pH值至9.0。
3．PBS 80.0g NaCl，11.6g Na2HPO4，2.0g KH2PO4，2.0g KCl，溶解于10L蒸馏水中, 调整pH至7.0。
4．洗涤液含0.05%(V/V)Tween-20的PBS，pH值7.0 。
5．封闭液含10%(V/V)小牛血清或1 % BSA (W/V) 的PBS液。
6．样品稀释液用封闭液加入0.05 %(V/V) Tween-20即可。
7．底物加150mg 2,2-连氮基-二(3-乙基-苯噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)于500ml 0.1mol/L枸橼酸溶液中，充分溶解后用NaOH 调节pH值至4.35，分装后保存于-20℃备用。
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儿科细胞因子与儿科疾病儿科的常见疾病主要分为四大类:呼吸系统感染、消化系统疾病、免疫系统疾病和皮肤系统疾病。
Th1细胞因子主要包括IL-12、TNF-α、TNF-β、IFN-γ等，参与细胞免疫应答，可激活炎症部位的巨噬细胞，增强宿主对病毒及胞内病原体的抵抗力，诱发迟发型超敏反应；Th2细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13等，促进B细胞的激活，介导体液免疫应答，可抑制自身免疫，并协助嗜酸性粒细胞活化及IgG1、IgE的生成。
Th1/Th2互为调节和抑制，Th1/Th2细胞因子平衡紊乱是多种疾病的发生和预后的重要因素。
1.呼吸系统疾病儿童处于生理性免疫功能低下状态，易患呼吸道感染性疾病。
儿童呼吸道感染分为三种：上呼吸道感染、反复呼吸道感染和下呼吸道感染。
下呼吸道感染是对多种呼吸疾病的总称，包括支气管炎、支气管哮喘、肺炎等儿科常见病。
1.1肺炎肺炎是儿科的常见病症，肺炎的发生、发展与病原体数量、毒力以及机体失控的炎症反应有关，Th1/Th2细胞因子失衡在肺炎支原体肺炎的发生发展中起重要作用。
常见的呼吸道病毒为腺病毒(AV)、流感病毒(IFV)、副流感病毒(PIV)及呼吸道合胞病毒(RSV)等，病毒感染的严重程度和病毒的致病力、机体的免疫应答力相关。
免疫系统的激活和细胞因子或炎性介质的产生在炎性反应的激活以及组织损伤机制中起非常重要的作用，呼吸道病毒感染可引起免疫系统和多种炎症反应因子发生紊乱，表现为Th1/Th2细胞因子失衡。
病毒性肺炎急性期患儿血清中IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α水平升高，IL-10、IFN-γ水平降低；经药物治疗有效后，TNF-α水平下降，IL-10、IFN-γ水平升高，Th1/Th2平衡逐渐恢复。
肺炎支原体感染机体后可导致血清IFN-γ和IL-4不同程度的升高，导致Th1/Th2免疫调节失衡,机体出现由Th1为主的细胞免疫向Th2为主的体液免疫转变，早期以Th1应答为主，中后期转变为以Th2应答为主。
肺炎支原体肺炎患儿血清IL-4、IFN-γ水平升高，且与肺功能、气道功能呈负相关，测定血清IL-4、IFN-γ等细胞因子水平可以辅助判断病情严重程度及预后。
临床在治疗支原体肺炎时，适当使用免疫调节剂如抗IL-4单抗等进行干预或非特异性免疫治疗如应用肾上腺皮质激素能促进疾病恢复。
1.2重症肺炎IL-6水平的增高是最早出现的感染指标，IL-6浓度与重症肺炎的严重程度相关。
IL-10能抑制Th1细胞产生IL-2、IL-3、TNF-α等，起着发挥下调炎症反应，拮抗炎性介质的作用，IL-10的分泌缺乏会导致持续的炎症反应和不可逆的组织损伤。
急性期及恢复期重症肺炎患儿的血清IL-10水平明显下降，提示低水平的IL-10会导致Th1/Th2细胞功能失衡，免疫调节失控。
TNF-α在重症肺炎的免疫病理过程中扮演着重要角色，过量的TNF-α可促进炎性反应的失衡，造成局部乃至器官组织的炎症损伤，高水平的TNF-α可反映严重感染的生理病理状态，血清中TNF-α水平越高提示肺炎越严重。
在肺炎的治疗过程中,若促炎因子IL-6、TNF-α水平呈高水平，抑炎因子IL-10呈低水平，说明感染重，病情未控制；反之说明病情趋于好转。
促炎和抑炎细胞因子的平衡对于重症肺炎患儿的转归起着重要作用，动态监测血清IL-6、TNF-α、IL-10等细胞因子水平，可以反映重症肺炎病情发展及治疗效果。
1.3支气管哮喘支气管哮喘是一种以气道炎症、可逆性气道阻塞及气道高反应为特征的免疫变态反应性疾病。
哮喘发病机制与环境、遗传、免疫调控等诸多因素有关，辅助性T淋巴细胞亚群功能紊乱和Th1/Th2细胞因子失衡在哮喘发病中起重要作用。
急性哮喘患者Th1细胞功能抑制、Th2功能亢进；Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ降，Th2型细胞因子IL-4、IL-10增高，且Th1/Th2细胞因子的异常与病情呈正相关。
通过动态观察IL-2、IFN-γ和IL-4、IL-10水平能反映哮喘患者炎症反应情况，评价哮喘发生、发展、治疗效果及转归情况，为临床哮喘防治提供新的思路。
1.4儿童反复呼吸道感染反复呼吸道感染是儿科临床常见疾病,发病主要与免疫功能低下与紊乱、病原微生物感染、不合理应用抗生素致细菌耐药、微量元素缺乏、空气颗粒物质成分变化等有关。
特异性和非特异性免疫功能障碍是反复呼吸道感染的主要因素，其中原发性或继发性T淋巴细胞数目减少功能低下、Th1/Th2细胞因子失衡是导致反复呼吸道感染的主要原因。
患儿血清中IFN-γ水平降低，Th1功能存在异常；Th2细胞介导的体液免疫也表现为降低，IL-10水平降低，导致B细胞的增殖分化和产生免疫球蛋白减少。
经有效治疗后，反复呼吸道感染患儿血清IFN-γ、IL-10水平可显著的回升。
2.消化系统疾病儿童消化系统疾病主要有四种表现形式：厌食、呕吐、腹泻、便秘，其中各类型肠炎尤其是小儿腹泻病发病率最高。
2.1轮状病毒腹泻轮状病毒是临床上常见的病原菌，是婴幼儿重症腹泻的主要病原体之一。
IL-2和IL-10作为重要促炎症细胞因子，在轮状病毒肠炎中发挥着重要作用；轮状病毒肠炎患儿血清IL-6、IL-8、TNF-α及IFN-γ含量明显升高，恢复期TNF-α、IL-8水平下降，检测血清的细胞因子有助于轮状病毒性肠炎患儿的临床诊断，可用于观察临床病情发展的判定及指导药物治疗。
3.免疫缺陷病3.1原发性免疫缺陷病某些原发性免疫缺陷病伴有细胞因子缺乏，如T细胞功能缺陷和联合免疫缺陷病患儿T细胞分泌的细胞因子呈普遍性下降或缺如，治疗这类疾病的方法是干细胞移植;IL-2缺陷病为一少见病，临床表现为反复病毒性感染和易发生恶性肿瘤，重组IL-2替代治疗可减轻感染症状和降低肿瘤发生率；IL-12和IL-12R缺陷病的主要临床表现为难治性结核病和不典型分支杆菌感染，临床上凡抗结核治疗无效、病情进行性恶化者，应考虑IL-12和IL-12R缺陷。
3.2继发性免疫缺陷病继发性免疫缺陷病伴有细胞因子降低，可出现IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ下降,继发性免疫缺陷病细胞因子的变化为非特异性的，治疗原则为治疗原发疾病,AIDS患者血清促炎因子TNF-α、IL-1水平升高，可引起患者长期发热，而且TNF-α还可引起恶液质。
在HIV/AIDS患者在疾病的进展过程中，Th1/Th2细胞平衡会发生从Th1细胞向Th2细胞的漂移，造成了CD4+T细胞功能缺失，是艾滋病AIDS患者免疫状态恶化的一种表现形式。
3.3生理性细胞因子低下新生儿由于免疫细胞未受到抗原制激、免疫功能不成熟，细胞因子如IFN-γ、IL-4、IL-6、TNF-α等均明显低于年长儿和成人，导致新生儿期易感染。
随着抗原的不断接触和刺激，免疫细胞特别是T细胞功能逐渐完善,各类细胞因子也随之达到正常水平。
新生儿Thl类细胞因子一般呈生理性低下，在此时期接触过敏原最易引发过敏性体质，成为日后发生哮喘、过敏性鼻炎或离位性皮炎的基础。
4.儿童免疫系统疾病正常的免疫调控失常和不正常的免疫反应均会损害机体，导致新的疾病，称之为自身免疫性疾病。
常见的自身免疫病有：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺机能亢进、糖尿病、原发性血小板紫癜、自身免疫性溶血性贫血等。
自身免疫性是异常免疫反应引起的炎症，在急性期血清炎症性细胞因子明显增高。
急性期川崎病、急性风湿热、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮患者血清IL-6、IL-1、TNF-α明显增高，炎症性细胞因子的升高表明疾病处于活动期。
一般来讲，器官特异性的自身免疫性疾病是由于Th1类细胞因子亢进所致,如Ⅰ型糖尿病、淋巴细胞性甲状腺炎、免疫性甲状腺功能亢进和减退症等；非器官特异性自身免疫性疾病以Th2类细胞因子亢进为主，对自身免疫性疾病进行Th1/Th2细胞因子检查,可以帮助鉴别疾病、判断疾病活动期、监测预后和指导治疗方案。
4.1川崎病川崎病是一种以全身血管炎为主要病理变化的急性发热出疹性疾病，可发生严重的心血管并发症。
KD患儿免疫系统处于激活状态，多种细胞因子水平存在明显异常,参与KD发生发展的过程。
免疫系统的高度活化及免疫损伤性血管炎是KD的显著特征，免疫系统激活后产生炎性反应，多种细胞因子介导内皮细胞损伤从而导致血管炎。
KD患儿急性期血浆IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平升高，KD患儿并发冠状动脉损害者血浆IL-6水平显著高于无冠状动脉损害者，IL-6的过多表达导致KD患儿对免疫球蛋白产生耐药性。
IL-10可抑制Th1细胞产生IFN-γ、IL-12和TNF-α等细胞因子，激活B细胞并使其增殖分化，从而促进免疫球蛋白的产生。
TNF-α在KD中具有重要作用，使中性粒细胞活化和脱颗粒释放炎症递质，抗TNF-α药物具有一定的临床应用价值。
调节KD患儿免疫功能失衡及细胞因子紊乱，对于提高KD疗效、减少冠状动脉损害等有重要意义。
4.2糖尿病和糖尿病肾病T1DM为自身免疫性疾病；T2DM与自身免疫反应和慢性炎症反应关系密切，淋巴细胞、炎症因子、自身抗体、补体等均参与T2DM患者胰岛细胞的损害过程。
自身免疫反应调节失衡导致胰岛β细胞被自身反应性细胞及其产生的介质破坏是两种糖尿病发病的免疫学机制，其中Th1细胞介导致病性免疫反应，Th2细胞介导保护性免疫反应。
Th1型细胞因子促进自身反应性T细胞在胰腺的浸润并增强针对谷氨酸脱羧酶的自身免疫反应，导致β细胞破坏。
临床数据表明IL-6、IL-17、IL-23等多种促炎细胞因子在T2DM患者体内均升高。
4.3免疫性血小板减少症免疫性血小板减少症是一种由体液免疫和细胞免疫异常导致的以血小板破坏增多、生成减少而出现的皮肤、黏膜、内脏等出血的自身免疫性疾病。
免疫性血小板减少症的发病与T淋巴细胞、自然杀伤细胞、细胞因子、细胞程序性死亡、氧化应激、感染、妊娠和药物等因素密切相关。
其中细胞因子对于免疫细胞间相互作用、生长和分化有重要调节作用。
免疫性血小板减少症患者血清的细胞因子表达紊乱，尤其是IL-2、IL-3及TNF-α水平的改变与免疫性血小板减少症的发病机制有关，临床数据表明免疫性血小板减少症患者Th1细胞因子比例升高，机体自身反应性细胞免疫功能亢进。
4.4幼年特发性关节炎幼年特发性关节炎是一种异质性和多因素导致的自身免疫性疾病，全身型幼年特发性关节炎是幼年特发性关节炎的一种特殊类型，可发生于任何年龄，以5岁以下略多见。
全身型幼年特发性关节炎是一种自身炎症综合征，固有免疫功能异常可能是其致病原因。
临床数据表明全身型幼年特发性关节炎患儿血清IL-6水平显著升高，持续高水平的IL-6不仅与关节受损程度及骨质疏松有关，还与全身型幼年特发性关节炎患儿发热、血小板增高、贫血及生长迟缓等临床表现相关。